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문제 정의
- 본 연구에서는 폐자원으로 인식되는 마늘대를 활용하기 위해 열수, 70% 에탄올로 추출하여 항산화 효과를 측정하고 lipopolysaccharide로 유도된 대식세포를 이용하여 염증성 사이토카인 및 iNOS, COX-2 발현에 미치는 영향을 연구하고자 하였다. 용매추출물별 효능을 확인하여 농산 부산물인 마늘대의 활용가치를 올리고 기능성 소재로서의 발굴을 위한 기본적인 자료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 마늘의 부산물로 발생하는 마늘대의 항산화 및 항염증 효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증을 유도한 Raw 264.7 세포에 대한 열수추출물(ASSW)과 70% 에탄올 추출물(ASSE)의 효과를 살펴보았다. ASSW의 폴리페놀 함량은 37.
제안 방법
- 전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 DPPH를 ethanol에 녹여 용액을 준비하고, ASSW와 ASSE를 각각 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL의 농도로 제조하여 각 농도별 시료 120 μL에 DPPH 60 μL를 첨가한 후 96 well plate에 혼합하여 실온에서 빛을 차단하고 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Spectra max 190, Molecular devices, Sunnyvale, ,CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 free radical 소거활성을 측정하였다.
- 마늘대 10, 25, 50, 100, 250, 400 μg/mL 농도별로 24 시간 동안 처리하였다.
- 본 실험에 사용한 마늘대는 국내산을 구입하여 재료로 사용하였다. 열수추출물(ASSW)의 용매는 시료 중량의 10배 양을 가하여 85℃에서 4시간씩 3회 반복 추출하였고, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 시료 중량의 10배의 용매를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 여과 및 농축 후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
- Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma Chemical Co., Ltd., St. Louis, Missouri, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2 × 106개의 cell을 confluence가 80%일 때, 1× PBS로 2번 washing한 후 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 다음 LPS(lipopolysacchride) 10 μg/mL을 control 군을 뺀 모든 well에다 넣어서 자극시켰다.
- 세포배양액 내의 IL-6, TNF-α, IL-1β, PGE2 cytokine의 분비량을 ELISA kit(Mouse ELISA set, R&D Systems, Minneapolis, MN 55413, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 1차 항체(iNOS, COX-2)를 희석하여 2시간 동안 반응한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 membrane을 HRP가 중합된 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 60분 동안 반응시켰다. 3회 washing 한 뒤 Western Imaging system (CAS-400SM, Davinch-K, Seoul, Korea) 기기를 이용하여 iNOS, COX-2 밴드 확인 및 정량을 실시하였다.
- 마늘대 열수추출물과 에탄올추출물 모두 250 μg/mL 이상 시료농도 조건에서 세포독성을 나타내는 것을 확인하였으며, 각 추출물의 항염증 효능에 대한 상대적 비교를 위하여 세포독성을 나타내지 않은 100 μg/mL 농도를 시험시료 농도조건으로 설정하였다.
- MTT assay 시험법을 통해 macrophage cells 에 대한 마늘대 추출물의 농도조건 별 세포독성을 확인하였다(Fig. 3). 마늘대 열수추출물과 에탄올추출물 모두 250 μg/mL 이상 시료농도 조건에서 세포독성을 나타내는 것을 확인하였으며, 각 추출물의 항염증 효능에 대한 상대적 비교를 위하여 세포독성을 나타내지 않은 100 μg/mL 농도를 시험시료 농도조건으로 설정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 마늘대는 국내산을 구입하여 재료로 사용하였다. 열수추출물(ASSW)의 용매는 시료 중량의 10배 양을 가하여 85℃에서 4시간씩 3회 반복 추출하였고, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 시료 중량의 10배의 용매를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- 본 실험에 이용한 Raw 264.7 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator(VS-9160GC, Hanbaek Scientific Co., Daejeon, Korea)에 적응시켜 계대배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성(**p<0.05,*p<0.01)검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 Turkey test로 다중비교를 실시하였다.
