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문제 정의
- 그렇지만 토마토는 카로티노이드 중 라이코펜을 다량 함유하고 있으므로 향후 토마토 기능성 성분을 평가하기 위해서는 카로티노이드 4성분(루테인, 제아크산틴, 알파카로틴, 베타카로틴) 뿐만 아니라 라이코펜 성분을 동시에 분석할 수 있는 분석법 개발이 절실하다. 따라서 본 실험에서는 확립한 상기 배추 내 카로티노이드의 HPLC 분석 방법을 바탕으로 토마토의 카로티노이드 5성분을 동시에 분석할 수 있는 HPLC 분석법을 확립하였다. 이를 위하여 다음과 같이 이동상 용매의 구배조건과 HPLC 분석시간을 조절에 따라 단계별[분석조건 ①-⑤]로 분석법을 검토하였다(Fig.
가설 설정
- b)ND, not detected. c) n=12.
제안 방법
- 가. [분석조건 ①] : 기존에 선택한 분석법에서 라이코펜을 제외한 카로티노이드 4가지 성분의 피크가 모두 20분 이후에 분리되므로, 이동상 용매 B[ethyl acetate]에 변화를 주어 총 분석 시간을 단축시켰다. 이동상 용매 B를 60%로 시작하여 4분에 70%로 증가시킨 후, 6분에 75%로 증가시켜 7분까지 유지시켰다.
- 다. [분석조건 ③] : [분석조건 ②]에서 완전히 분리되지 않은 루테인과 제아크산틴의 피크를 분리시키기 위해, 이동상 용매 구배조건을 변화시킴과 동시에 총 분석 시간을 증가시켰다. 이동상 용매 B를 60%로 시작하여 4분에 70%로 증가시키고, 6분에 75%로 증가시켜 17분까지 유지시켜주었다.
- 라. [분석조건 ④] : [분석조건 ③]에서도 분리되지 않은 루테인과 제아크산틴 피크를 분리하기 위해, 이동상 용매 B를 60%에서 7분에 70%로 증가시키고, 9분에 75%까지 증가시킨 후, 20분까지 유지시켰다. 23분에는 100%까지 증가시켜 28분까지 유지하고, 28.
- 1분에 60%로 급격히 감소시켜 38분까지 10분간 칼럼을 세척하였다. 각 카로티노이드 5성분은 대응하는 외부표준물질의 HPLC 피크 면적(area)과 각 성분의 면적을 비교하여 정량하였다(Table 3).
- 녹인 용액은 0.45 μm hydrophilic PTFE syringe filter (직경 13 mm)로 필터한 후, HPLC용 vial병에 넣어 HPLC로 분석하였다(Fig. 2).
- 라이코펜을 포함한 카로티노이드 분석은 YMC carotenoid C30 column (250 × 4.6 mm i.d., particle size 3.0 μm)을 장착한 HPLC (Perkin Elmer Flexar, Inc, USA)를 사용하였다.
- 본 실험실에서는 배추 내 카로티노이드 고함유 계통 선발을 위하여 라이코펜을 제외한 카로티노이드 4성분(루테인, 제아크산틴, 알파카로틴, 베타카로틴)의 HPLC 분석법을 이미 개발하였다(slightly modified from Tuan, 2012). 분석법 개발 시, HPLC 분석 조건을 최적화하기 위해 배추의 시료량, 추출 용매(4종류)의 첨가량, 에탄올과 KOH 용매의 추출 온도 및 시간을 달리하여 추출실험을 진행하였다.
- 본 실험에서는 라이코펜을 포함한 카로티노이드 5성분(루테인, 제아크산틴, 알파카로틴, 베타카로틴, 라이코펜)의 동시분석법을 확립하고, 토마토 4종류(일반토마토, 방울토마토, 빨간색 및 주황색 대추방울토마토) 내 라이코펜의 함량을 정량화하였다.
- 본 실험실에서는 배추 내 카로티노이드 고함유 계통 선발을 위하여 라이코펜을 제외한 카로티노이드 4성분(루테인, 제아크산틴, 알파카로틴, 베타카로틴)의 HPLC 분석법을 이미 개발하였다(slightly modified from Tuan, 2012). 분석법 개발 시, HPLC 분석 조건을 최적화하기 위해 배추의 시료량, 추출 용매(4종류)의 첨가량, 에탄올과 KOH 용매의 추출 온도 및 시간을 달리하여 추출실험을 진행하였다. 상기 카로티노이드 추출과정을 간단하게 설명하면, 배추 시료를 각각 100, 200, 500 mg, 1, 2, 5 g씩 6가지로 칭량하고, 에탄올, KOH, water, 헥산 등 추출 용매 첨가량(시료량별 2가지)을 다르게 하였다(Table 1).
