본 연구에서는 세복수초 추출물에 대한 항암활성을 평가하고자 간암세포주인 SK-Hep1 세포주에서 MTT를 통한 세포독성을 평가하고 자가포식(autophagy) 형성정도를 확인하였다. 또한, 종양형성능 측정(Xenograft assay)를 통하여 세복수초 추출물에 대한 항암활성평가를 수행하였다. 그 결과 in vivo및 in vitro에서 모두 항암활성이 뛰어나게 나타났으며, 세복수초 추출물의 항암작용은 자가포식(autophagy)을 증가시키는 것으로 나타났다. 세복수초 추출물은 in vitro및 in vivo에서 모두 LC3의 발현을 농도의존적으로 증가시켜며 p62의 발현을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 활성을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되어 간암치료제 개발 및 간암치료제와의 병용요법 등 새로운 작용기전의 항암신약개발 소재로서의 가능성이 있음을 제시한다.
본 연구에서는 세복수초 추출물에 대한 항암활성을 평가하고자 간암세포주인 SK-Hep1 세포주에서 MTT를 통한 세포독성을 평가하고 자가포식(autophagy) 형성정도를 확인하였다. 또한, 종양형성능 측정(Xenograft assay)를 통하여 세복수초 추출물에 대한 항암활성평가를 수행하였다. 그 결과 in vivo및 in vitro에서 모두 항암활성이 뛰어나게 나타났으며, 세복수초 추출물의 항암작용은 자가포식(autophagy)을 증가시키는 것으로 나타났다. 세복수초 추출물은 in vitro및 in vivo에서 모두 LC3의 발현을 농도의존적으로 증가시켜며 p62의 발현을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 활성을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되어 간암치료제 개발 및 간암치료제와의 병용요법 등 새로운 작용기전의 항암신약개발 소재로서의 가능성이 있음을 제시한다.
This study aims to evaluate the antitumor effect of Adonis multiflora, one of the plants in the Ranunculaceae, on mice to which hepatoma cells were transplanted and to suggest its possibility as a candidate natural substance to replace antitumor drugs. We performed the MTT assay to assess the extrac...
This study aims to evaluate the antitumor effect of Adonis multiflora, one of the plants in the Ranunculaceae, on mice to which hepatoma cells were transplanted and to suggest its possibility as a candidate natural substance to replace antitumor drugs. We performed the MTT assay to assess the extract had a decrease in the growth rate of hepatoma cells depending on concentration. In particular, 100 ㎍/㎖ of the extract showed 40% of growth retardation rate. We assessed the autophagy activity to identify the inhibitory autophagy mechanism of tumor cells in the extract. This proved that the activity increases more as the concentration of the extract is higher. We conducted the Western blot test to confirmed the expression of two proteins LC3 and p62. The expression of p62 was in inverse proportion to the concentration of the extract whereas LC3-Ⅱ increased more as the concentration of the extract was higher. This showed that an increase in the autophagy relies on the conentration of the extract. We performed a test to discover the influence of the extracts on hepatoma cells transplanted to mice. The test proved that the extract triggers a significant decrease in the growth rate of tumor cells. Compared to the start of the test, the size of tumor cells with 50, 100 and 200 ㎎/㎏ of the extract respectively increased by 4, 3.7 and 3.5 times whereas in the controlling group by 6.3 times. The size of tumor cells in benign tumor controlling group increased by 3.1 times. This showed a significant decrease in the growth rate of tumor cells compared to the controlling group. We carried out the experiment of influence of the extract on the expression of two proteins LC3 and p62 in the tumor tissue transplanted into mice. The experiment showed that LC3-II increases more as the concentration of the extract is higher. However, there was a rapid decrease in p62 with 200 ㎎/㎏ of the extract compared to the controlling group. In this study, we proved that the autophagy activity of Adonis multiflora extract inhibits the growth of hepatoma cells by in vitro and in vivo experiments. In conclusion, the inhibitory autophagy mechanism of tumor cells in the extract can be used as a new treatment of antitumor.
