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문제 정의
- [5]. 따라서, 본 실험에서는 제주 재래종 감귤 2종 용매분획물의 항산화 및 항염증 효과를 검증하여 천연물 유래 소재로써의 가능성을 확인하고자 수행하였다.
제안 방법
- 5×106 cells/ml)을 24시간 배양 후, LPS를 1 μg/ml로 처리하여 cytokine 생성을 자극하고 동시에 홍귤, 편귤의 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리하였다. 24시간 배양 후상 등액을 취하여, 각각 BD Bioscience사(CA, USA) 의 mouse IL-6 ELISA kit를 사용하여 정량하였다.
- 1차 항체인 NOS2, COX-2 및 β-actin과 2차 항체인 HRP가 결합된 an- ti-rabbit IgG는 모두 Santa Cruz Biotechnology사의 제품을 사용하였다. ECL 기질(West-zol, Intron biotechnology, Gyeonggi-do, Korea)과 반응시킨 후, Chemidoc (Fusion solo, VILBER LOURMAT, Deutschland, Germany)을 이용하여 각각의 단백질 발현 정도를 분석하였다.
- 여기에 Folin-ciocalteus' phenol reagent 100 μl를 첨가하여 실온에서 약 3분간 반응시키고, Na2CO3 용액(7%, w/v) 200 μl를 가하여 혼합한 후 증류수 700 μl를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. UV-Spectro- photometer (Molecular devices, SpectraMax M2, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 720 nm에서 흡광도 측정을 통해 분석 되었으며, 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 작성한 표준검정 곡선을 통해 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.
- Louis, Mis- souri, USA) 200 μl를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 for- mazan 침전 물을 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 생장 억제 정도를 조사하였다.
- 각 품종별과 피추출물은 과피 추출물은 과피 건 조 분말 20 g에 70% 메탄올 1 l를 가하여 3시간씩 3회 추출한 다음 추출액을 여과한 후 감압농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거하였고 동결건조하여 추출 수율을 측정하였다. 동결건조물 일정량을 취하여 증류수 1 l로 재용해하여 hexane (1 l×3회), ethyl acetate (1 l×3회)와 butanol (1 l×3회)을 순차적으로 가하여 분획물을 얻었고 최종 남은 용액을 물 분획물이 라 칭하였으며, 이 분획 물들은 감압 농축 한 후 동결건조하여 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- [16]. 따라서 LPS로 유도되어진 Raw 264.7 cell에서 iNOS, COX-2 protein 발 현량의 감소에 의해 항염증 효과를 기대할 수 있기 때문에 홍귤, 편귤에틸아세테이트 분획물이 iNOS, COX-2 protein 발현 저해 효과가 있는지를 알아보기 위해 western blotting으로 두 단백질의 발현 변화를 확인하였다 (Fig. 5). LPS 비처리군은 두 단백질 모두 거의 발현되지 않은 반면 LPS 처리군에서는 발현이 현저히 증가됨을 확인하였고, 홍귤, 편귤 에틸아세테이트 분획물 처리로 농도의존적으로 iNOS, COX-2 단백질 발현이 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
- MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)분석은 탈수소효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색의 formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험 방법 중 하나로 살아있는 세포수에 비례해서 흡광도를 나타낸다 [3]. 부탄올 분획물은 배당체 등 극성이 큰 물질들이 많이 함유되어 있어 추후 유효성분들을 분리 및 정제하여 신소재로 사용하고자 할 때 어려움이 따르므로 부탄올 분 획물 다음으로 활성이 좋았던 에틸아세테이트 분획물을 시료로 사용하여 항염증 효능을 측정하였다. 홍귤, 편귤에틸아세테이트 분획물의 세포독성을 측정한 결과(Fig.
- 5×106 cells/ml)을 18시간 전 배양 후, 홍귤, 편귤의 에틸아세테이트 분획물과 LPS (1 μg/ml)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 - 형태로 측정하였다. 세포배양상등액 100 μl와 Griess 시약[1%(w/v) sulfanila- mide, 0.
대상 데이터
- 동일한 양의 단백질(20 μg/sample)을 SDS-PAGE (polyacry-lamide gel electrophoresis)로 전기영동한 후, gel transfer de- vice (iBlot®, Life technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 PVDF membrane으로 단백질을 transfer하였다. 1차 항체인 NOS2, COX-2 및 β-actin과 2차 항체인 HRP가 결합된 an- ti-rabbit IgG는 모두 Santa Cruz Biotechnology사의 제품을 사용하였다. ECL 기질(West-zol, Intron biotechnology, Gyeonggi-do, Korea)과 반응시킨 후, Chemidoc (Fusion solo, VILBER LOURMAT, Deutschland, Germany)을 이용하여 각각의 단백질 발현 정도를 분석하였다.
