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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 파스나 크림제형에 함유되어 있는 캄파, 멘톨, 메틸 살리실산 성분을 GC를 이용하여 동시에 분석할 수 있는 방법을 확립하여 의약품에 적용하고자 하였다.
제안 방법
- GC를 이용해 파스제의 주성분의 물리화학적 성질이 비슷하므로 승온 프로그램을 이용하여 가장 적합한 조건을 확립하였다. 즉 주입구의 온도를 220 ℃로, 검출기는 불꽃이온화검출기를 이용해 250 ℃의 온도로 유지하였다.
- GC를 통한 분석법의 타당성은 특이성, 직선성, 검출한계와 정량한계를 이용하여 검토하였다[7-9].
- 각각의 표준원액을 캄파와 멘톨은 0.1 ㎖, 메틸살리실산은 0.2 ㎖을 취한 후 정확히 10 ㎖로 메탄올을 채워 100, 100 및 200 μg/㎖으로 제조하였다.
- 15 및 75 μg/㎖의 세가지 농도 범위에서 각각 6회 측정하여 정확성을 측정하였으며 정밀성은 동일한 농도범위를 가지고 상대표준편차(% RSD)를 이용해 산출하였다. 또한 3일 동안 하루에 실험을 6회 실시하여 일내 재현성을 구현하고 연속으로 3일간 실험을 행하여 일간 재현성을 측정하였다.
- 메틸살리실산, 멘톨, 캄파 표준품을 각각 100, 100 및 200 ㎎씩 정밀히 달아 메탄올에 녹여 정확히 10 ㎖로 하여 10000 μg/㎖으로 하여 이 용액을 표준원액으로 하였다.
- 정확성과 정밀성은 미리 결정되어진 정량한계의 2배농도, 검량선 작성 시 최고농도의 70-80% 농도 및 이들 두가지 농도의 중간농도를 제조하여 측정하였다. 즉 메틸살리실산, 멘톨 및 캄파를 각각 9.
- 즉 메틸살리실산, 멘톨 및 캄파를 각각 9.99, 79.99 및 150, 10.29, 42.64 및 75 그리고 9.30, 42.15 및 75 μg/㎖의 세가지 농도 범위에서 각각 6회 측정하여 정확성을 측정하였으며 정밀성은 동일한 농도범위를 가지고 상대표준편차(% RSD)를 이용해 산출하였다.
- 특이성은 시료 내 다른 물질의 공존 시 해당 분석물질을 분리하고 정량하는 분석 능력으로서 같은 주성분을 가진 안티푸라민과 멘덤 쿨 로오션에 각각 기지농도의 메틸살리실산(200 ㎍/㎖), 멘톨(100 ㎍/㎖) 그리고 캄파 (100 ㎍/㎖)을 섞어 정량적으로 늘어나는지의 여부를 확인하였다. 즉 적당량의 안티푸라민과 멘덤쿨 로오션을 취하여 메틸 살리실산(100 ㎍/㎖), 멘톨(50 ㎍/㎖) 그리고 캄파(50 ㎍/㎖)의 농도가 되도록 메탄올을 가하거나 기지 농도의 표준품 용액을 가하여 15초간 vortexing한다음 syringe filter로 여과하여 1 ㎕를 GC에 주입하여 검토하였다.
- 캄파와 멘톨은 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 및 1.5625 μg/㎖으로, 메틸살리실산은 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 μg/㎖의 농도로 계열 희석하여 각 농도별 표준액에 대하여 분석조건에 의한 피크 면적 비를 구하여 검량선을 작성하였고, 검량선으로부터 직선식의 상관계수 (기준: R2=0.99이상)를 구하여 직선성을 검토 하였고, 3번 반복 실험하여 평가하였다.
- 타당성이 검증된 분석방법을 이용하여 안티푸라민과 멘덤쿨 로오션 적당량을 취하여 메탄올을 가해 희석하여 15초간 vortexing한 다음 syringe filter로 여과하여 1㎕를 GC에 주입하여 메틸살리실산, 멘톨 및 캄파의 양을 3회씩 검토하였다.
- 특이성은 시료 내 다른 물질의 공존 시 해당 분석물질을 분리하고 정량하는 분석 능력으로서 같은 주성분을 가진 안티푸라민과 멘덤 쿨 로오션에 각각 기지농도의 메틸살리실산(200 ㎍/㎖), 멘톨(100 ㎍/㎖) 그리고 캄파 (100 ㎍/㎖)을 섞어 정량적으로 늘어나는지의 여부를 확인하였다. 즉 적당량의 안티푸라민과 멘덤쿨 로오션을 취하여 메틸 살리실산(100 ㎍/㎖), 멘톨(50 ㎍/㎖) 그리고 캄파(50 ㎍/㎖)의 농도가 되도록 메탄올을 가하거나 기지 농도의 표준품 용액을 가하여 15초간 vortexing한다음 syringe filter로 여과하여 1 ㎕를 GC에 주입하여 검토하였다.
- 특이성은 시료 내 다른 물질의 공존 시 해당 분석물질을 분리하고 정량하는 분석 능력으로서 검체를 전처리 하여 GC로 분석하였을 때 얻어진 멘톨, 캄파 및 메틸 살리실산의 크로마토그램은 그림 3, 4, 5, 6 및 7과 같았다.
- 110분이었다[표 2]. 특히 표준액과 다르게 시판되는 제품에는 주성분 이외 다수의 부형제가 첨가되어 있기 때문에 standard의 승온법과 다르게 290℃까지 승온하여 부형제가 GC 내 컬럼에 남아있지 않도록 하였다.