이론/모형
- 총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법(16)으로 측정하였으며, 시료를 10 mg/mL 농도로 증류수에 녹인 다음 0.2 mL Folin Ciocalteu reagent를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다. 3분 후 Na2CO3 포화용액 0.
- 세포 독성 측정은 Carmichael(17)의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.
- 또한 COX-2는 염증조직, 악성 종양조직에서 정상 세포에 비해 많은 양의 프로스타글란딘의 생성을 유도하여 혈관 생성을 촉진하고 세포의 증식을 도울 뿐 아니라 면역 능력을 억제함으로써 암세포 성장에 좋은 환경을 제공하여 COX-2의 발현은 또 다른 질병의 병원성과 직접적인 연관성을 시사하고 있다(41). ASSW, ASSE의 iNOS, COX-2 protein 발현에 대한 효과를 알아보기 위해 western blot을 수행하였다. 그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 열수 추출물의 iNOS, COX-2 발현은 100 μg/mL의 농도구간 까지 일정하게 나타냈으며(Fig.
성능/효과
- ASSW, ASSE 모두에서 농도 의존적으로 증가하였으며 1,000 μ g/mL에서 ASSW의 경우 44%, ASSE의 경우 50.83%를 나타냈다.
- Tannic acid를 지표물질로 하여 작성한 표준곡선에 의해 마늘대의 폴리페놀 함량을 측정하여 Table 1와 같이 나타내었다. 마늘대 열수추출물(ASSW)은 37.08 mg/g, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 44.7 mg/g 으로 열수추출물보다 에탄올추출물에서 폴리페놀 함량이 더 높은 것으로 나타났다. 약용식물 추출물의 폴리페놀 함량 분석(23)에서 나온 갈근(5.
- 7 mg/g 으로 열수추출물보다 에탄올추출물에서 폴리페놀 함량이 더 높은 것으로 나타났다. 약용식물 추출물의 폴리페놀 함량 분석(23)에서 나온 갈근(5.50 mg/g), 갈화(6.46 mg/g), 감국(2.48 mg/g) 등을 비교하였을 때 ASSW, ASSE의 폴리페놀 함량이 매우 높은 것을 확인 할 수 있었다.
- 모든 추출물에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며 1,000 μg/mL에서 ASSW의 경우 96.85%, ASSE의 경우 97.79%를 나타내었다.
- LPS로 유도된 Raw 264.7 Cells에 마늘대추출물 농도별(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 상등액속에 있는 NO의 양을 측정하였고, 25 μg/mL부터 NO 생성량이 유의적으로 줄어 100 μg/mL에서 ASSW는 약 18% ASSE의 경우는 약 23%의 저해효과를 나타냈다.
- 94%의 소거능을 나타내었으며, ASSW, ASSE가 1,000 μg/mL에서 Vit.C의 농도가 50 mg/mL일 때의 소거능과 비슷한 항산화력을 나타낸다는 것을 확인하였다.
- 7 Cells에 마늘대추출물 농도별(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 상등액속에 있는 NO의 양을 측정하였고, 25 μg/mL부터 NO 생성량이 유의적으로 줄어 100 μg/mL에서 ASSW는 약 18% ASSE의 경우는 약 23%의 저해효과를 나타냈다. ASSW보다 ASSE에서 NO 생성 억제 효과가 조금더 우수함을 확인함으로써 ASSE에서 iNOS 효소억제능이 ASSW보다 높을 것으로 사료된다(Fig. 4).
- 본 연구에서 ASSW, ASSE는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 각각 IL-1β는 100 μg/mL의 농도에서, IL-6는 100 μg/mL의 농도에서, TNF-α 는 100 μg/mL의 농도에서 유의한 감소를 나타냈다.
- ASSW의 폴리페놀 함량은 37.08±1.51 mg(TAE)/g, ASSE의 폴리페놀 함량은 44.7±1.32 mg(TAE)/g 이 함유되어있음을 확인하였다.
