[논문]HCT116 대장암세포에서 Akt-mTOR 신호경로를 통한 개똥쑥 추출물 (AAE)의 세포주기 억제 효과

김보민; 김근태; 임은경; 김은지; 김상용; 하성호; 김영민

doi:10.7841/ksbbj.2015.30.5.223

HCT116 대장암세포에서 Akt-mTOR 신호경로를 통한 개똥쑥 추출물 (AAE)의 세포주기 억제 효과
Cell Cycle Arrest of Extract from Artemisia annua Linné. Via Akt-mTOR Signaling Pathway in HCT116 Colon Cancer Cells 원문보기

KSBB Journal, v.30 no.5, 2015년, pp.223 - 229

김보민 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 김근태 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 임은경 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 김은지 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 김상용 ((주)바이오엔진) , 하성호 (한남대학교 생명나노과학대학 화학공학과) , 김영민 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과)

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, extract from Artemisia annua in L. (AAE) is known as a medicinal herb that is effective against cancer. The cell cycle is regulated by the activation of cyclin-dependent kinase (CDK)/cyclin complex. We will focus on regulation of CDK2 by cyclin E. cyclin E is associated with CDK2 to regulate progression from G1 into S phase. Akt is known to play an important role in cell proliferation and cell survival. Activation of Akt increases mTOR activity that promotes cell proliferation and cancer growth. In this study, we investigated that AAE-induced cell cycle arrest at G1/S phase in HCT116 colon cancer. Treatment of AAE shows that reduced activation of Akt decreases mTOR/Mdm2 activity and then leads to increase the activation of p53. The active p53 promotes activation of p21. p21 induces inactivation of CDK2/cyclin E complex and occurs cell cycle arrest at G1/S phase. We treated LY294002 (Akt inhibitor) and Rapamycin (mTOR inhibitor) to know the relationship between the signal transduction of proteins associated with cell cycle arrest. These results suggest that AAE induces cell cycle arrest at G1/S phase by Akt/mTOR pathway in HCT116 colon cancer cell.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 HCT116 대장암세포에 AAE를 처리 했을 때, 세포주기 억제에 의한 HCT116 대장암세포의 증식이 억제되는지 확인하고자 하였다. 또한 이러한 효과에 있어서 AAE의 처리에 따른 Akt-mTOR 신호경로의 저해와 TSC2, Mdm2, p53, p21, CDK2/cyclin E 단백질간의 상관관계를 알아보고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 HCT116 대장암세포에 AAE를 처리 했을 때, 세포주기 억제에 의한 HCT116 대장암세포의 증식이 억제되는지 확인하고자 하였다. 또한 이러한 효과에 있어서 AAE의 처리에 따른 Akt-mTOR 신호경로의 저해와 TSC2, Mdm2, p53, p21, CDK2/cyclin E 단백질간의 상관관계를 알아보고자 하였다.

제안 방법

Western blotting을 이용하여 AAE가 세포 내 신호경로 조절을 통해 세포주기를 촉진하는 단백질들의 활성을 감소시키고 세포주기 정지를 촉진하는 단백질들의 활성을 증가시켜 세포주기 정지가 일어남을 확인하였다. 그리고 세포증식과 관련된 단백질인 Akt/mTOR의 저해제인 LY294002 /Rapamycin과 AAE를 단독 혹은 병행 처리하여 MTT assay, Wound healing, FACS, Western blotting을 실시하였다. 단독으로 처리했을 때보다 병행처리했을 때 효과가 더 크게 나타난 것으로 보아 AAE가 세포성장에 관여하는 Akt/mTOR pathway를 억제함으로써 HCT116 대장암세포의 증식 억제에 효과가 있다는 것을 확인하였다.
최근에는 천연추출물이 세포주기 정지를 통해 여러 암세포의 성장을 억제하여 암 예방 및 치료 연구에 사용되고 있다 [4,5]. 본 연구에서는 HCT116 대장암세포에 AAE를 처리 했을 때 암세포의 성장과 관련된 단백질들의 발현 양상과 활성, 그리고 단백질들간의 조절관계를 확인하여 암세포의 세포주기 억제효과를 확인하였다. MTT assay와 Wound healing assay를 통해 AAE 처리에 따른 세포 생존율과 증식률의 억제를 확인하였고 세포주기 G1기의 정지에 의한 것임을 FACS를 통해 확인하였다.

대상 데이터

본 실험에서 사용된 HCT116 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS (Hyclone, LaboratorisInc, Logan, UT, USA)와 1% antibiotics (Hyclone, LaboratorisInc, Logan, UT, USA)가 포함된 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하였고 Fibroblast 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며 10% FBS와 1% antibiotics가 포함된 DMEM (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA) 배지를 사용하여 5% CO₂, 37^oC조건하에 배양하였다. 매 48시간 마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc.
본 실험에서 사용된 개똥쑥은 대전 한약재시장에서 구입하여 개똥쑥 분쇄가루 250 g에 에탄올 200 mL을 가하여 72시간 동안 상온에서 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 AAE를 감압농축기를 이용하여 감압 농축과정을 거친 뒤 100 mg/mL stock으로 만들어 -20^oC에 보관하여 사용하였고, 이때 수득률은 0.

