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문제 정의
- V. alginolyticus-LAMP의 특이적 검출을 위하여 반응 최적 온도를 확인하고자 하였다. 반응액의 조성은 20 pM F3와 B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genomic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment (New England biolabs, Berverly, MA), 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI (pH8.
- LAMP 는 2사슬 DNA, 4개의 primer, DNA polymerase 기질 등을 동일 용기에 넣어 일정온도(섭씨 약 65℃) 하에서 증폭에서 검출까지 원스텝으로 실시할 수 있다[8]. 따라서 본 연구에서는 신속하고 높은 정확성 및 간편성을 갖춘 분자기법 중 하나인 LAMP를 이용하여 해산 어류 양식어종 중 가장 많은 비중을 차지하는 넙치의 세균성 질병인 Vibrio alginolyticus 신속진단법을 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 025 ml의 반응액을 조성하였다[7]. 95℃에서 5분간 해리 후, Bst DNA polymerase large fragment를 첨가하여 반응액의 polymerization 시간을 100분, 80분, 60분, 40분, 20분, 0분으로 조절하였다(Fig. 4). 증폭 된 산물은 1× TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.
- LAMP의 FIP primer sequence는 loop를 형성하는 부위인 TTTT spacer로 합하여 제작되었다. BIP primer도 마찬가지로 V. alginolyticus sequence의 상보적 염기서열을 sequence의 TTTT spacer 부위로 합하여 제작하였다. 또한 F3과 B3 primer는 inner primer의 바깥쪽으로 각각 위치하도록 설계하였다.
- 다음 DNA 변형 합성을 1시간 동안 진행시키고, 80℃에서 10분간 반응시켜 종료하였다. DNA 변형 합성의 최적 온도 측정은 45.0~70.0℃ 로 지정하여 각각의 등온 조건하에 실시하였다(Fig. 3). 각 LAMP 반응이 끝난 후, 증폭 산물들은 1× TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.
- LAMP 분석을 위해 Vibrio alginolyticus의 sigma 인자인 rpos gene (Genbank accession number: FJ358498.1)을 template sequence로 사용하여 LAMP primer designing software 인 primer Explorer (https://www.primerexplorer.jp/lamp3.0.0/ index.html)를 이용하여 V. alginolyticus 특이 LAMP용 primer 를 디자인 하였다[9]. 4개로 구성되어진 primer sete 대상 sequence의 특정 6개의 영역을 인지하는 outer primer와 inner primer로 이루어져 있다.
- 6). MgSO4의 각 반응액에 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM의 MgSO4를 첨가하여 LAMP를 수행하고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다. 그 결과, 2 mM에서 6 mM일때 DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
- PCR primer는 V. alginolyticus 표준 균주의 rpos 유전자 Sequence의 서열을 이용하여 제작하였다(Fig. 2). PCR을 수행하기 위해 primer는 각각 20 pM과 AccuPower PCR premix (1 U Taq DNA polymerase, 250 μm dNTP, 10 mM Tris-HCI, 40 mM KCI, 1.
- 2). PCR을 수행하기 위해 primer는 각각 20 pM과 AccuPower PCR premix (1 U Taq DNA polymerase, 250 μm dNTP, 10 mM Tris-HCI, 40 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, stabilizer and tracking dye : Bioneer., USA), template genomic DNA genomic DNA, 총 볼륨 0.02 ml 반응액을 조성하였다[7]. initial denature 94℃에서 5분, denature 94℃ 30초, annealing 50℃ 30초, extension 72℃ 1분으로 총 30 cycle로 반응 시킨 후 last extension 72℃에서 5분간 진행시켰다[9].
- V. alginolyticus-LAMP의 빠른 진단을 위해 검출에 필요한최소 반응 시간을 확인하였다. 조성은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genomic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI(pH 8.
- V. alginolyticus-LAMP의 최적 반응액 조건을 확인하였다. dNTP의 농도는 각각 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 600 mM을 첨가하여 조성함으로써 최적 반응 조건을 확인하였고, Betaine 경우에는 0 M, 0.
- V. alginolyticus-LAMP의 최적 반응조건을 확립하기 위하여 dNTP, MgSO4, betaine, Bst DNA polymerase의 최적 농도를 구하였다. dNTP의 최적 농도를 확립하기 위하여 각 반응액에 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM의 dNTP 를 첨가하여 LAMP를 수행하였고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다.