This study aims to evaluate the antitumor effect of Adonis multiflora, one of the plants in the Ranunculaceae, on mice to which hepatoma cells were transplanted and to suggest its possibility as a candidate natural substance to replace antitumor drugs. We performed the MTT assay to assess the extract had a decrease in the growth rate of hepatoma cells depending on concentration. In particular, 100 ㎍/㎖ of the extract showed 40% of growth retardation rate. We assessed the autophagy activity to identify the inhibitory autophagy mechanism of tumor cells in the extract. This proved that the activity increases more as the concentration of the extract is higher. We conducted the Western blot test to confirmed the expression of two proteins LC3 and p62. The expression of p62 was in inverse proportion to the concentration of the extract whereas LC3-Ⅱ increased more as the concentration of the extract was higher. This showed that an increase in the autophagy relies on the conentration of the extract. We performed a test to discover the influence of the extracts on hepatoma cells transplanted to mice. The test proved that the extract triggers a significant decrease in the growth rate of tumor cells. Compared to the start of the test, the size of tumor cells with 50, 100 and 200 ㎎/㎏ of the extract respectively increased by 4, 3.7 and 3.5 times whereas in the controlling group by 6.3 times. The size of tumor cells in benign tumor controlling group increased by 3.1 times. This showed a significant decrease in the growth rate of tumor cells compared to the controlling group. We carried out the experiment of influence of the extract on the expression of two proteins LC3 and p62 in the tumor tissue transplanted into mice. The experiment showed that LC3-II increases more as the concentration of the extract is higher. However, there was a rapid decrease in p62 with 200 ㎎/㎏ of the extract compared to the controlling group. In this study, we proved that the autophagy activity of Adonis multiflora extract inhibits the growth of hepatoma cells by in vitro and in vivo experiments. In conclusion, the inhibitory autophagy mechanism of tumor cells in the extract can be used as a new treatment of antitumor.
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문제 정의
본 연구에서는 세복수초 추출물에 대한 항암활성을 평가하고자 간암세포주인 SK-Hep1 세포주에서 MTT를 통한 세포독성을 평가하고 자가포식(autophagy) 형성정도를 확인하였다. 또한, 종양형성능 측정(Xenograft assay)를 통하여 세복수초 추출물에 대한 항암활성평가를 수행하였다.
, 2003). 본 연구에서는 우리나라에 자생하고 있는 세복수초의 성분과 작용에 관한 연구보고가 거의 없음에 착안하여 간암세포 이식한 마우스에서 항암효과를 평가하여 기존의 항암제를 대체하거나 병용요법 등의 항암보조제로서의 천연후보물질로의 가능성을 제시하고자 하였다.
따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 작용을 통해 간암 세포의 성장을 억제하는 것으로 판단되며, 기존 항암제에 대한 병용요법 등 새로운 항암치료 요법에 사용할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구의 결과를 토대로 세복수초 추출물이 기존 항암제에 대한 상승효과 및 기존 항암제의 용량조절을 통한 부작용 억제에 대한 연구를 수행하고자 한다.
제안 방법
동물사육실의 환경은 항온(20 ± 2℃), 항습(50 ± 4%). 12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 본 연구에 5마씩 분리하여 사육하였다. 생쥐는 1주일간 동물사육실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
배양된 암세포를 96 well plate 에 2 × 10⁴cells/㎖ 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에 24시간 배양하였다. 5 ㎎/㎖ MTT 용액을 첨가하고 4시간 동안 배양한 후 생성된 formazan 결정을 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 540 ㎜에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 세포수를 100% 로 하여 상대적인 세포 증식 억제율을 구하였다.
01% Tween-20을 함유한 TBS로 5분씩 5번 세척하였다. Blocking buffer에 HRP-conjugated secondary Ab를 1:5000 으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 처리하였으며, detection reagent (ECL)를 가한 후 Gel Logic 2200 PRO Imaging System (Carestream Health, Rochester, NY)을 사용하여 확인하였다.
구입하였다. Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, USA) 배지에 10% fatal bovine serum (FBS, Gibco, USA), 1% penicillin/streptomycin (P/S, Invitrogen, USA) 을 첨가하여 배양배지로 사용하였고, 배양조건은 37℃에서 95% 이상 습도가 유지되고 5% CO2 가습 공기 조건 하에서 배양하였으며, 4일마다 계대배양 하였다.
PBS로 wash 한 후 50 μM dansylcadaverine (MDC, Sigma, USA)를 100 ㎕ 처리하였으며, 1시간 동안 배양한 후 PBS로 wash하고, 1μM EtBR을 50 ㎕ 처리하여 실온에서 10분간 방치하였다. PBS로 wash하고, DMSO를 50 ㎕ 넣어 cell을 lysis 시킨 후 fluorometer (Tecan, Switzerland, MDC excitation 380 ㎚; emission 525 ㎚, EtBr excitation 530 ㎚; emission 590 ㎚) 로측정하였다. 결과 분석은 MDC 값 / EtBr 값으로 계산하여 측정하였다.
이식 2 주일 후, 세복수초 추출물을 50, 100 및 200 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여하였으며, 양성대조군으로 cisplatin을 2 ㎎/㎏으로 주 2회 복강 투여하였다. 관찰 기간 동안 주 2회 caliper를 사용하여 종양의 장축(length)과 단축(width)을 측정하였으며, 다음의 계산식에 대입하여 종양의 부피를 계산하였다.