- 그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 열수 추출물의 iNOS, COX-2 발현은 100 μg/mL의 농도구간 까지 일정하게 나타냈으며(Fig. 6), 70% EtOH의 추출물에서 iNOS의 발현은 100 μg/mL 농도구간에서 현저하게 억제됨을 확인하였고, COX-2의 발현은 농도 의존적으로 저하되어 특히 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도에서 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 7)
- PGE2는 ASSW 100 μg/mL의 농도 구간에서 발현량이 현저하게 감소하였으며, ASSE는 농도의존적으로 발현량이 감소되어 100 μg/mL에서 33.87%의 저해율을 나타내었다(Fig. 5).
- 5). 결과적으로 ASSE가 ASSW보다 염증 관련 사이토카인의 생성 억제가 높다는 것을 알 수 있었으며, 다른 염증 세포들의 이주를 비롯하여 활성과 분화도 감소시킬 수 있음을 추정할 수 있었다.
- C의 50 μg/mL의 항산화능이 있다는 것이 확인되었고, ABTS+의 경우 500 μg/mL 이상부터 대조군인 Vit.C와 비슷한 효과를 나타냄으로서 ASSW, ASSE 모두 항산화능이 있다는 것을 확인하였다. MTT측정으로 인해 세포 독성을 가지지 않았던 농도대(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)에서 염증 억제 효과를 살펴보기 위해 NO를 측정한 결과 ASSW, ASSE 모두 25 μg/mL에서부터 유의적으로 분비량이 감소함을 확인하였으며 특히 100 μg/mL의 농도에서 약 18%, 23%의 억제 효과를 보였다.
- MTT측정으로 인해 세포 독성을 가지지 않았던 농도대(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)에서 염증 억제 효과를 살펴보기 위해 NO를 측정한 결과 ASSW, ASSE 모두 25 μg/mL에서부터 유의적으로 분비량이 감소함을 확인하였으며 특히 100 μg/mL의 농도에서 약 18%, 23%의 억제 효과를 보였다.
- 또한 대식세포의 염증성 cytokine인 IL-6, TNF-α, IL-1β 및 PGE2의 분비량을 첨가 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다.
- 특히 PGE2에 대해 ASSW, ASSE 100 μg/mL의 농도에서 약 55%, 60%의 감소 효과를 보였다.
- ASSW의 iNOS, COX-2의 발현 저해효과는 나타내지 못하였지만, ASSE는 100 μg/mL의 농도에서 iNOS의 발현량이 현저하게 억제됨을 확인하였고, COX-2의 경우 농도 의존적으로 저하되어 특히 50 μg/mL, 100μg/mL의 구간에서 단백질 발현 저해효과가 있음을 확인하였다.
후속연구
- 본 연구에서는 폐자원으로 인식되는 마늘대를 활용하기 위해 열수, 70% 에탄올로 추출하여 항산화 효과를 측정하고 lipopolysaccharide로 유도된 대식세포를 이용하여 염증성 사이토카인 및 iNOS, COX-2 발현에 미치는 영향을 연구하고자 하였다. 용매추출물별 효능을 확인하여 농산 부산물인 마늘대의 활용가치를 올리고 기능성 소재로서의 발굴을 위한 기본적인 자료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 83%를 나타냈다. 기능성 소재로 사용시 ASSW보다 ASSE에서 약간 더 높은 항산화 효과도 기대할 수 있을 것으로 보인다.
- ASSW의 iNOS, COX-2의 발현 저해효과는 나타내지 못하였지만, ASSE는 100 μg/mL의 농도에서 iNOS의 발현량이 현저하게 억제됨을 확인하였고, COX-2의 경우 농도 의존적으로 저하되어 특히 50 μg/mL, 100μg/mL의 구간에서 단백질 발현 저해효과가 있음을 확인하였다. 이를 통해 ASSW, ASSE 모두 항산화 효과와 항염증 효과가 있음을 확인하였으며, ASSW 보다 ASSE에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 ROS에 의해 유발되는 염증을 억제시켜주는 소재가 될수있을 것이라 예상된다.
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