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문제 정의
- 따라서 식품 중에 질산염, 아질산염 및 아민류가 든 식품을 섭취했을 때 위 내에서 니트로사민이 생성될 수 있다(3). 그러므로 아질산염을 효과적으로 소거하면 니트로사민 생성을 억제할 수 있기 때문에 본 연구에서는 아질산염 소거 효과 및 김치의 건강 증진 효과를 가질 뿐만 아니라 제품화를 위해 김치에 첨가했을 때 소비자의 입맛에도 맞는 천연소재를 발굴하고자 하였고, 먼저 다양한 산채들을 이용하여 아질산염 소거 작용을 알아보았다.
- 따라서 본 연구에서는 김치의 니트로사민 저감화 기술 개발의 일환으로 아질산염 소거 작용을 가진 더덕, 잔대, 도라지, 민들레 등 9종의 산채를 발굴하였고, 소비자의 입맛에 맞는 이들 천연소재의 최적 배합비를 가진 혼합물을 이용한 김치를 제조하여 유산균 변화, 항산화 효과, 뇌신경세포 사멸 억제 효과 등을 알아보았다.
- 국제적으로 김치에 니트로사민 생성에 대한 보고는 전무하지만 국내에서는 김치 내 니트로사민이 검출된다는 보고들이 있다(30, 31). 따라서 본 연구에서는 김치의 니트로사민 저감화의 방안으로 배추에 함유된 아질산염 소거에 의한 김치에서 생성 가능한 니트로사민 생성을 억제할 수 있는 천연소재를 찾고자 하였다.
- 0 부근에서 아질산염 소거 작용이 있어야 한다. 또한 김치를 섭취 후 배추에 함유된 아질산염 및 환원미생물에 의해 배추에 함유된 질산염이 아질산염으로 전환된 것이 산성조건인 위 내에서 젓갈에 함유된 제2급 아민과 반응하여 다량의 니트로사민이 생성될 수 있지만 김치는 대부분 주식과 함께 섭취하므로 식사 후는 위 내 pH가 3.0~4.5가 되므로 아질산염 소거 작용 소재 선택 시 pH 4.2에서 효과가 높은 것을 선택하는 것도 중요한 의미가 있을 것이라 판단되어 본 연구에서는 pH 4.2에서 아질산염 소거 작용이 높은 소재인 산마늘, 도라지, 더덕, 잔대 및 민들레 추출물(AV, PG, CL, AT, TO)을 계속되는 실험을 위해 선택하였다. 5종류의 산채를 이용하여 김치양념에 첨가할 산채 혼합물의 최적 배합비 개발을 위해 다양한 혼합물을 만들어 관능검사를 실시한 결과 관능검사에서 가장 높은 점수를 받은 최적 배합비 혼합물은 더덕 물 추출물(CLE) : 잔대 물 추출물(ATE) : 도라지 물 추출물(PGE) : 민들레 물 추출물(TOE)을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 추출물 그리고 더덕 분말 : 잔대 분말 : 도라지 분말 : 민들레 분말을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 분말이었으므로(관능검사 자료 미제시), 계속되는 실험에서는 산마늘을 제외한 도라지, 더덕, 잔대 및 민들레를 선택하였다.
- 본 연구에서는 NaNO2 모델계와 배추에 함유된 아질산염에 대한 9종류 산채들의 아질산염 소거 작용 및 아질산염 소거 작용을 가진 산채들의 혼합물을 함유한 김치(MWV)의 뇌신경세포 사멸 억제 효과에 대해 연구하였다. 아질산염 소거 작용은 모든 시료에서 pH 4.
- 본 연구에서는 더덕, 잔대, 도라지 및 민들레 추출물이 배추에 함유된 아질산염을 소거하는 것을 보여주었고, 이들 결과는 김치 양념으로 사용 가능한 천연소재, 유산균 등을 이용하여 니트로사민의 전구물질인 아질산염을 소거함으로써 김치의 니트로사민 생성을 억제할 수 있을 가능성을 더욱 증가시킨 결과를 제시하였다.
- 알츠하이머형 치매(Alzheimer's disease)와 같은 신경계 질환은 산화적 스트레스에 의해 신경세포가 손상되어 결국 신경세포가 사멸하기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있어 산화적 스트레스를 유발하는 ROS에 의한 신경세포 손상으로부터 신경세포를 보호할 수 있는 부작용이 적은 천연소재에서 유래된 항산화제를 개발하고자 하는 연구들이 활발하게 진행되고 있다(24,34,35). 본 연구에서는 산채 혼합물 첨가 김치가 항산화 효과에 의해 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있는지 알아보기 위해 먼저 항산화 효과를 알아보았다.
가설 설정
- 1)MWV is the abbreviation of kimchi containing mixture extract and mixture power of wild vegetables.
- 2)NS: Data within a same item are not significantly different.
- 2)Values with different small letters within the same kind of wild vegetable are significantly different at P<0.05.
- 4)NS: Data within the same kind of wild vegetable are not significantly different.