- 파스나 크림제형에 함유되어 있는 캄파, 멘톨, 메틸 살리실산 성분을 GC를 이용하여 동시에 분석할 수 있는 분석 방법을 확립하여 의약품에 적용하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 기기로는 GC(GC-17, Shimadzu, Japan), Injector는 AOC-20I(Shimadzu, Japan), Detector는 FID를 선택하여 사용하였다.
- P사(Korea)에서, 클로르포름은 Daejung사(Korea에서) 그리고 DL-멘톨은 Acros organics사(Belgium)에서 구입하여 사용하였다. 또한 제제는 안티푸라민 연고(유한양행, Korea), 멘덤쿨 로오션(신신제약, Korea)를 구입하여 사용하였으며, 시약 및 가스는 특급 또는 고순도 질소가스(99.999%, 세종산업 가스)을 사용하였다.
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2. 기기 및 시약
시약으로는 메틸살리실산, 메탄올 및 디클로로메탄은 Samchun사(Korea)에서, DL-캄파는 D.S.P사(Korea)에서, 클로르포름은 Daejung사(Korea에서) 그리고 DL-멘톨은 Acros organics사(Belgium)에서 구입하여 사용하였다. 또한 제제는 안티푸라민 연고(유한양행, Korea), 멘덤쿨 로오션(신신제약, Korea)를 구입하여 사용하였으며, 시약 및 가스는 특급 또는 고순도 질소가스(99.
데이터처리
- 타당성이 검증된 분석법을 이용하여 안티푸라민 연고와 멘덤쿨 로오션에 적용하여 분석한 결과를 표 7에 나타내었다. 즉 모든 샘플에서 들어간 함량 범위이내에서 분석되었다.
성능/효과
- 1. GC의 분석조건은 DB-1 컬럼과 FID 검출기를 사용하여 검출기 250 ℃, 컬럼의 온도는 80 ℃에서 1분간 유지 후 1분에 3 ℃씩 상승시켜 110 ℃에서 3분간 유지, 1분에 50 ℃씩 상승시켜 220 ℃에서 1분간 유지하고 주입구의 온도는 220 ℃로 하였을 때세 물질이 양호하게 분리되었다.
- 2. 캄파, 멘톨 및 메틸 살리실산의 유지시간은 8.561, 9.703 및 10.110분이었다.
- 3. 캄파, 멘톨 및 메틸 살리실산 모두 검량선의 상관계수가 0.99이상으로 양호한 직선성을 나타내었다.
- 4. 캄파, 멘톨 및 메틸 살리실산의 LOD와 LOQ는 1.535와 4.659, 1.699와 5.149 그리고 1.648과 4.995㎍/㎖이었다.
- 5. 일내와 일간 정밀성은 0.99～3.63과 2.21～4.41%이었고 정확성은 85.24～108.77%이었다.
- 6. 시판되고 있는 파스 제품을 본 시험법에 적용하였을 때, 세 가지 성분 모두 함량기준 이내로 정량성 있게 검출되었다.
- 각 농도별 표준액에 대하여 분석조건으로 얻은 피크면적을 Y축, 표준액의 농도를 X축으로 하여 검량선을 작성하였고 검량선으로부터 직선식의 상관계수 (기준: R2=0.99 이상)를 구하여 직선성을 검토한 결과 모두 0.99이상으로 양호한 직선성을 나타내었다[표 4].
- 컬럼은 검체를 주입한 후 80 ℃에서 1분간 유지한 뒤 110 ℃까지 분당 3도씩 상승시켜 3분간 유지하였다. 그 뒤 240 ℃까지 분당 50 ℃의 온도로 상승시킨 후 1분간 유지하였을 때 세 물질의 분리가 가장 양호하게 되었음을 확인할 수 있었다[그림 2].
- 또한 정밀성 허용오차는 상대 표준편차가 15%를 초과해서는 안되며, 최저 정량한계 에서는 20%를 넘지 않도록 규정되어 있다. 이 때 분석 방법의 정밀성은 모든 표준품에서 일내와 일간 정밀성은 0.99～3.63과 2.21～4.41%이었고 정확성은 85.24～108.77%로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 GC를 이용한 메틸 살리실산, 멘톨 및 캄파 분석법은 의약품 중에서 적용할 수 있는 적합한 정밀성과 정확성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 이 때 위의 분석조건에서 기타 다른 성분들과 명확히 분리되고, 다른 물질과의 간섭이 없음을 확인하였다. 즉 spiking한 검체에서 각 성분의 면적의 합은 표준용액과 검체 중의 멘톨, 캄파 및 메틸 살리실산의 면적과 2% 이하의 차이를 나타내므로 다른 물질의 영향 없이 캄파, 멘톨 및 메틸 살리실산 성분을 측정할 수 있는 분석방법임을 확인하였다[표 3].
- 77%로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 GC를 이용한 메틸 살리실산, 멘톨 및 캄파 분석법은 의약품 중에서 적용할 수 있는 적합한 정밀성과 정확성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 이 때 위의 분석조건에서 기타 다른 성분들과 명확히 분리되고, 다른 물질과의 간섭이 없음을 확인하였다. 즉 spiking한 검체에서 각 성분의 면적의 합은 표준용액과 검체 중의 멘톨, 캄파 및 메틸 살리실산의 면적과 2% 이하의 차이를 나타내므로 다른 물질의 영향 없이 캄파, 멘톨 및 메틸 살리실산 성분을 측정할 수 있는 분석방법임을 확인하였다[표 3].
- 가장 직선성이 좋은 부분을 이용해 검출한계와 정량한계를 구한 결과를 표 5에 나타내었다. 즉 세 가지 성분 모두 비슷한 값을 나타내어 캄파, 멘톨 및 메틸 살리실산의 검출한계와 정량한계는 각각 1.535와 4.659, 1.699와 5.149 그리고 1.648과 4.995 ㎍/㎖이었다.
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