- 7은 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양받아 1% Penicillin-streptomy- cin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양 하였다. Lipopoly-saccharide (LPS, E. coli sero- type 0111:B4)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Murine macrophage cell line인 Raw 264.7은 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양받아 1% Penicillin-streptomy- cin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양 하였다. Lipopoly-saccharide (LPS, E.
- 각 품종별과 피추출물은 과피 추출물은 과피 건 조 분말 20 g에 70% 메탄올 1 l를 가하여 3시간씩 3회 추출한 다음 추출액을 여과한 후 감압농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거하였고 동결건조하여 추출 수율을 측정하였다. 동결건조물 일정량을 취하여 증류수 1 l로 재용해하여 hexane (1 l×3회), ethyl acetate (1 l×3회)와 butanol (1 l×3회)을 순차적으로 가하여 분획물을 얻었고 최종 남은 용액을 물 분획물이 라 칭하였으며, 이 분획 물들은 감압 농축 한 후 동결건조하여 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 추출 수율은 n-hexane 분획물(홍귤2.
- 본 실험에 사용된 감귤 품종은 제주 재래 감귤 '홍귤' (Hongkyool, C. tachibana Tanaka) 및 '편귤'(Pyunkyool, C. tangerina Hort ex Tanaka)로 제주특별자치도 서귀포시 감귤연구소 포장에서 재배된 과실을 2014년 9월 16일에 수확하여 사용하였다. 수확한 과실은 선별 및 세척 후과피와 과육을 분리하고, 과피를 60℃ 건조기에서 12~48시간 건조시킨 후 분쇄하여 사용하였다.
데이터처리
- 2, Cary, NC, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타냈다. 각 실험군의 유의적 차이가 있는 항목은 Duncan's Multiple Range Test에 의하여p<0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.
- 모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며 실험 결과는 SAS package (version 9.2, Cary, NC, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타냈다. 각 실험군의 유의적 차이가 있는 항목은 Duncan's Multiple Range Test에 의하여p<0.
이론/모형
- ABTS radical 소거활성은 Pellegrini 등의 방법[17]에 따라 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 7.
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis [4]을 이용하여 비색 정량하였다. 추출물 100 μl에 증류수 900 μl를 넣어 total vol- ume이 1 ml가 되도록 희석하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법[15]을 이용하여 비색 정량하였다. 추출물 15 μl에 diethylene glycol 150 μl, 1 N NaOH 15 μl를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 1시간 반응시키고 UV-Spectrophotometer를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 항산화 활성은 변형된 Blois 등의 방법[1]을 이용하여 DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) free radical에 대한 전자공여 능(Electron donating ability, EDA)을 측정하였다. 추출물의 전자공여능 측정을 위해, 시료 20 μl에 0.
- 홍귤, 편귤과피 분획물의 세포독성을 측정하기 위해 Raw 264.7 macrophage의 세포 생존율을 MTT assay로 분석하였다. MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)분석은 탈수소효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색의 formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험 방법 중 하나로 살아있는 세포수에 비례해서 흡광도를 나타낸다 [3].
성능/효과
- 5). LPS 비처리군은 두 단백질 모두 거의 발현되지 않은 반면 LPS 처리군에서는 발현이 현저히 증가됨을 확인하였고, 홍귤, 편귤 에틸아세테이트 분획물 처리로 농도의존적으로 iNOS, COX-2 단백질 발현이 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 홍귤에틸아세테이트 분획물 100 μg/ml 농도 처리 시 염증 억제 작용이 탁월할 것으로 생각된다.
- [7]. 대장균 lipopolysaccharide (LPS)를 대식 세포에 처리하여 nitric oxide (NO)를 유도시킨 후 홍귤, 편귤의 에틸아세테이트 분획물을 대식 세포에 처리하여 NO 생성에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 3B), 홍귤에틸아세테이트 분획물의 경우 25 μg/ml에서 NO 생성량이 59.6%, 편귤에틸아세테이트 분획물의 경우 50 μg/ml에서 67.3%로 현저히 감소하였으며 추출물의 농도가 증가할수록 NO 생성량이 감소하였다.
- Lee 등[14] 은 당 유자 미숙과 추출물을 처리하여 IL-6 생성에 대한 억제 효과를 조사하였는데 본 실험의 결과와는 달리 헥산분획물 100 μg/ml 농도에서 40% 정도의 IL-6 생성 억제 효과가 있었음을 보고하였다. 따라서 재래귤 품종에 따라 분획물의 효과가 다름을 알 수 있었다.