제안 방법
- cells/well로 조정하여 96-well plates에 세포를 깔아주고 24시간 동안 배양하여 MTT assay와 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 검출하기 위하여 사용하였다. 12시간 기아상태를 유지시킨 후 시료를 우태아 혈청을 첨가하지 않은 EMEM으로 희석하여 24시간 단독 처리하고 시료의 세포독성을 알아보았다. 산화적 스트레스에 대항하는 시료의 뇌신경세포의 사멸 억제 효과를 알아보기 위해 시료를 500 μM H2O2와 30분간 SK-N-SH 세포에 동시에 처리하였고, ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 역시 시료와 500μM H2O2를 동시에 30분간 SK-N-SH 세포에 처리하였다.
- 2에서 아질산염 소거 작용이 높은 소재인 산마늘, 도라지, 더덕, 잔대 및 민들레 추출물(AV, PG, CL, AT, TO)을 계속되는 실험을 위해 선택하였다. 5종류의 산채를 이용하여 김치양념에 첨가할 산채 혼합물의 최적 배합비 개발을 위해 다양한 혼합물을 만들어 관능검사를 실시한 결과 관능검사에서 가장 높은 점수를 받은 최적 배합비 혼합물은 더덕 물 추출물(CLE) : 잔대 물 추출물(ATE) : 도라지 물 추출물(PGE) : 민들레 물 추출물(TOE)을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 추출물 그리고 더덕 분말 : 잔대 분말 : 도라지 분말 : 민들레 분말을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 분말이었으므로(관능검사 자료 미제시), 계속되는 실험에서는 산마늘을 제외한 도라지, 더덕, 잔대 및 민들레를 선택하였다.
- SK-N-SH 세포 내에서 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유무 및 시료가 뇌신경세포 내 ROS를 소거할 수 있는지를 확인하기 위해서 2,7-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA, Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 SK-NSH 세포 내 생성된 ROS 양을 측정하였다. 10 mM DCF-DA를 만들어 10 μM 농도가 되도록 phosphate buffer saline(PBS)으로 희석시켰다.
- Whatman filter paper(Whatman No. 2, Whatman International Co., Maidstone, UK)(pore size 8 μm)로 여과하여 더덕 물 추출물(CLE), 잔대 물 추출물(ATE), 도라지물 추출물(PGE) 및 민들레 물 추출물(TOE)을 얻었고 농축 및 동결건조 없이 김치 제조를 위한 혼합 추출물 제조를 위해 사용하였다.
- 각 물 추출물을 다양한 중량비로 혼합한 혼합 추출액 및 각 분말을 다양한 중량비로 혼합한 혼합 분말을 9명의 관능검사 요원에 의해 맛(taste), 향미(flavor), 야생초 맛(wild vegetables taste) 및 종합적인 기호도(overall acceptability)를 5점 척도법으로 실시하였다. 관능검사 결과 가장 높은 점수를 받은 혼합 추출물 및 혼합 분말을 선택하였다(관능검사 자료 미제시).
- 발효 7일째 김치의 관능검사는 20~25세의 남녀 대학생 40명을 선정하여 5점 척도법으로 실시하였다. 관능검사 항목은 김치의 외관(appearance), 색상(color), 향미(flavor), 조직감(texture), 맛(taste), 짠맛(salty taste), 신맛(sour taste), 야생초 맛(wild vegetables taste) 및 종합적인 기호도(overall acceptability)에 대하여 매우 좋다(매우 강하다, 5점), 좋다(강하다, 4점), 그저 그렇다(3점), 약하다(2점), 아주 약하다(1점)로 평가하였다. 관능검사에 참여한 지원자들은 설문지에 나이와 성별 등을 기록하고 김치 10 g을 입 안에 넣고 20초간 씹어 구강표피를 골고루 자극한 다음 뱉어내고, 한 시료의 평가를 마칠 때마다 입을 세척하고 10분 경과된 후 다음 시료를 평가하였다.
- 관능검사 항목은 김치의 외관(appearance), 색상(color), 향미(flavor), 조직감(texture), 맛(taste), 짠맛(salty taste), 신맛(sour taste), 야생초 맛(wild vegetables taste) 및 종합적인 기호도(overall acceptability)에 대하여 매우 좋다(매우 강하다, 5점), 좋다(강하다, 4점), 그저 그렇다(3점), 약하다(2점), 아주 약하다(1점)로 평가하였다. 관능검사에 참여한 지원자들은 설문지에 나이와 성별 등을 기록하고 김치 10 g을 입 안에 넣고 20초간 씹어 구강표피를 골고루 자극한 다음 뱉어내고, 한 시료의 평가를 마칠 때마다 입을 세척하고 10분 경과된 후 다음 시료를 평가하였다.
- 즉 각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지의 10분의 1을 가해주고 다시 37°C에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. 남아있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용하여 용해시킨 시료를 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포의 생존율은 아래와 같이 계산하였다.
- 4 mL 가하여 잘 혼합한 후 빛을 차단한 상태에서 실온에 15분간 방치시킨 다음 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정한다. 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.4 mL를 첨가한 후 동일한 방법으로 측정하였고, 아질산염 소거 작용은 다음과 같은 계산식으로 계산하였다.