데이터처리

통계 프로그램인 SPSS 22.0을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산분석은 t-test를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.

성능/효과

그리고 세포증식과 관련된 단백질인 Akt/mTOR의 저해제인 LY294002 /Rapamycin과 AAE를 단독 혹은 병행 처리하여 MTT assay, Wound healing, FACS, Western blotting을 실시하였다. 단독으로 처리했을 때보다 병행처리했을 때 효과가 더 크게 나타난 것으로 보아 AAE가 세포성장에 관여하는 Akt/mTOR pathway를 억제함으로써 HCT116 대장암세포의 증식 억제에 효과가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구결과 AAE에 의한 Akt, mTOR 억제는 p53, p21 활성의 증가, CDK2/cyclin E 복합체의 활성이 감소함에 따라 세포주기 G1의 정지를 유도하는 것으로 확인되었고 sub-G1기에 존재하는 세포 비율의 증가로 보아 apoptosis가 유발됨을 확인하였다.
단독으로 처리했을 때보다 병행처리했을 때 효과가 더 크게 나타난 것으로 보아 AAE가 세포성장에 관여하는 Akt/mTOR pathway를 억제함으로써 HCT116 대장암세포의 증식 억제에 효과가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구결과 AAE에 의한 Akt, mTOR 억제는 p53, p21 활성의 증가, CDK2/cyclin E 복합체의 활성이 감소함에 따라 세포주기 G1의 정지를 유도하는 것으로 확인되었고 sub-G1기에 존재하는 세포 비율의 증가로 보아 apoptosis가 유발됨을 확인하였다. 하지만 apoptosis의 유발이 세포주기 G1기의 정지에 의한 것이라는 것을 증명하기 위해서는 apoptosis에 대한 연구가 필요할 것이다.

후속연구

하지만 apoptosis의 유발이 세포주기 G1기의 정지에 의한 것이라는 것을 증명하기 위해서는 apoptosis에 대한 연구가 필요할 것이다. 그리고 Akt와 mTOR의 저해는 암 억제에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 암 예방과 치료연구에 있어서 향후 더 진행되어야 할 연구 과제로 여겨진다.
따라서 본 연구결과 AAE에 의한 Akt, mTOR 억제는 p53, p21 활성의 증가, CDK2/cyclin E 복합체의 활성이 감소함에 따라 세포주기 G1의 정지를 유도하는 것으로 확인되었고 sub-G1기에 존재하는 세포 비율의 증가로 보아 apoptosis가 유발됨을 확인하였다. 하지만 apoptosis의 유발이 세포주기 G1기의 정지에 의한 것이라는 것을 증명하기 위해서는 apoptosis에 대한 연구가 필요할 것이다. 그리고 Akt와 mTOR의 저해는 암 억제에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 암 예방과 치료연구에 있어서 향후 더 진행되어야 할 연구 과제로 여겨진다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Akt/ mTOR/Mdm2 신호조절이 대장암치료에 중요한 신호분자로 작용할 수 있는 이유는 무엇인가?	Protein kinase B (PKB)라 불리는 Akt는 serin/threonine kinase로 Akt 활성은 다른 단백질을 인산화 시킴으로써 세포주기조절, 세포의 생존, 대사를 촉진한다. 이러한 Akt 신호경로의 조절은 비정상적인 암세포의 증식을 억제하는데 큰 역할을 한다 [9]. Akt는 Tuberous Sclerosis Complex 2 (TSC2)를 인산화시켜 Mammalian target of rapamycin (mTOR)을 활성화시키는데 mTOR는 세포의 성장, 증식을 조절하는 중요 조절자로써 종양형성에 관여한다. Murine Double Minute 2 (MDM2)는 세포의 성장에 관여하는 것으로 Akt와 mTOR의 활성이 증감함에 따라 활성을 가지게 된다. Akt에 의해 ser166위치에서 인산화된 Mdm2는 p53의 전사활성 (transactivation) 부위에 결합하여 p53의 ubiquitination한다. 그러므로 Akt/ mTOR/Mdm2 신호조절이 대장암치료에 중요한 신호분자로 작용할 수 있음을 보여준다 [10-12].
	개똥쑥은 무엇인가?	개똥쑥 (Artemisia annua L.)은 국화과 (Compositae)에 속하는 일년생 초본으로 전국 각지의 길가나 들판뿐만 아니라 여러 나라에서도 볼 수 있고, 오래 전부터 말라리아 치료제로 이용되어 왔으며 항암 활성이 높다는 것이 알려짐으로써 세계적으로 주목 받고 있다 [4,5].
	현재 대장암 치료는 어떻게 진행되는가?	대장암은 매년 환자수가 증가하고 있는 암으로 대장암의 발생률은 서구화된 식습관으로 인해 더욱 높아지고 있으며 남녀 전체 암 발생의 3위를 차지하고 있다 [1]. 대장암 치료의 기본은 수술이며 수술로 완치가 불가능한 경우 항암 화학요법 등이 사용되고 있으나 부작용을 초래하는 문제점이 제시 되고 있다 [2,3]. 이로 인해 여러 가지 천연 추출물들을 이용한 암 예방 및 치료에 관한 연구가 활발이 이루어지고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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