5 ㎎/㎖ MTT 용액을 첨가하고 4시간 동안 배양한 후 생성된 formazan 결정을 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 540 ㎜에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 세포수를 100% 로 하여 상대적인 세포 증식 억제율을 구하였다.
확인하였다. 또한, 종양형성능 측정(Xenograft assay)를 통하여 세복수초 추출물에 대한 항암활성평가를 수행하였다. 그 결과 in vivo 및 in vitro에서 모두 항암활성이 뛰어나게 나타났으며, 세복수초 추출물의 항암작용은 자가포식(autophagy)을 증가시키는 것으로 나타났다.
사람 간암 세포주인 Sk-Hep-1 세포를 1 × 107 cells/mice의 농도로 PBS에 혼탁하여 nude mice를 마취한 후 옆구리 피하부위에 0.1 ㎖씩 주입하였다. 이식 2 주일 후, 세복수초 추출물을 50, 100 및 200 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여하였으며, 양성대조군으로 cisplatin을 2 ㎎/㎏으로 주 2회 복강 투여하였다.
세복수초 추출물로부터 간암 세포주인 SK-Hep-1에 대한 항암 활성을 알아보고자 MTT assay를 실시하였다. 세복수초 추출물에 의해 농도의존적으로 세포 성장률이 감소하였으며(Fig.
세복수초 추출물에 의한 자가포식(autophagy) 관련 단백 질의발현을 조사하기 위해 western blot을 수행하여 LC3 및 p62 단백질의 발현을 확인하였다. 이 중 LC3는 자가포식소체(autophagosome) 형성에 관련된 지표로 자가포식(autophagy)이 시작되면 LC3-Ⅰ 에서 LC3-Ⅱ로 전환되어 자가포식(autophagy)가 진행시 형성되는 자가포식소체(autophagosome)에 LC3-Ⅱ가 존재하는 것으로 알려져 있다(Shin, 2010).
세복수초 추출물의 간암세포 성장 억제 작용기전을 규명하기 위하여 SK-Hep-1 세포를 96 well plate에 1 × 104 cells/well 로 분주하고 24시간 후 세복수초 추출물을 농도별(25, 50 및 100 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 PBS로 wash 후 4% paraformaldehyde (PFA, Noble Bio, Korea)으로 고정하였다.
시험 종료 후 종양 및 간, 신장, 비장을 적출하여 중량을 측정하였으며, 종양에서의 LC3 및 p62의 단백질 발현을 확인하였다.
시험 종료일에 마우스를 희생하여 적출한 간, 신장 및 비장의 중량을 측정하였다. 간의 중량은 세복수초 추출물은 대조군과 비슷한 중량을 나타냈었지만 유의성은 없었다.
1 ㎖씩 주입하였다. 이식 2 주일 후, 세복수초 추출물을 50, 100 및 200 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여하였으며, 양성대조군으로 cisplatin을 2 ㎎/㎏으로 주 2회 복강 투여하였다. 관찰 기간 동안 주 2회 caliper를 사용하여 종양의 장축(length)과 단축(width)을 측정하였으며, 다음의 계산식에 대입하여 종양의 부피를 계산하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 세복수초 추출물은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 세복수초는 2013년 3월초에서 4월 중순까지 제주특별자치도 서귀포시 한라산 해발 300~500 m에서 채취하였으며, 증류수로 세척 후 음건세절하여 70% EtOH로 추출 후여과 및 감압농축(수율 8.
12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 본 연구에 5마씩 분리하여 사육하였다. 생쥐는 1주일간 동물사육실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
사용하였다. 세복수초는 2013년 3월초에서 4월 중순까지 제주특별자치도 서귀포시 한라산 해발 300~500 m에서 채취하였으며, 증류수로 세척 후 음건세절하여 70% EtOH로 추출 후여과 및 감압농축(수율 8.2%)하여 시험시까지 -80℃ (Voucher No. JBR209)에 보관하였다.
실험동물은 4주령 BALB/c nude mice를 중앙실험동물(서울) 에서 구입하여 사용하였다. 동물사육실의 환경은 항온(20 ± 2℃), 항습(50 ± 4%).
인체 유래 간암 세포주인 SK-Hep-1 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입하였다. Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, USA) 배지에 10% fatal bovine serum (FBS, Gibco, USA), 1% penicillin/streptomycin (P/S, Invitrogen, USA) 을 첨가하여 배양배지로 사용하였고, 배양조건은 37℃에서 95% 이상 습도가 유지되고 5% CO2 가습 공기 조건 하에서 배양하였으며, 4일마다 계대배양 하였다.
본 연구의 실험 결과들은 평균±표준편차로 나타내었고, 유의수준은 *p < 0.05와, **p < 0.01로 Student t’-test를 실시한 결과를 표시하였다.