- 더덕 물 추출물(CLE) : 잔대 물 추출물(ATE) : 도라지 물 추출물(PGE) : 민들레 물 추출물(TOE)을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 추출물은 전체 김치 무게의 약 3%, 그리고 더덕 분말 : 잔대 분말 : 도라지 분말 : 민들레 분말을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 분말은 전체 김치 무게의 약 1.4%로 첨가하여 제조한 김치를 4°C에서 7일간 발효 숙성시키면서 0, 3 그리고 7일에 pH와 산도의 변화를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다.
- CL, AT, PG 및 TO는 배추에 함유된 아질산염에 대해 높은 아질산염 소거 작용을 가지고 있었다. 더하여 항산화 및 산화적 스트레스에 의한 뇌신경세포 사멸에 대한 MWV의 영향을 사람의 뇌 신경모세포종 SK-N-SH 세포 내에서 연구하였다. MWV 추출물은 SK-N-SH 세포에서 H2O2에 의해 유도된 세포 사멸과 ROS 생성을 약화시켰다.
- 관능검사 결과 가장 높은 점수를 받은 혼합 추출물 및 혼합 분말을 선택하였다(관능검사 자료 미제시). 따라서 가장 높은 점수를 받은 CLE : ATE : PGE : TOE를 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 추출물 그리고 더덕 분말 : 잔대 분말 : 도라지 분말 : 민들레 분말을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 분말을 김치 양념 제조를 위해 사용하였다.
- 산화적 스트레스에 대항하는 시료의 뇌신경세포의 사멸 억제 효과를 알아보기 위해 시료를 500 μM H2O2와 30분간 SK-N-SH 세포에 동시에 처리하였고, ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 역시 시료와 500μM H2O2를 동시에 30분간 SK-N-SH 세포에 처리하였다. 무처리군과 H2O2 처리군은 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다.
- 사람의 신경모세포종 SK-N-SH를 10% 비활성화 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin/ streptomycin) 용액을 넣은 Eagle's minimum essential medium(EMEM; ATCC, Manassas, VA, USA) 배양액으로 5% CO2가 공급되는 배양기에서 37°C 조건으로 배양하였다.
- 산채 분말 시료 및 제조된 김치의 동결 건조 분말의 중량의 10배인 70% 에탄올(Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea)을 첨가하여 추출기(DM606, Misung Scientific Co., Ltd., Seoul, Korea)로 실온에서 8시간 동안 3회 추출하였다. 아질산염 소거 작용, 항산화 및 뇌신경세포 사멸 억제 효과 실험을 위한 시료는 여과하여 얻은 액상을 감압농축기(N-1200BV, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출용매를 제거한 후 진공 동결건조기(Clean Vac-8, Hanil Science Industrial Co.
- 산화적 스트레스에 대항하는 시료의 뇌신경세포의 사멸 억제 효과를 알아보기 위해 시료를 500 μM H2O2와 30분간 SK-N-SH 세포에 동시에 처리하였고, ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 역시 시료와 500μM H2O2를 동시에 30분간 SK-N-SH 세포에 처리하였다.
- DCF-DA 용액을 제거한 후 PBS로 남아 있는 DCF-DA를 완전히 제거한 다음 PBS를 더하여 5분간 배양시켰다. 세포 내 형광 광도의 변화를 형광 광도계(Bio Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 488 nm(excitation)와 525 nm(emission)에서 측정하였다(24).
- 실험에 사용된 산채를 건조한 후 분쇄한 분말 시료 중량의 10.7배인 증류수를 첨가하여 60°C shaking incubator(SI-900R, Jeio Tech, Daejeon, Korea)에서 24시간 추출하였다.
- , Seoul, Korea)로 실온에서 8시간 동안 3회 추출하였다. 아질산염 소거 작용, 항산화 및 뇌신경세포 사멸 억제 효과 실험을 위한 시료는 여과하여 얻은 액상을 감압농축기(N-1200BV, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출용매를 제거한 후 진공 동결건조기(Clean Vac-8, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 동결건조 하였다. 동결건조 된 분말 더덕 70% 에탄올 추출물(CL), 잔대 70% 에탄올 추출물(AT), 도라지 70% 에탄올 추출물(PG), 민들레 70% 에탄올 추출물(TO), 다래순 70% 에탄올 추출물(OL), 곤드레 70% 에탄올 추출물(CS), 누룩치 70% 에탄올 추출물(PK), 참취 70% 에탄올 추출물(AS), 산마늘 70% 에탄올 추출물(AV), 일반 김치 70% 에탄올 추출물(NK) 그리고 산채 혼합물을 함유한 김치 70% 에탄올 추출물(MWV)은 -20°C의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 아질산염 소거 작용은 Kato 등(23)의 방법을 변형하여 측정하였다. 일정 농도의 추출물 시료 1 mL에 1 mM NaNO2 용액 1 mL를 가하고, 이 용액에 0.
- 유산균은 김치 10 g을 채취하여 멸균수에 십진 희석법으로 희석한 뒤 bromocresol purple(BCP) 한천배지(Eiken Chemical Co., Shimotsuma, Japan)를 이용하여 평판배양법으로 37°C에서 48시간 배양하였다.
