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문제 정의
- 본 실험에서는 누에 피브로인 L-chain 유전자의 인트론 영역을 사용하여 우리나라에서 보존하고 있는 누에 계통 중 원산지별 누에 계통 8개를 대상으로 계통 간 유전자 다형성을 비교하였다. 실험 결과, 실험에 사용한 누에 계통에 따라서 동일한 계통 내 모든 개체에서 FibL1과 FibL2의 유전자다형성 조합이 일정하게 유지되어 있었으며, 계통 간에는 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴 조합이 다소 상이한 것으로 확인되었다.
- 2003). 본 연구는 선행 연구에서 확인된 피브로인 L-chain 유전자의 다형성 염기서열 영역을 표적으로 서로 다른 10종의 누에 계통에 대해서 확인함으로서 이를 누에 계통 판별을 위한 유전자 마커로서의 활용 가능성 여부를 검증하고자 하였다.
- 1995, Schaeffer and Miller 1993). 본 연구에서는 선행 연구에서 확인된 피브로인 L-chain 유전자의 염기서열 다형성 영역을 활용하여 누에 계통 구분을 위한 유전자 마커로서의 활용 가능성을 검증하고자 하였다.
제안 방법
- 각 프라이머 을 사용하여 PCR 후 전기영동한 PCR 증폭산물은 그 크기를 측정한 다음 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)을 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 PCR 증폭산물을 순수 정제하였다. 정제된 PCR 증폭산물은 pGEMT easy vector(Promega)에 클로닝하고 pGEM-T easy vector에 포함된 T7 및 SP6 프라이머와 CEQ 8000 Genetic Analysis System(Beckman caulter, USA)를 사용하여 제조사 방법에 따라 염기서열을 분석하였다.
- 공시된 각각의 누에 계통을 대상으로 피브로인 L-chain 유전자 다형성을 분석하기 위해 액체질소에서 마쇄하여 보관중인 각각의 시료를 Wizard genomic DNA purification Kit(Promega)을 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 게놈 유전자를 순수 분리하여 PCR 실험 때 까지 −80oC에 동결 보관하였다.
- 두개 프라이머 을 사용한 PCR 조건은 1×(95℃ 5분), 30×(94oC 1분, 54oC 1분, 72oC 2분)이며, GeneAmp PCR System 2400(Perkin Elmer)로 PCR 실시 후 1.2% agarose gel 전기영동 후 개체 간 PCR 증폭 산물의 다형성을 확인하였다.
- 본 실험에서는 우리나라가 보존하고 있는 누에 계통 중 원산지별 다양한 누에 계통을 대상으로 누에 피브로인 Lchain 유전자의 인트론 영역을 사용하여 계통 간 유전자 다형성을 비교 분석하였다. 실험 결과, 실험에 사용된 누에 계통에 따라서 동일한 계통 내 모든 개체에서 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴 조합이 일정하게 유지되어 있었으며, 계통 간에는 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴의 조합이 상이한 것으로 확인되었다.
- 분리된 개체별 게놈 유전자 0.5 μg씩을 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하고 피브로인 L-chain 유전자의 2 ~ 3번 인트론 영역 및 6번 인트론 영역을 증폭할 수 있는 특이 프라이머 FibL1과 FibL2를 사용하여 각각 PCR 한 후 얻어진 PCR 산물의 염기서열에 대한 다형성 여부를 비교, 분석하였다.
- 제작된 프라이머 FibL1과 FibL2를 사용하여 누에 계통별 순수 분리한 게놈 유전자를 주형으로 각각 PCR을 수행한 결과, 프라이머 FibL1로부터 얻은 PCR 증폭산물은 각각 두 가지 형태의 밴드가 확인되었고, 프라이머 FibL2를 사용하여 얻은 PCR 증폭산물은 세 가지 크기의 밴드가 확인되었다(그림 1). 실험에 사용한 모든 개체로부터 확보한 PCR 증폭산물은 순수정제한 후 pGEM-T easy vector 에 클로닝하여 T7 및 SP6 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하고 염기서열 상동성에 조사하였다. 프라이머 FibL1과 FibL2에 의해 얻은 각각의 PCR 증폭산물의 염기서열 분석 결과, 프라이머 FibL1에서는 696bp(A형)와 681bp(B형)의 두 가지 형태의 유전자형이 확인되었고, 프라이머 FibL2를 사용한 실험에서는 427 bp(A형), 385 bp(B형), 403 bp(C형)의 세 가지 형태의 유전자형이 3가지로 구분할 수 있었다(표 2).