- V. alginolyticus를 사용하여 MB에서 30℃에서 48시간 배양한 배양액을 연속적으로 희석하여 1.0×101~108 cfu/ml의 농도로 조정하였다. 각 배양액과 희석액에서 1 ml을 취하여 DNA 를 분리하고 LAMP와 PCR법을 수행하여 검출 한계 값을 비교하였다[7].
- betaine의 최적 농도 확립을 위하여 각각 0.0 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.4 M을 첨가하여 LAMP를 수행하였다. 그 결과 농도가 짙을수록 ladder pattern이 다양해지는 것을 확인할 수 있었다.
- alginolyticus-LAMP의 최적 반응액 조건을 확인하였다. dNTP의 농도는 각각 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 600 mM을 첨가하여 조성함으로써 최적 반응 조건을 확인하였고, Betaine 경우에는 0 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.4 M을 첨가하여 조성하였다. 또한 Mg++의 농도는 0 mM, 4 mM, 8 mM, 12 mM, 16 mM, 18 mM을 조성하였고 Bst DNA polymerase는 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 최적 반응 조건을 확립하였다[7].
- alginolyticus-LAMP의 최적 반응조건을 확립하기 위하여 dNTP, MgSO4, betaine, Bst DNA polymerase의 최적 농도를 구하였다. dNTP의 최적 농도를 확립하기 위하여 각 반응액에 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM의 dNTP 를 첨가하여 LAMP를 수행하였고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다. 그 결과 dNTP의 양이 400 mM에서 500 mM일때, DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 3). 각 LAMP 반응이 끝난 후, 증폭 산물들은 1× TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용한 전기영동 50 V에서 40분간 진행시킨 뒤, UV illumination상에서 관찰하였다.
- 0×101~108 cfu/ml의 농도로 조정하였다. 각 배양액과 희석액에서 1 ml을 취하여 DNA 를 분리하고 LAMP와 PCR법을 수행하여 검출 한계 값을 비교하였다[7].
- 본 실험에서는 Vibro alginolyticus KCCM 40513과 Vibrio campbellii KCCM 40864, Vibrio furnisii KCCM 41679, Vibrio icthyoenteri KCCM 40870, Vibrio fluvialis KCCM 40827, Vibrio harvey KCCM 40866, Vibrio vulnificus KCCM 41665, Vibrio cholerae KCCM 41626을 사용하였다. 각각의 균주는 MB (Marine Broth, Difco., USA)와 TSB (Tryptic Soy Broth, Difco., USA)에 배양조건에 따라 24시간 배양하였다.
- 각각의 균주는 MB와 TSB를 사용하여 배양조건에 따라 Vibrio alginolyticus 외 8균주의 DNA는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer., USA)를 사용하여 추출하였다. 각각의 균주는 MB와 TSB를 사용하여 배양 조건에 따라서 24시간 동안 배양시켰다.
- 9). 따라서 LAMP를 위한 최적 반응 조건으로 총 25 μl를 기준으로 각각 400 μM dNTP, 4 mM MgSO4, 1 M beatine, 8 U Bst DNA polymerase를 LAMP 표준 조건으로 결정하였다.
- initial denature 94℃에서 5분, denature 94℃ 30초, annealing 50℃ 30초, extension 72℃ 1분으로 총 30 cycle로 반응 시킨 후 last extension 72℃에서 5분간 진행시켰다[9]. 이후 산물은 1×TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동을 실시하여 UV illumination상에서 관찰하였다.
- alginolyticus-LAMP의 빠른 진단을 위해 검출에 필요한최소 반응 시간을 확인하였다. 조성은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genomic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI(pH 8.8), 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.4 % Triton X - 100, New England biolabs, Beverly, MA), 400 μm dNTP, 1 M Betaine, 6 mM MgSO4, Distilled water (negative control)로 총 0.025 ml의 반응액을 조성하였다[7]. 95℃에서 5분간 해리 후, Bst DNA polymerase large fragment를 첨가하여 반응액의 polymerization 시간을 100분, 80분, 60분, 40분, 20분, 0분으로 조절하였다(Fig.
- 4). 증폭 된 산물은 1× TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용한 전기영동 50 V에서 40분간 진행시킨 뒤, UV illumination 상에서 관찰하였다.