- 인간의 신경세포주인 SK-N-SH 세포에 500 μM H2O2를 30분 동안 처리하여 세포 내 ROS 생성에 의한 산화적 스트레스를 유발시켰고, NK와 MWV 추출물이 500 μM H2O2 처리에 의해 세포 내 생성되는 ROS 생성 억제 및 소거 작용을 가지고 있는지 알아보았다.
- 전남 무안에서 재배된 배추의 아질산염 측정은 nitrite assay(22)를 변형하여 측정하였다. 즉 배추를 믹서기(HMF-3450, Hanil, Seoul, Korea)로 간 다음 시료 20 g에 증류수 25 mL를 넣고 vortex mixer(VM-10, Daihan Scientific Co.
- 제조된 김치들을 발효 3일과 7일에 채취하여 믹서기(Hanil)로 갈았고, 이것을 pH 및 산도 측정을 위해 사용하였다. pH는 시료 10 g에 증류수 90 mL를 가한 후 다시 균질화하여 실온에서 pH meter(Docu-pH, Sartorius, Germany)로 측정하였고, 산도는 시료 1 g에 증류수 100 mL를 가한 후 균질화하여 여과한 다음 20 mL에 0.
- 전남 무안에서 재배된 배추의 아질산염 측정은 nitrite assay(22)를 변형하여 측정하였다. 즉 배추를 믹서기(HMF-3450, Hanil, Seoul, Korea)로 간 다음 시료 20 g에 증류수 25 mL를 넣고 vortex mixer(VM-10, Daihan Scientific Co., Wonju, Korea)를 이용하여 10분간 격렬히 진탕한 후 여과한 시료를 분석용 시료로 사용하였다. 시료의 NO2 농도는 100 μL 분석용 시료와 동량의 100 μL Griess regent[A: B=1:1, A: 0.
- 충분한 세포를 얻기 위해 배양용 플라스크(T75 cm2)에서 세포를 배양하고, 2~3일에 한 번씩 배지를 80% 교체하여 충분히 자랐을 때 trypsin-EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 용액(1×)을 사용하여 부착된 세포를 떼어낸 후 성장배지에 세포수를 1×104 cells/well과 2×104 cells/well로 조정하여 96-well plates에 세포를 깔아주고 24시간 동안 배양하여 MTT assay와 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 검출하기 위하여 사용하였다.
- 남아있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용하여 용해시킨 시료를 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포의 생존율은 아래와 같이 계산하였다.
대상 데이터
- ) in 5% H3PO4]를 잘 혼합한 후 빛을 차단한 상태로 실온에 10분간 방치시킨 다음 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다. NaNO2의 검량선을 이용하여 정량하였다.
- 강원도 횡성에서 재배된 더덕(C. lanceolata), 잔대(A. triphylla), 도라지(P. grandiflorum), 민들레(T. officinale) 및 다래순(sprout of Oenothera laciniata)을 구입하였고, 양양에서 재배된 곤드레(Cirsium setidens), 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum), 참취(Aster scaber) 그리고 산마늘(Allium victorialis Linne)을 구입하였다. 본 연구에 사용된 모든 산채 견본은 공주교육대학교 조선행 교수로부터 식물학적 동정을 받았다.
- 각 물 추출물을 다양한 중량비로 혼합한 혼합 추출액 및 각 분말을 다양한 중량비로 혼합한 혼합 분말을 9명의 관능검사 요원에 의해 맛(taste), 향미(flavor), 야생초 맛(wild vegetables taste) 및 종합적인 기호도(overall acceptability)를 5점 척도법으로 실시하였다. 관능검사 결과 가장 높은 점수를 받은 혼합 추출물 및 혼합 분말을 선택하였다(관능검사 자료 미제시). 따라서 가장 높은 점수를 받은 CLE : ATE : PGE : TOE를 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 추출물 그리고 더덕 분말 : 잔대 분말 : 도라지 분말 : 민들레 분말을 1:1:1:1의 중량비로 혼합된 혼합 분말을 김치 양념 제조를 위해 사용하였다.
- 김치 재료인 무안에서 재배된 배추와 무, 고춧가루(Emart Ltd., Seoul, Korea), 마늘, 생강, 양파, 새우젓(Eomda Co., Jeonnam, Korea), 까나리액젓(Chungjungone, Seoul, Korea), 설탕(Samyang Co., Seoul, Korea), 찹쌀가루 및 소금(Chungjungone)은 광주 효덕로 소재 대형마트에서 구입하였고, 배추의 비가식 부분을 제거한 후 2등분 한 배추는 배추 1 kg당 천일염 0.139 kg과 물 1.2 kg을 혼합한 소금물에 습식법으로 절였다. 실온(약 20°C)에서 16시간 동안 절인 후 수돗물로 3회 세척하고 3시간 동안 탈수하여 김치 제조에 사용하였다.
- 김치 제조에 사용된 재료는 절임배추, 무채, 고춧가루, 마늘, 생강, 양파, 찹쌀풀, 새우젓, 까나리액젓, 설탕, 혼합 추출액, 혼합 분말 그리고 물을 Table 1의 양만큼 넣어 잘 버무린 다음 저밀도 폴리에틸렌(low-density polyethylene, LDPE) 필름(폭 25 cm×길이 30 cm)으로 개별 포장한 후 김치 통에 넣어 4°C에서 저장하면서 발효 3일과 7일째 시료를 실험에 사용하였다.