- 분석법 개발 시, HPLC 분석 조건을 최적화하기 위해 배추의 시료량, 추출 용매(4종류)의 첨가량, 에탄올과 KOH 용매의 추출 온도 및 시간을 달리하여 추출실험을 진행하였다. 상기 카로티노이드 추출과정을 간단하게 설명하면, 배추 시료를 각각 100, 200, 500 mg, 1, 2, 5 g씩 6가지로 칭량하고, 에탄올, KOH, water, 헥산 등 추출 용매 첨가량(시료량별 2가지)을 다르게 하였다(Table 1). 그 결과, 1 g 이상의 시료에서는 시료량이 많아 시료와 용매가 충분하게 혼합되지 않았다.
- [분석조건 ②] : [분석조건 ①]로 분석한 결과, 분석 시간이 충분히 길지 않아 라이코펜의 피크가 분석 도중 끊겨 분석 시간을 증가시켰다. 이동상 용매 B를 60%에서 4분에 70%로 증가시키고, 6분에 75%로 증가시켜 7분까지 유지시켰다. 10분에는 100%까지 증가시켜 15분까지 유지시킨 후, 15.
- 따라서 본 실험에서는 확립한 상기 배추 내 카로티노이드의 HPLC 분석 방법을 바탕으로 토마토의 카로티노이드 5성분을 동시에 분석할 수 있는 HPLC 분석법을 확립하였다. 이를 위하여 다음과 같이 이동상 용매의 구배조건과 HPLC 분석시간을 조절에 따라 단계별[분석조건 ①-⑤]로 분석법을 검토하였다(Fig. 3).
- 최적 추출 조건은 HPLC 분석 정량결과(Table 2)를 바탕으로 500 mg의 시료를 에탄올(5.0), KOH(1.5), 물(2.5), 헥산(2.5 mL)으로 추출한 것이 다른 시료에 비해 오차가 적고 추출 및 농축 시 조작이 용이하므로 이 방법으로 결정하였다. 특히 200 mg-II 시료를 사용한 분석 결과가 더 좋았으나 감압농축 시 조작 편이성 때문에, 헥산 양을 충분히 첨가할 수 있는 500 mg 시료를 사용하기로 결정하였다.
- 토마토 4종류(일반토마토, 방울토마토, 빨간색 및 주황색 대추방울토마토) 내 라이코펜을 분리하여 정량화하였다. 토마토에서는 라이코펜을 포함한 카로티노이드 5가지 성분(루테인, 제아크산틴, 알파카로틴, 베타카로틴, 라이코펜) 중 루테인, 베타카로틴, 라이코펜 3종류만 검출되었다(Fig.
대상 데이터
- (Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였고, ethyl acetate (CH3COOC2H5)는 Burdick&Jackson (Ulsan, Korea)을 사용하였다.
- (Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였고, ethyl acetate (CH3COOC2H5)는 Burdick&Jackson (Ulsan, Korea)을 사용하였다. Hexane (C6H14)은 Fluka Chemika(Buchs, Switzerland) 것을 사용하였으며, dichloromethane (CH2Cl2)은 LiChrosolv (New Jersey, USA) 제품을 사용하였다. Potassium hydroxide (KOH)는 Junsei Chemical Co.
- Hexane (C6H14)은 Fluka Chemika(Buchs, Switzerland) 것을 사용하였으며, dichloromethane (CH2Cl2)은 LiChrosolv (New Jersey, USA) 제품을 사용하였다. Potassium hydroxide (KOH)는 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
- 분석 컬럼은 carotenoid 전용 컬럼인 YMC carotenoid C30 column (250 × 4.6 mm i.d., particle size 3.0 μm)을 장착하였고, 이동상 용매는 A [water: methanol =25: 75 (v/v)]과 B[ethyl acetate]를 사용하였다.
- 시료는 -70°C 급속 초저온 냉동고(SFDSF 12, Samwon Freezing Engineering Co., Busan, Korea)에 동결시킨 후 동결건조(Samwon Freezing Engineering Co., Busan, Korea)하여 막자와 막자사발로 분말하였다.
- 0 μL로 설정하였다. 이동상 용매는 A [water: methanol =25: 75 (v/v)]과 B[ethyl acetate]를 사용하였다. 용매 B는 처음에 60%로 시작하여 4분에 70%까지 증가시키고, 9분에 75%로 증가시킨 후 20분까지 유지시켰다.