- 최적 반응 온도 확립을 위하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃에서 1시간 동안 각기 등온 조건하에 LAMP를 수행하였으며, 각 반응들이 끝나고 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 55℃~65℃의 범위에서 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 최적 조건 확립 후 LAMP 검출법의 민감도는 V. alginolyticus 배양액을 연속적으로 희석시켜 1.0×101~1.0×108 CFU/ml 의 농도로 조정하여 Bioneer사 Genomic DNA Extraction Kit 로 DNA을 추출하여 LAMP와 PCR법의 검출 한계 값을 비교하였다. LAMP 검출 한계 측정 결과 1.
- 최종적으로 최적 반응 온도 63 C, 반응 시간 80분, dNTP 400 uM, MgSO4 4 mM, betaine 1.0 M, 8 U Bst DNA polymerase을 최적 조건으로 결정하였다. 최적 조건 확립 후 LAMP 검출법을 적용한 민감도와 특이도 실험결과를 살펴보면 V.
대상 데이터
- 본 실험에서는 Vibro alginolyticus KCCM 40513과 Vibrio campbellii KCCM 40864, Vibrio furnisii KCCM 41679, Vibrio icthyoenteri KCCM 40870, Vibrio fluvialis KCCM 40827, Vibrio harvey KCCM 40866, Vibrio vulnificus KCCM 41665, Vibrio cholerae KCCM 41626을 사용하였다. 각각의 균주는 MB (Marine Broth, Difco.
- 실험에 사용된 표준 균주는 한국미생물보존센터 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양 받았다. 본 실험에서는 Vibro alginolyticus KCCM 40513과 Vibrio campbellii KCCM 40864, Vibrio furnisii KCCM 41679, Vibrio icthyoenteri KCCM 40870, Vibrio fluvialis KCCM 40827, Vibrio harvey KCCM 40866, Vibrio vulnificus KCCM 41665, Vibrio cholerae KCCM 41626을 사용하였다.
이론/모형
- 이러한 병원체는 수산 양식 발전에 있어 해를 끼치고 있으며, 생물공학적 지식이 부족한 양식 어민들에게 있어 난해한 점이 많다. 따라서, 양식 어민들이 쉽게 적용할 수 있도록 감수성 및 특이성을 지닌 분자 진단학적 방법인 Loop-medi-ated isothermal amplification(LAMP)를 접목시켰다. LAMP 는 2사슬 DNA, 4개의 primer, DNA polymerase 기질 등을 동일 용기에 넣어 일정온도(섭씨 약 65℃) 하에서 증폭에서 검출까지 원스텝으로 실시할 수 있다[8].
- Bst DNA polymerase는 기존의 중합효소 연쇄반응에 사용 되어지는 Taq DNA polymerase와는 달리 5'-3' exonuclease의 성격을 갖고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 접합 및 신장을 수행한다[9]. 본 연구에서는 V. alginolyticus의 진단 방법으로 LAMP법을 사용하였다. 최적 반응 온도 결과에서는 55~65℃ 의 범위에서 신장되는 것을 확인하였다.
성능/효과
- 0×108 CFU/ml 의 농도로 조정하여 Bioneer사 Genomic DNA Extraction Kit 로 DNA을 추출하여 LAMP와 PCR법의 검출 한계 값을 비교하였다. LAMP 검출 한계 측정 결과 1.0×101 CFU/ml 까지 LAMP를 통해 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 일반 PCR 의 경우 1.
- alginolyticus 만 종 특이적인 검출이 되어 특이도가 높은 검출법임을 알 수 있었다. LAMP 검출법과 일반 PCR 법의 민감도를 비교해 본 결과 LAMP 검출법의 V. alginolyticus 검출 한계는 101 CFU/ml이었으나 일반 PCR의 경우 102 CFU/ml까지 검출 한 계를 갖기에 LAMP 검출법이 일반 PCR법 보다 더 높은 검출 한계를 가지며 민감도가 100배 정도 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 소요 시간에서 PCR법은 3시간 이상 소요되지만 LAMP법은 2시간 이내에 신속한 검출이 가능하였다
- LAMP의 최단 반응 시간을 측정하기 위하여 Bst DNA polymerase를 첨가하여 63℃에서 각각 반응액의 polymerization 시간을 100분, 80분, 60분, 40분, 20분, 0분간 반응 시킨 뒤, 전기영동을 통해 확인하였고 그 결과 최소 40분 이상의 반응 뒤에 전기영동을 통하여 DNA 신장을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- dNTP의 최적 농도를 확립하기 위하여 각 반응액에 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM의 dNTP 를 첨가하여 LAMP를 수행하였고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다. 그 결과 dNTP의 양이 400 mM에서 500 mM일때, DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). MgSO4의 각 반응액에 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM의 MgSO4를 첨가하여 LAMP를 수행하고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다.