- 동결건조 된 분말 더덕 70% 에탄올 추출물(CL), 잔대 70% 에탄올 추출물(AT), 도라지 70% 에탄올 추출물(PG), 민들레 70% 에탄올 추출물(TO), 다래순 70% 에탄올 추출물(OL), 곤드레 70% 에탄올 추출물(CS), 누룩치 70% 에탄올 추출물(PK), 참취 70% 에탄올 추출물(AS), 산마늘 70% 에탄올 추출물(AV), 일반 김치 70% 에탄올 추출물(NK) 그리고 산채 혼합물을 함유한 김치 70% 에탄올 추출물(MWV)은 -20°C의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 발효 7일째 김치의 관능검사는 20~25세의 남녀 대학생 40명을 선정하여 5점 척도법으로 실시하였다. 관능검사 항목은 김치의 외관(appearance), 색상(color), 향미(flavor), 조직감(texture), 맛(taste), 짠맛(salty taste), 신맛(sour taste), 야생초 맛(wild vegetables taste) 및 종합적인 기호도(overall acceptability)에 대하여 매우 좋다(매우 강하다, 5점), 좋다(강하다, 4점), 그저 그렇다(3점), 약하다(2점), 아주 약하다(1점)로 평가하였다.
- officinale) 및 다래순(sprout of Oenothera laciniata)을 구입하였고, 양양에서 재배된 곤드레(Cirsium setidens), 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum), 참취(Aster scaber) 그리고 산마늘(Allium victorialis Linne)을 구입하였다. 본 연구에 사용된 모든 산채 견본은 공주교육대학교 조선행 교수로부터 식물학적 동정을 받았다.
데이터처리
- The values are expressed as the mean±SD (n=4), and means with different letters are significantly different from each other (P<0.05), as determined by Duncan's multiple range test.
- The values are expressed as the mean±SD (n=8), and means with different letters are significantly different from each other (P<0.05), as determined by Duncan's multiple range test.
- 05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다. 모든 통계 분석은 SPSS(statistical package for the social science) version 12.0 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 본 실험 결과들은 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군 간 평균의 차이는 oneway ANOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검정하였으며, P<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
이론/모형
- 배양이 끝난 SK-N-SH 세포의 생존율은 Chung 등(24)이 사용한 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl terazolium bromid] 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지의 10분의 1을 가해주고 다시 37°C에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다.
성능/효과
- 3)Means with different letters are significantly different from each other (P<0.05, n=40).
- 3)Values with different capital letters within a same concentration are significantly different at P<0.05.
- 500 μM H2O2를 30분 동안 처리하였을 때 생성된 ROS는 대조군[control(C): 100%]과 비교하여 297.8% 증가하였고, NK와 MWV 추출물 처리에 의해 유의적으로 감소하였으나 군 간의 차이는 없었다(Fig. 3B).
- 2에서 90% 이상 아질산염 소거 작용을 나타내었다. AS, 더덕, 잔대, 도라지및 민들레 추출물들(CL, AT, PG, TO)은 pH 4.2에서 다른 추출물보다 아질산염 소거 작용이 높았다. CL, AT, PG 및 TO는 배추에 함유된 아질산염에 대해 높은 아질산염 소거 작용을 가지고 있었다.
- Luteolin과 luteolin-7-O-glucoside는 H2O2와 Aβ25-35로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 세포 생존율 증가와 ROS 생성 저해 효과를 나타냄으로써 신경세포 손상에 대하여 우수한 보호 효과가 확인되었는데(42), 본 연구에서 민들레가 포함된 산채 혼합물을 함유한 김치 추출물이 신경세포 내 ROS 생성을 저해한 것은 민들레에 함유된 luteolin과 luteolin-7-O-glucoside가 주요한 역할을 하였을 것이라 추정할 수 있고, 산채 혼합물 함유 김치는 세포 내 ROS 소거작용뿐만 아니라 산화적 스트레스 상태에서 세포 생존율도 증가시킬 수 있을 것이라는 가능성을 증가시켜 주었다.
- MWV 추출물은 SK-N-SH 세포에서 H2O2에 의해 유도된 세포 사멸과 ROS 생성을 약화시켰다. MWV 추출물은 일반김치 추출물과 비교하여 현저하게 높은 DPPH 라디칼 소거 작용을 보여주었다. MWV 추출물은 항산화 효과에 의해 산화적 스트레스(H2O2)에 대항하여 뇌신경세포 사멸 억제 효과를 가지고 있었다.
- DPPH 라디칼 소거 작용은 DPPH의 짙은 자색이 탈색되는 정도에 따라 그 물질의 항산화 효과를 측정하는 방법으로 일반적으로 가장 많이 사용하는 항산화 실험법 중의 하나다(36). NK와 MWV 추출물들의 0.05~1 mg/mL 농도에서는 두 군 간의 유의적 차이가 없었으나 MWV 추출물은 2.5, 5.0 그리고 10 mg/mL 농도에서 NK 추출물과 비교하여 유의적으로 높은 DPPH 라디칼 소거 작용을 나타내었고, 10 mg/mL 농도에서 MWV와 NK 추출물들의 DPPH 라디칼 소거율은 91.8%와 73.7%였다(Fig. 3A).