- 우선, 국립농업과학원 잠사양봉소재과에서 사육중인 누에 유전자원 중 유럽종, 중국종, 일본종 및 열대종에 속하는 각각 2개의 계통을 사육하여 계통별 무작위로 선발한 5령 누에 각 5개체씩으로부터 게놈 유전자를 순수 분리하였다. 분리된 개체별 게놈 유전자 0.
- 각 프라이머 을 사용하여 PCR 후 전기영동한 PCR 증폭산물은 그 크기를 측정한 다음 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)을 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 PCR 증폭산물을 순수 정제하였다. 정제된 PCR 증폭산물은 pGEMT easy vector(Promega)에 클로닝하고 pGEM-T easy vector에 포함된 T7 및 SP6 프라이머와 CEQ 8000 Genetic Analysis System(Beckman caulter, USA)를 사용하여 제조사 방법에 따라 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 국립농업과학원이 보유하고 있는 누에 유전자원 중 유럽(Q, PK), 중국(C26, C31), 일본(N15, N9) 및 열대(SA2, SA5)의 8개 누에 계통을 구분하여 사육한 후 5령 누에 개체별로 액체질소에 마쇄하여 실험 때까지 −80oC에 동결 보관하였다.
- 5 μg씩을 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하고 피브로인 L-chain 유전자의 2 ~ 3번 인트론 영역 및 6번 인트론 영역을 증폭할 수 있는 특이 프라이머 FibL1과 FibL2를 사용하여 각각 PCR 한 후 얻어진 PCR 산물의 염기서열에 대한 다형성 여부를 비교, 분석하였다. 다형성 분석을 위한 특이 프라이머 FibL1과 FibL2의 염기서열 정보는 선행 연구를 통해 국제유전자은행에 등록한 누에 피브로인 L-chain 유전자 정보(GenBank accession number AF541967)를 바탕으로 각각 제작하였다(표 1).
데이터처리
- 분석된 개체별 PCR 증폭산물 염기서열 정보는 multiple sequence alignment CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)를 활용하여 유전자 상동성을 분석한 후 다형성이 확인된 그룹 간 유전적 근연관계 분석을 위해 분석엔진(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/phylogeny.html)을 활용하여 계통수(phylogeny tree) 분석을 실시하였다.
성능/효과
-
Table 2. Genetic polymorphisms of several silkworm races by using primer sets, FibL1 and FibL2
FibL1에서의 유전자 다형성 분석 결과, A형과 B형에서는 인트론 영역에서 15개의 염기서열에서 deletion 및 point mutation이 있음이 확인되었고, FibL2에서는 모두 42개 염기서열에서 deletion 및 point mutation이 확인되었다(그림 2, 3)
. 또한 분석에 사용된 모든 개체에서 동일 계통 내 개체 간 변이는 없었으나, 계통 간에는 유전자 다형성 조합이 다소 차별화 되는 것으로 확인되었다. - FibL1에서의 유전자 다형성 분석 결과, A형과 B형에서는 인트론 영역에서 15개의 염기서열에서 deletion 및 point mutation이 있음이 확인되었고, FibL2에서는 모두 42개 염기서열에서 deletion 및 point mutation이 확인되었다(그림 2, 3). 또한 분석에 사용된 모든 개체에서 동일 계통 내 개체 간 변이는 없었으나, 계통 간에는 유전자 다형성 조합이 다소 차별화 되는 것으로 확인되었다. 따라서 프라이머 FibL1과 FibL2에 의한 유전자 다형성 조합은 특정 누에 계통 간 유전적으로 차별화된 지표로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는 우리나라가 보존하고 있는 누에 계통 중 원산지별 다양한 누에 계통을 대상으로 누에 피브로인 Lchain 유전자의 인트론 영역을 사용하여 계통 간 유전자 다형성을 비교 분석하였다. 실험 결과, 실험에 사용된 누에 계통에 따라서 동일한 계통 내 모든 개체에서 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴 조합이 일정하게 유지되어 있었으며, 계통 간에는 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴의 조합이 상이한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 실험에서 확인한 피브로인 유전자 다형성 특이 프라이머 FibL1과 FibL2를 사용하여 해당 염기서열 정보를 분석한다면, 누에 계통 간 특성을 구분하는 간편한 방법으로 활용할 수 있을 것으로 사료되며, 누에 생체를 가공한 제품의 원재료 분석을 위한 유전자 지표로도 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는 누에 피브로인 L-chain 유전자의 인트론 영역을 사용하여 우리나라에서 보존하고 있는 누에 계통 중 원산지별 누에 계통 8개를 대상으로 계통 간 유전자 다형성을 비교하였다. 실험 결과, 실험에 사용한 누에 계통에 따라서 동일한 계통 내 모든 개체에서 FibL1과 FibL2의 유전자다형성 조합이 일정하게 유지되어 있었으며, 계통 간에는 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴 조합이 다소 상이한 것으로 확인되었다. 따라서, 프라이머 FibL1와 FibL2에 의한 피브로인 L-chain 유전자 다형성 염기서열 정보를 활용한다면 제한된 영역에서 누에 계통 구분을 위한 지표로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 제작된 프라이머 FibL1과 FibL2를 사용하여 누에 계통별 순수 분리한 게놈 유전자를 주형으로 각각 PCR을 수행한 결과, 프라이머 FibL1로부터 얻은 PCR 증폭산물은 각각 두 가지 형태의 밴드가 확인되었고, 프라이머 FibL2를 사용하여 얻은 PCR 증폭산물은 세 가지 크기의 밴드가 확인되었다(그림 1). 실험에 사용한 모든 개체로부터 확보한 PCR 증폭산물은 순수정제한 후 pGEM-T easy vector 에 클로닝하여 T7 및 SP6 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하고 염기서열 상동성에 조사하였다.