- 토마토(Lycopersicon esculentum)는 4종류(일반토마토, 방울토마토, 빨간색 및 주황색 대추방울토마토) 모두 충남 논산에서 재배한 것을 2014년 3월 대형마트에서 구매하였다. 시료는 -70°C 급속 초저온 냉동고(SFDSF 12, Samwon Freezing Engineering Co.
데이터처리
- 모든 토마토 시료는 3반복으로 분석하였고, 분석 결과를 Microsoft Ofiice Excel 2010으로 평균값(average)과 표준편차(SD, standard deviation)를 구하였다. 통계프로그램은 IBM SPSS® version 21을 사용하여 일원배치 분산분석을 실시하였고(n=3), 사후분석은 Tukey 검정법으로 결정하였다.
- 통계프로그램은 IBM SPSS® version 21을 사용하여 일원배치 분산분석을 실시하였고(n=3), 사후분석은 Tukey 검정법으로 결정하였다.
이론/모형
- 1분에 0%로 급격히 감소시켜 30분까지 유지시켰다. 배추 시료를 분석한 결과, 라이코펜을 제외한 카로티노이드 4성분(루테인, 제아크산틴, 알파카로틴, 베타카로틴)의 피크가 모두 분리되어 이 방법을 카로티노이드 분석법으로 선택하였다.
성능/효과
- 5). 4종류의 토마토 내의 총 카로티노이드 함량 중 평균적으로 라이코펜이 93%로 대부분을 차지 하였고, 루테인은 4%, 베타카로틴은 3%를 차지하였다(Fig. 6).
- 2배 높았다. 가장 짙은 붉은색을 띈 빨간색 대추방울토마토(626.2)에서 라이코펜 함량이 다른 세 종류의 토마토 보다 상대적으로 높게 나타났고, 주황색 대추방울토마토(87.4 mg/kg dry wt.)에서 가장 낮게 나타났다. 이러한 결과는 라이코펜이 짙은 붉은색을 띄게 하는 색소이므로, 상대적으로 붉은색 색소를 적게 가지고 있는 주황색 대추방울토마토에서 함량이 다른 토마토에 비해 낮게 나타난 것으로 생각된다(Gomez-Prieto et al.
- 상기 카로티노이드 추출과정을 간단하게 설명하면, 배추 시료를 각각 100, 200, 500 mg, 1, 2, 5 g씩 6가지로 칭량하고, 에탄올, KOH, water, 헥산 등 추출 용매 첨가량(시료량별 2가지)을 다르게 하였다(Table 1). 그 결과, 1 g 이상의 시료에서는 시료량이 많아 시료와 용매가 충분하게 혼합되지 않았다. 따라서 추출이 잘 되지 않는 1 g 이상의 시료를 추출방법에서 제외하였다.
- 1분에는 60%로 급격히 감소시켜 38분까지 유지하였다. 그 결과, 루테인은 11.6분, 제아크산틴은 12.2분, 알파 카로틴은 26.2분, 베타카로틴은 27.9분, 라이코펜은 36.4분에서 분리되었다.
- 라이코펜의 함량은 빨간색 대추방울 토마토(626.2) > 일반토마토(433.0) > 방울토마토(422.6) > 주황색 대추방울토마토(87.4 mg/kg dry wt.) 순으로 높게 나타났고, 빨간색 대추방울토마토는 주황색 대추방울토마토 보다 약 7.2배 높았다.
- 루테인 함량은 일반토마토와 빨간색 대추방울토마토에서 다른 두 종류보다 조금 높은 것으로 나타났다. 베타카로틴은 주황색 대추방울토마토에서 15.
- 이동상 용매 B의 구배조건에 변화(60 → 100%)를 주어 분석한 결과, 카로티노이드 5성분 표준품의 피크가 모두 잘 분리된 [분석조건 ⑤]로 분석법을 확립하였다.
- 총 카로티노이드 함량은 빨간색 대추방울토마토(729.9) > 일반토마토(464.7) > 방울토마토(441.2) > 주황색 대추방울토마토 (111.3 mg/kg dry wt.) 순으로 높았고, 각 카로티노이드 성분별 함량은 라이코펜(4종류 토마토 평균값(392.3) > 루테인(15.6) > 베타카로틴(11.8 mg/kg dry wt.) 순으로 높게 나타났다(Table 3, Fig. 5).
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