- SK-N-SH 세포에 500 μM H2O2 처리하였을 때 무처리구인 대조구와 비교하여 52.6% 세포 생존율을 나타내었으며, NK와 MWV 추출물들 처리군은 500 μM H2O2의 단독 처리군보다 유의적으로 세포 생존율이 증가하였고, 0.5와 1 mg/mL 농도에서는 NK 처리군보다 MWV 처리군이 유의적으로 세포 생존율이 증가하였다.
- 2에서는 90% 이상 아질산염 소거 활성이 있었고 이는 1% ascorbic acid의 아질산염 소거 작용보다 높았다(29). pH 1.2에서 산수유의 60% 에탄올 추출물의 아질산염 소거 작용(29)을 본 연구 결과와 비교하면 민들레, 다래순 그리고 참취 70% 에탄올 추출물들(TO, OL, AS)과 유사하였고 다른 산채 추출물보다 높았다.
- 더덕, 잔대 및 도라지 추출물들(CL, AT, PG)은 1 mM NaNO2의 모델계 실험 결과보다 높은 아질산염 소거 작용을 나타내었으며, 민들레는 125~500 μg/mL에서는 유사한 아질산염 소거 작용을 나타냈으나 1,000 μg/mL에서는 오히려 낮았다(Table 3과 Table 4). pH 4.2에서 더덕, 도라지 그리고 민들레 추출물들(CL, AT, PG)은 1 mM NaNO2의 모델계 실험 결과와 유사하거나 낮았지만 잔대추출물(AT)은 모든 처리 농도에서 높은 아질산염 소거 작용을 나타내었다. 이와 같이 1 mM NaNO2의 모델계 실험과 다른 경향을 나타나는 것은 배추 추출물에는 아질산염뿐만 아니라 다른 물질들이 함유되어 있기 때문에 더덕, 잔대, 도라지 및 민들레의 70% 에탄올 추출물에 함유된 성분과 반응하여 아질산염 소거 작용에 영향을 미칠 수 있을 것이라 생각된다.
- 1%였다(Table 2). 각 산채의 추출 수율은 잔대가 27.4%로 가장 낮았으며, 도라지가 42.5%로 가장 높게 나타났다(Table 2).
- 김치의 관능적 품질 평가는 대학생 40명을 대상으로 김치의 외관, 색상, 향미, 조직감, 맛, 짠맛, 신맛, 야생초 맛 및 종합적인 기호도를 평가한 결과 신맛과 야생초 맛을 제외하고는 유의적 차이가 없었다. 신맛과 야생초 맛은 일반김치(NK)보다는 산채 혼합물이 첨가된 김치(MWV)가 유의적으로 높은 점수를 받았다(Table 5).
- 다래순과 참취추출물들(OL, AS)은 1,000 μg/mL에서 90.8%와 92.3% 아질산염 소거 작용을 나타내었고, 같은 농도에서 더덕, 잔대, 도라지 및 민들레 추출물들(CL, AT, PG, TO)은 각각 35.8%, 32.4%, 36.3%, 88.6% 아질산염 소거 작용을 나타내었다.
- 더덕, 잔대 및 도라지 추출물들(CL, AT, PG)은 1 mM NaNO2의 모델계 실험 결과보다 높은 아질산염 소거 작용을 나타내었으며, 민들레는 125~500 μg/mL에서는 유사한 아질산염 소거 작용을 나타냈으나 1,000 μg/mL에서는 오히려 낮았다(Table 3과 Table 4).
- 더덕, 잔대, 도라지, 민들레, 다래순, 곤드레, 누룩치, 참취 그리고 산마늘 70% 에탄올 추출물의 수율은 각각 40.4, 27.4, 42.5, 35.8, 34.0, 35.4, 33.6, 33.0 그리고 35.1%였다(Table 2). 각 산채의 추출 수율은 잔대가 27.
- 5와 1 mg/mL 농도에서는 NK 처리군보다 MWV 처리군이 유의적으로 세포 생존율이 증가하였다. 따라서 김치는 산화적 스트레스에 의해 유발되는 뇌신경세포 사멸을 항산화 효과에 의해 억제함으로써 퇴행성 신경질환인 알츠하이머형 치매 등과 같은 뇌질환 예방 및 개선에 도움이 될 수 있고, 특히 본 연구에서 개발한 산채 혼합물 첨가 김치가 더 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
- 더덕, 잔대, 도라지, 민들레, 다래순, 곤드레, 누룩치, 참취 및 산마늘 70% 에탄올 추출물들의 아질산염 소거 작용은 Table 3과 같다. 모든 시료들이 일부 농도 구간을 제외하고 농도 의존적으로 아질산염 소거 작용이 증가하였고, 9종류의 산채들 중에 pH 1.2에서는 더덕, 잔대 및 도라지 추출물들(CL, AT, PG)이 민들레, 다래순, 곤드레, 누룩치, 참취 및 산마늘 추출물들(TO, OL, CS, PK, AS, AV)보다 낮은 아질산염 소거 작용을 나타내었다(Table 3). 다래순과 참취추출물들(OL, AS)은 1,000 μg/mL에서 90.