- 실험에 사용한 모든 개체로부터 확보한 PCR 증폭산물은 순수정제한 후 pGEM-T easy vector 에 클로닝하여 T7 및 SP6 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하고 염기서열 상동성에 조사하였다. 프라이머 FibL1과 FibL2에 의해 얻은 각각의 PCR 증폭산물의 염기서열 분석 결과, 프라이머 FibL1에서는 696bp(A형)와 681bp(B형)의 두 가지 형태의 유전자형이 확인되었고, 프라이머 FibL2를 사용한 실험에서는 427 bp(A형), 385 bp(B형), 403 bp(C형)의 세 가지 형태의 유전자형이 3가지로 구분할 수 있었다(표 2).
후속연구
- 따라서 프라이머 FibL1과 FibL2에 의한 유전자 다형성 조합은 특정 누에 계통 간 유전적으로 차별화된 지표로 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 게다가 프라이머 FibL1와 FibL2에서 얻은 다형성 유전자 정보를 바탕으로 계통수(phylogenetic tree) 분석법으로 유전적 근연관계를 분석한 결과, FibL2 영역에서는 염기서열 다형성 A형과 B형이 C형 보다 유전적으로 근연관계가 있는 것으로 추정할 수 있어(그림 4), 누에 계통 간 진화적 유전관계 연구를 위한 기초자료로도 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 분석에 사용된 모든 개체에서 동일 계통 내 개체 간 변이는 없었으나, 계통 간에는 유전자 다형성 조합이 다소 차별화 되는 것으로 확인되었다. 따라서 프라이머 FibL1과 FibL2에 의한 유전자 다형성 조합은 특정 누에 계통 간 유전적으로 차별화된 지표로 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 게다가 프라이머 FibL1와 FibL2에서 얻은 다형성 유전자 정보를 바탕으로 계통수(phylogenetic tree) 분석법으로 유전적 근연관계를 분석한 결과, FibL2 영역에서는 염기서열 다형성 A형과 B형이 C형 보다 유전적으로 근연관계가 있는 것으로 추정할 수 있어(그림 4), 누에 계통 간 진화적 유전관계 연구를 위한 기초자료로도 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 2003). 따라서 피브로인 유전자 인트론 영역의 구조와 누에고치의 성상 등과의 연관 관계가 구명된다면, 인트론 영역의 중요한 생물학적 기능이 부가적으로 해명될 것으로 기대된다.
- 실험 결과, 실험에 사용된 누에 계통에 따라서 동일한 계통 내 모든 개체에서 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴 조합이 일정하게 유지되어 있었으며, 계통 간에는 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴의 조합이 상이한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 실험에서 확인한 피브로인 유전자 다형성 특이 프라이머 FibL1과 FibL2를 사용하여 해당 염기서열 정보를 분석한다면, 누에 계통 간 특성을 구분하는 간편한 방법으로 활용할 수 있을 것으로 사료되며, 누에 생체를 가공한 제품의 원재료 분석을 위한 유전자 지표로도 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 이전 연구에서 누에 모본과 이들이 생산하는 교잡종의 고치 모양이 피브로인 L-chain 유전자의 인트론 염기서열의 다형성 영역이 영향을 미치는 것으로 추정된 바 있다(Choi et al.
- 실험 결과, 실험에 사용한 누에 계통에 따라서 동일한 계통 내 모든 개체에서 FibL1과 FibL2의 유전자다형성 조합이 일정하게 유지되어 있었으며, 계통 간에는 FibL1과 FibL2의 유전자 다형성 패턴 조합이 다소 상이한 것으로 확인되었다. 따라서, 프라이머 FibL1와 FibL2에 의한 피브로인 L-chain 유전자 다형성 염기서열 정보를 활용한다면 제한된 영역에서 누에 계통 구분을 위한 지표로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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