이론/모형
간암세포주인 SK-Hep-1 세포에 대한 세복수초 추출물의 항암 활성을 측정하기 위해 Martin et al. (1993)의 방법에 따라 MTT (3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 실시하였다. 배양된 암세포를 96 well plate 에 2 × 10⁴cells/㎖ 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에 24시간 배양하였다.
성능/효과
또한, 종양형성능 측정(Xenograft assay)를 통하여 세복수초 추출물에 대한 항암활성평가를 수행하였다. 그 결과 in vivo 및 in vitro에서 모두 항암활성이 뛰어나게 나타났으며, 세복수초 추출물의 항암작용은 자가포식(autophagy)을 증가시키는 것으로 나타났다. 세복수초 추출물은 in vitro 및 in vivo에서 모두 LC3의 발현을 농도의존적으로 증가시켜며 p62의 발현을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 활성을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되어 간암치료제 개발 및 간암치료제와의 병용요법 등 새로운 작용기전의 항암신약개발 소재로서의 가능성이 있음을 제시한다.
3과 같다. 마우스의 체중은 세복수초 추출물 투여군 모두에서 control 보다 체중이 증가하였다. 반면에 cisplatin 투여군은 control 보다 체중이 감소하였다(Fig.
세복수초 추출물 처리 시 LC3-Ⅱ의 발현이 증가하였으며, 반대로 p62 단백질의 발현은 세복수초 추출물의 농도가 높아짐에 따라 감소하여 세복수초 추출물에 의해서 자가포식반응이 증가함을 확인할 수 있었다. 이전에 많은 연구 결과에서 높은 자가포식 활성은 세포의 사멸을 이끄는 것을 확인하였다(Kang and Avery, 2008; Maiuri et al.
, 2005). 세복수초 추출물에 의한 p62 단백질의 발현을 확인한 결과, 세복수초의 농도가 높아질수록 p62 단백질의 발현이 감소하였다(Fig. 2).
알아보고자 MTT assay를 실시하였다. 세복수초 추출물에 의해 농도의존적으로 세포 성장률이 감소하였으며(Fig. 1a), 세복수초 100 ㎍/㎖의 농도에서는 40% 세포 성장 억제율을 보였다.
그 결과 in vivo 및 in vitro에서 모두 항암활성이 뛰어나게 나타났으며, 세복수초 추출물의 항암작용은 자가포식(autophagy)을 증가시키는 것으로 나타났다. 세복수초 추출물은 in vitro 및 in vivo에서 모두 LC3의 발현을 농도의존적으로 증가시켜며 p62의 발현을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 활성을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되어 간암치료제 개발 및 간암치료제와의 병용요법 등 새로운 작용기전의 항암신약개발 소재로서의 가능성이 있음을 제시한다.
세복수초 추출물의 암세포 성장 억제 작용기전을 확인하기 위해 자가포식(autophagy) 활성을 측정한 결과, 세복수초 추출물의 농도가 높아질수록 자가포식(autophagy) 활성이 증가하였다(Fig. 1b).
3a). 실험 시작 시점에 비교하여 종양크기는 대조군이 6.3배, 세복수초 추출물 50, 100 및 200 ㎎/㎏이 각각 4배, 3.7배 3.5배로 대조군에 비해 종양의 크기가 유의하게 감소하였다. 양성대조군은 3.
5배로 대조군에 비해 종양의 크기가 유의하게 감소하였다. 양성대조군은 3.1배로 대조군에 비해 종양의 크기가 유의하게 감소하였다(Fig. 3b).
3과 같다. 종양 조직에서 LC3 단백질의 발현은 세복수초 추출물의 농도가 높아질수록 LC3-Ⅱ의 발현이 증가하였다. p62 단백질은 세복수초 추출물 200 ㎎/㎏에서 control에 비해 급격히 발현이 감소하였다.
종양 중량의 변화는 모든 실험 동물에서 실험 종료일에 종양을 적출하여, 주변 결합조직을 제거한 다음 적출한 종양의 중량을 측정한 결과, 세복수초 추출물 투여군에서 종양의 중량이 농도 의존적으로 감소하였고(Fig. 4c), 세복수초 추출물 200 ㎎/㎏ 에서는 양성대조군인 cisplatin과 비슷한 수치를 나타내었다.
후속연구
p62 단백질은 세복수초 추출물 200 ㎎/㎏에서 control에 비해 급격히 발현이 감소하였다. 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 작용을 통해 간암 세포의 성장을 억제하는 것으로 판단되며, 기존 항암제에 대한 병용요법 등 새로운 항암치료 요법에 사용할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구의 결과를 토대로 세복수초 추출물이 기존 항암제에 대한 상승효과 및 기존 항암제의 용량조절을 통한 부작용 억제에 대한 연구를 수행하고자 한다.
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