- 본 연구에 사용한 배추 추출물의 아질산염 농도는 1 mM이었다. 배추에 함유된 아질산염을 더덕, 잔대, 도라지 및 민들레의 70% 에탄올 추출물들(CL, AT, PG, TO)이 소거할 수 있는지 알아본 결과 pH 1.2에서 농도 의존적으로 아질산염 소거 작용을 나타내었다(Table 4). 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid보다 낮았지만 1,000 μg/mL에서 잔대와 민들레 추출물들(AT, TO)의 아질산염 소거 작용은 67.
- 따라서 p38, JNK 그리고 ERK가 인산화에 의해 활성화되는 것을 막을 수 있다면 뇌신경세포 사멸을 억제할 수 있으므로, 이들 MAPK 신호전달 경로를 억제시키는 천연소재 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다(43). 본 연구에서 산채 혼합물을 첨가한 김치 추출물이 일반김치 추출물보다 더 효과적으로 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 사멸을 억제하였는데, 이는 산채 혼합물 첨가에 의해 항산화 효과가 증가되어 세포 내 ROS를 소거함으로써 H2O2 처리에 의해 활성화된 MAPK 신호전달 경로가 억제되어 세포 생존율을 증가시켰을 수 있다. 산채 혼합물을 첨가한 김치가 일반김치보다 더 효과적으로 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 사멸을 억제하는 기전연구는 더 수행되어야 하고 기전 연구 중의 하나로 MAPK 신호전달 경로에 대한 연구도 수행되어야 할 것이다.
- 이는 김치의 항산화 효과가 김치의 재료에서 뿐만 아니라 발효과정 중에 생성되는 발효산물에 의해 항산화 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 더덕, 잔대, 도라지 및 민들레 혼합물을 김치에 첨가하였을 때 항산화 효과가 일반 김치보다 더 뛰어났는데 이는 더덕, 잔대 및 도라지의 주요 생리활성 물질인 폴리페놀 성분 및 사포닌계 성분(13,15)과 민들레에 함유된 luteolin 등 폴리페놀 화합물 및 luteolin-7-O-glucoside 등의 flavonoid glucoside 등에 의한 것으로 추정된다(18). Luteolin과 luteolin-7-O-glucoside는 H2O2와 Aβ25-35로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 세포 생존율 증가와 ROS 생성 저해 효과를 나타냄으로써 신경세포 손상에 대하여 우수한 보호 효과가 확인되었는데(42), 본 연구에서 민들레가 포함된 산채 혼합물을 함유한 김치 추출물이 신경세포 내 ROS 생성을 저해한 것은 민들레에 함유된 luteolin과 luteolin-7-O-glucoside가 주요한 역할을 하였을 것이라 추정할 수 있고, 산채 혼합물 함유 김치는 세포 내 ROS 소거작용뿐만 아니라 산화적 스트레스 상태에서 세포 생존율도 증가시킬 수 있을 것이라는 가능성을 증가시켜 주었다.
- 2에서는 낮은 아질산염 소거 작용을 나타내었다고 보고하였는데 본 연구 결과와 유사하였다. 산수유의 에탄올 추출물도 본 연구 결과와 유사하게 pH가 낮은 산성조건일수록 아질산염 소거 작용이 우수하였으며, pH 1.2에서는 90% 이상 아질산염 소거 활성이 있었고 이는 1% ascorbic acid의 아질산염 소거 작용보다 높았다(29). pH 1.
- 산채 혼합물 첨가에 의해 건강 기능성이 증가되었지만 소비자의 입맛에는 큰 영향을 미치지 않았으므로 건강 기능성이 더해진 김치로 제품화하여 산업화가 가능할 것이라는 것을 추정할 수 있었다. 본 연구에서 소비자 입맛에 맞으면서 건강유익성이 증가된 김치를 개발하였고, 계속되어지는 연구에서 아질산염 소거 작용에 의한 니트로사민 생성 억제 효과를 가지고 있다는 것을 증명한다면 개발된 김치의 항산화 및 뇌신경세포 사멸 억제 효과뿐만 아니라 암을 예방하는 기능도 추가될 것으로 생각된다.
- 산채 혼합물을 첨가한 김치는 숙성이 진행됨에 따라 pH는 낮아지고 산도는 증가하는 일반김치와 발효 양상은 유사하였으나, 산채 혼합 추출물 및 분말이 함유한 김치인 MWV는 산채가 함유되어 있지 않은 일반 김치 NK보다 발효 숙성 7일째 pH는 유의적으로 감소하였고(Fig. 1A) 산도는 유의적으로 증가하였다(Fig. 1B). 수산물을 첨가한 김치의 pH가 무첨가 김치에 비해 완만하게 변화하는 것은 수산물에 함유된 단백질의 완충 효과 때문이라 알려져 있고(33), Ku 등(27)은 발효 10일에 일반김치보다 인삼 첨가 김치가 pH 감소 효과 및 산도 증가 효과가 있었다고 하였는데 본 연구결과와 유사하였다.