- 3%의 소거활성을 나타낸다고 하였다. 본 연구결과 홍귤 부 탄올 분획물 1 mg/ml 시료 처리시 DPPH 라디칼 소거능이 89.19%로써 진귤 과피추출물 보다 높은 항산화 효과가 있음을 알 수 있었다. 편귤의 경우 홍귤과 마찬가지로 부탄올 분획 물이 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높았으나, 편귤은 전체적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 낮은 것을 알 수 있었다.
- 9 mg/g으로 가장 높았으며, 그 다음으로 에틸아세테이트, 헥산, 그리고 물분획물 순이었다. 총 플라보노이드 함량에 있어서도 부탄올 분 획물에서 홍귤 431.8 mg/g, 편귤 415.7 mg/g으로 가장 높게 나타났으며 에틸아세테이트, 헥산, 물분획물 순으로 조사되었다.
- 추출물 15 μl에 diethylene glycol 150 μl, 1 N NaOH 15 μl를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 1시간 반응시키고 UV-Spectrophotometer를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 하여 작성한 표준검정 곡선을 통해 추출물의 총플라보노 이드 함량을 나타내었다.
- 동결건조물 일정량을 취하여 증류수 1 l로 재용해하여 hexane (1 l×3회), ethyl acetate (1 l×3회)와 butanol (1 l×3회)을 순차적으로 가하여 분획물을 얻었고 최종 남은 용액을 물 분획물이 라 칭하였으며, 이 분획 물들은 감압 농축 한 후 동결건조하여 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 추출 수율은 n-hexane 분획물(홍귤2.6%, 편귤 2.2%), ethyl acetate 분획물(10.7%, 8.8%), n-butanol 분획물(21.3%, 26.1%), 물분획물(63.8%, 65.8%)이었다.
- 홍귤, 편귤 모두 부탄올 분 획물에서 ABTS 양이 온 소거능이 가장 우수하였으며, 다음으로 에틸아세테이트 분획물의 활성이 좋았다. 품종 간에는 홍귤의 분획물이 편귤 분획 물에 비해 ABTS 양이 온 소거능이 우수함을 알 수 있었다.
- 2와 같다. 홍귤, 편귤 모두 부탄올 분 획물에서 ABTS 양이 온 소거능이 가장 우수하였으며, 다음으로 에틸아세테이트 분획물의 활성이 좋았다. 품종 간에는 홍귤의 분획물이 편귤 분획 물에 비해 ABTS 양이 온 소거능이 우수함을 알 수 있었다.
- 각 분획물에 함유된 총 폴리페놀 및 총플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 홍귤, 편귤 모두 부탄올 분 획물에서 총 페놀 성 화합물의 함량이 각각 534.4 mg/g, 342.9 mg/g으로 가장 높았으며, 그 다음으로 에틸아세테이트, 헥산, 그리고 물분획물 순이었다. 총 플라보노이드 함량에 있어서도 부탄올 분 획물에서 홍귤 431.
- [13]. 홍귤, 편귤에틸아세테이트 분획물의 IL-6 생성 억제 효과를 측정한 결과, 처리 농도의존적으로 IL-6의 생성을 효과적으로 감소시키는 것을 알 수 있었으며, 특히 홍귤에틸아세테이트 분획물 100 μg/ml 농도에서 41%(6.8 ng/ml)로 가장 높은 IL-6 생성 억제 효과를 나타냈다 (Fig. 4). Lee 등[14] 은 당 유자 미숙과 추출물을 처리하여 IL-6 생성에 대한 억제 효과를 조사하였는데 본 실험의 결과와는 달리 헥산분획물 100 μg/ml 농도에서 40% 정도의 IL-6 생성 억제 효과가 있었음을 보고하였다.
- 부탄올 분획물은 배당체 등 극성이 큰 물질들이 많이 함유되어 있어 추후 유효성분들을 분리 및 정제하여 신소재로 사용하고자 할 때 어려움이 따르므로 부탄올 분 획물 다음으로 활성이 좋았던 에틸아세테이트 분획물을 시료로 사용하여 항염증 효능을 측정하였다. 홍귤, 편귤에틸아세테이트 분획물의 세포독성을 측정한 결과(Fig. 3A), 모든 농도에서 90% 이상의 생존율을 보여 세포독성은 나타나지 않는 것으로 확인하였다.
- 1과 같다. 홍귤의 경우 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/ml의 시료처리에 의해 DPPH 라디칼 소거능이 헥산 분획물은 1.65, 3.01, 4.99, 5.93, 16.14%, 에틸아세테이트 분획물은 16.49, 23.31, 42.44, 61.73, 84.70%, 부탄올 분획물은 26.38, 40.61, 71.65, 88.15, 89.19%, 물분획물은 5.24, 5.63, 17.05,24.90, 53.26%을 보여 부탄올 분획물이 가장 활성이 높음을 알 수 있었다. 반면 헥산 분획물과 물 분획물은 50% 이하의 낮은 활성을 보였다.
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