- 4 M을 첨가하여 LAMP를 수행하였다. 그 결과 농도가 짙을수록 ladder pattern이 다양해지는 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 1.
- MgSO4의 각 반응액에 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM의 MgSO4를 첨가하여 LAMP를 수행하고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다. 그 결과, 2 mM에서 6 mM일때 DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 이는 과량의 MgSO4는 LAMP 반응을 저해한다는 것을 확인할 수 있었고 최종적인 농도를 4 mM로 결정하였다(Fig.
- 각 반응들이 끝나고 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 55℃~65℃의 범위에서 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). LAMP 반응 산물은 전기영동상에서 몇몇의 각기 다른 크기의 DNA band로 나타나는데, LAMP 산물이 몇몇의 in-verted-repeat 구조를 구성하기 때문이다[9].
- alginolyticus 균주는 양성반응을 보였으나, 음성 지표균은 모두 음성반응을 나타내었다. 따라서 LAMP 검출법의 종 특이적인 밴드가 검출되어 특이도가 높은 검출법임을 알 수 있었다(Fig. 11).
- 10). 따라서, LAMP 검출법이 일반 PCR법 보다 더 높은 검출한계를 가지며 민감도가 100배 정도 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서, 본 연구에서 개발한 LAMP 검출법이 다른 분자생물학적 검출법보다 특이도 및 민감도가 매우 높고 신속하고 간편한 진단법으로 실용적이며 잠재적인 가치가 있다고 사료되어진다.
- alginolyticus 표준 균주와 Vibrio종 7개를 사용해 LAMP 검출법의 특이도를 확인하였다. 전기영동을 통하여 확인한 결과, V. alginolyticus 균주는 양성반응을 보였으나, 음성 지표균은 모두 음성반응을 나타내었다. 따라서 LAMP 검출법의 종 특이적인 밴드가 검출되어 특이도가 높은 검출법임을 알 수 있었다(Fig.
- 최적 반응 온도 결과에서는 55~65℃ 의 범위에서 신장되는 것을 확인하였다. 최단 반응 시간을 측 정하기 위해 100분~0분까지 반응 시간을 두고 반응시킨 결과 40분 이상의 반응 뒤에 LAMP 특이 pattern을 확인할 수 있었다. 최적 반응액 조성에서 dNTP 반응 조건에서는 400 uM에서 500 uM일 때, DNA 신장이 가장 잘 이루어 졌으며, MgSO농도에서는 2 mM에서 6 mM 일 때, betaine 최적 농도는 1.
- alginolyticus의 진단 방법으로 LAMP법을 사용하였다. 최적 반응 온도 결과에서는 55~65℃ 의 범위에서 신장되는 것을 확인하였다. 최단 반응 시간을 측 정하기 위해 100분~0분까지 반응 시간을 두고 반응시킨 결과 40분 이상의 반응 뒤에 LAMP 특이 pattern을 확인할 수 있었다.
- 최단 반응 시간을 측 정하기 위해 100분~0분까지 반응 시간을 두고 반응시킨 결과 40분 이상의 반응 뒤에 LAMP 특이 pattern을 확인할 수 있었다. 최적 반응액 조성에서 dNTP 반응 조건에서는 400 uM에서 500 uM일 때, DNA 신장이 가장 잘 이루어 졌으며, MgSO농도에서는 2 mM에서 6 mM 일 때, betaine 최적 농도는 1.0 M, Bst DNA polymerase의 최적농도는 8 U으로 결정되었다.
- 0 M, 8 U Bst DNA polymerase을 최적 조건으로 결정하였다. 최적 조건 확립 후 LAMP 검출법을 적용한 민감도와 특이도 실험결과를 살펴보면 V. alginolyticus와 Vibrio 종 7개 비교 실험한 결과 V. alginolyticus 만 종 특이적인 검출이 되어 특이도가 높은 검출법임을 알 수 있었다. LAMP 검출법과 일반 PCR 법의 민감도를 비교해 본 결과 LAMP 검출법의 V.
- 최적 조건 확립 후 LAMP 검출법을 특이도 V. alginolyticus 표준 균주와 Vibrio종 7개를 사용해 LAMP 검출법의 특이도를 확인하였다. 전기영동을 통하여 확인한 결과, V.
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