- 모델계와 배추에 함유된 아질산염에 대한 9종류 산채들의 아질산염 소거 작용 및 아질산염 소거 작용을 가진 산채들의 혼합물을 함유한 김치(MWV)의 뇌신경세포 사멸 억제 효과에 대해 연구하였다. 아질산염 소거 작용은 모든 시료에서 pH 4.2에서보다 pH 1.2에서 높았고, 다래순 추출물과 참취 추출물(AS)은 pH 1.2에서 90% 이상 아질산염 소거 작용을 나타내었다. AS, 더덕, 잔대, 도라지및 민들레 추출물들(CL, AT, PG, TO)은 pH 4.
- 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid는 125~1,000 μg/mL에서는 100%에 가까운 아질산염 소거 작용을 나타내었고, 모든 농도에서 시료 처리군보다 높은 아질산염 소거작용을 나타내었다(Table 3).
- 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid보다 낮았지만 1,000 μg/mL에서 잔대와 민들레 추출물들(AT, TO)의 아질산염 소거 작용은 67.3%와 67.0%였고, 더덕과 도라지 추출물들(CL, PG)도 45.4%와 44.9%였다.
- 김치 추출물은 우수한 DPPH와 OH· 라디칼 소거 작용을 나타내었고(40) 김치의 항산화 효과는 발효에 의해 증대되며, 특히 적당히 익은 상태의 김치가 덜 익은 상태의 김치보다 더욱 항산화 효과가 뛰어났다(41). 이는 김치의 항산화 효과가 김치의 재료에서 뿐만 아니라 발효과정 중에 생성되는 발효산물에 의해 항산화 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 더덕, 잔대, 도라지 및 민들레 혼합물을 김치에 첨가하였을 때 항산화 효과가 일반 김치보다 더 뛰어났는데 이는 더덕, 잔대 및 도라지의 주요 생리활성 물질인 폴리페놀 성분 및 사포닌계 성분(13,15)과 민들레에 함유된 luteolin 등 폴리페놀 화합물 및 luteolin-7-O-glucoside 등의 flavonoid glucoside 등에 의한 것으로 추정된다(18).
후속연구
- 2에서 아질산염 소거 작용이 높은 천연소재들은 위 내에서 아질산염이 아민류와 반응하여 내인성 니트로사민 생성을 억제할 수 있으므로 암의 위험성을 줄여줄 수 있을 것이다. 따라서 pH 1.2에서 높은 아질산염 소거 작용을 가진 민들레, 다래순, 곤드레, 누룩치, 참취 및 산마늘은 섭취했을 때 내인성 니트로사민 생성 가능성이 높고 간식 등으로 소량 단독 섭취가 가능하여 위 내에서 pH 조건인 pH 1.2의 변화를 적게 할 수 있는 음식 제조할 때 다양한 방식으로 첨가하는 것을 고려해 볼 수 있을 것이다. 예를 들어 니트로사민 생성 가능성이 높으면서 단독 간식으로 섭취 가능한 소시지 등에 이들 추출물을 첨가함으로써 니트로사민 생성을 억제할 뿐만 아니라 다양한 건강 증진 효과를 가진 소시지 개발이 가능할 것이라 생각된다.
- 본 연구 결과 천연소재에 의해 배추에 함유된 아질산염을 효과적으로 소거하여 니트로사민 생성을 억제할 수 있을 것이라는 것을 예상할 수 있었기 때문에 전통 김치 제조 방법을 일부 변형하여 니트로사민 생성 억제가 가능하고 더하여 대중화가 가능한 김치를 개발 중에 있다. 즉 김치 제조 시 김치 양념에 첨가하는 파, 양파, 생강, 마늘 등 김치의 부재료를 이용한 NaNO2 및 배추 추출물에 함유된 아질산염을 이용한 모델계 실험뿐만 아니라 이들 부재료에 의한 김치 내 아질산염 소거 작용 및 니트로사민 생성에 미치는 영향은 연구 중에 있다.
- 산채 혼합물 첨가에 의해 건강 기능성이 증가되었지만 소비자의 입맛에는 큰 영향을 미치지 않았으므로 건강 기능성이 더해진 김치로 제품화하여 산업화가 가능할 것이라는 것을 추정할 수 있었다. 본 연구에서 소비자 입맛에 맞으면서 건강유익성이 증가된 김치를 개발하였고, 계속되어지는 연구에서 아질산염 소거 작용에 의한 니트로사민 생성 억제 효과를 가지고 있다는 것을 증명한다면 개발된 김치의 항산화 및 뇌신경세포 사멸 억제 효과뿐만 아니라 암을 예방하는 기능도 추가될 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 산채 혼합물을 첨가한 김치 추출물이 일반김치 추출물보다 더 효과적으로 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 사멸을 억제하였는데, 이는 산채 혼합물 첨가에 의해 항산화 효과가 증가되어 세포 내 ROS를 소거함으로써 H2O2 처리에 의해 활성화된 MAPK 신호전달 경로가 억제되어 세포 생존율을 증가시켰을 수 있다. 산채 혼합물을 첨가한 김치가 일반김치보다 더 효과적으로 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 사멸을 억제하는 기전연구는 더 수행되어야 하고 기전 연구 중의 하나로 MAPK 신호전달 경로에 대한 연구도 수행되어야 할 것이다.
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