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문제 정의
- 특히 소금의 항암 활성에 대한 연구로는 인체 대장암세포에서 천일염(8), 칼륨 죽염(11), 9회 죽염(12)의 항암 효과를 확인한 정도밖에 보고되지 않아 소금의 항암 활성에 대한 연구가 매우 부족하다. 따라서 본 연구에서는 정제염과 국내 주요 산지 천일염의 in vitro 항암 효과를 HepG2 인체 간암 세포를 통해 확인함으로써 소금 자체의 항암 기능성을 확인하고자 하였다.
가설 설정
- 1)ND, not detected.
제안 방법
- )와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사하고, 이를 template로 하여 Bcl-2(forward, 5'-CTC GTC GCT ACC GTC GTG ACT TGG-3'; reverse, 5'-CAG ATG CCG GTT CAG GTA CTC AGT C-3'), Bax(forward, 5'-AAG CTG AGC GAG TGT CTC CGG CG-3'; reverse, 5'-CAG ATG CCG GTT CAG GTA CTC AGT C-3'), p53(forward, 5'-AAC GGT ACT CCG CCA CC-3'; reverse, 5'-CGT GTC ACC GTC GTG GA-3'), p21 (forward, 5'-TGG AGA CTC TCA GGG TCG AAA-3'; reverse, 5'-GGC GTT TGG AGT GGT AGA AAT C-3') 그리고 housekeeping 유전자로서 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH, forward, 5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TC-3'; reverse, 5'-AGC CTT CTC CAT GGT CGT GA-3') 유전자를 BIONEER thermocycler(Mygenie96, BIONEER, Daejeon, Korea)를 이용하여 특정 부위를 증폭시켰다. Ethidium bromide(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 2% agarose gel(Invitrogen Co.)을 이용하여 PCR 산물들을 전기영동하고 UV 하에서 확인하였다(17).
- HepG2 세포에서 종양 생성을 억제하는 유전자 또는 세포 주기 조절을 억제하는 인자와 관련하여 apoptosis가 일어나는지 알아보기 위하여 종양 억제에 가장 중요한 역할을 한다고 알려진 p53과 세포주기 조절에 중요한 역할을 하는 p21의 mRNA(Fig. 3A) 및 단백질(Fig. 3B) 발현에 국내산 천일염이 미치는 효과를 측정하였다. RT-PCR 방법을 통해 mRNA 발현 정도를 살펴본 결과 p53은 SS-Y가 다른 군들에 비해 유의적으로 높았고(P<0.
- HepG2 인체 간암세포에 정제염 PS와 국내산 천일염 두종류 SS-T와 SS-Y를 처리하여 세포 성장 억제 효과를 확인하였다(Fig. 1). 소금 처리 농도는 선행연구(8)를 참고하여 정상세포인 HaCaT 인체 피부세포에서 독성을 나타내지 않으면서 암세포의 성장 억제 효과를 보이는 0.
- Membrane을 1차 항체에 4°C에서 24시간 반응시킨 후 PBS-T로 washing 하고, 상온에서 2시간 동안 1차 항체에 맞는 2차 항체에 반응시킨 후 다시 PBS-T로 washing 후 Enhanced Chemiluminescence를 사용하여 현상하였다.
- Spectrophotometer(UV-2401PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 total RNA를 정량한 후 oligo dT primer(Invitrogen Co.)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사하고, 이를 template로 하여 Bcl-2(forward, 5'-CTC GTC GCT ACC GTC GTG ACT TGG-3'; reverse, 5'-CAG ATG CCG GTT CAG GTA CTC AGT C-3'), Bax(forward, 5'-AAG CTG AGC GAG TGT CTC CGG CG-3'; reverse, 5'-CAG ATG CCG GTT CAG GTA CTC AGT C-3'), p53(forward, 5'-AAC GGT ACT CCG CCA CC-3'; reverse, 5'-CGT GTC ACC GTC GTG GA-3'), p21 (forward, 5'-TGG AGA CTC TCA GGG TCG AAA-3'; reverse, 5'-GGC GTT TGG AGT GGT AGA AAT C-3') 그리고 housekeeping 유전자로서 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH, forward, 5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TC-3'; reverse, 5'-AGC CTT CTC CAT GGT CGT GA-3') 유전자를 BIONEER thermocycler(Mygenie96, BIONEER, Daejeon, Korea)를 이용하여 특정 부위를 증폭시켰다.
- 국내산 천일염 두 종류 SS-T와 SS-Y, 정제염의 무기질 함량을 ICP-OES를 이용하여 확인하였다(Table 1). SS-T 와 SS-Y는 PS에 비해 다양한 무기질을 함유하고 있었으며, SS-T는 Na가 34.
- Apoptosis에 관여하는 여러 인자 중 Bcl-2 family는 가장 중요한 역할을 수행한다고 볼 수 있으며, Bcl-2 family의 대표적인 인자로는 anti-apoptotic 인자인 Bcl-2와 pro-apoptotic 인자인 Bax를 들 수 있다. 국내산 천일염이 HepG2 세포에서 apoptosis와 관련하여 자연 세포 사멸을 일으키는지 확인하기 위하여 Bcl-2와 Bax 유전자의 mRNA(Fig. 2A) 및 단백질(Fig. 2B) 발현 정도를 측정하였다. HepG2 세포에 아무 것도 처리하지 않은 Control의 Bcl-2 mRNA 발현이 가장 높게 나타났고, 이어서 PS, SS-T, SS-Y 순으로 나타나 SS-Y가 가장 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.
- 배양된 HepG2 세포를 96-well plate에 well당 1×105cells/mL가 되도록 100 μL씩 분주하여 5% CO2 incubator 에서 37°C, 24시간 동안 배양한 후 0.5%와 1% 농도로 DMEM 배지에 희석한 소금 시료를 100 μL 첨가하여 24시간 배양하였다.
- 1). 소금 처리 농도는 선행연구(8)를 참고하여 정상세포인 HaCaT 인체 피부세포에서 독성을 나타내지 않으면서 암세포의 성장 억제 효과를 보이는 0.5%와 1% 농도로 설정하여 처리하였으며, 시료를 아무것도 처리하지 않은 Control의 세포 성장 저해율을 0%로 하였다. 그 결과 0.
대상 데이터
- Membrane을 1차 항체에 4°C에서 24시간 반응시킨 후 PBS-T로 washing 하고, 상온에서 2시간 동안 1차 항체에 맞는 2차 항체에 반응시킨 후 다시 PBS-T로 washing 후 Enhanced Chemiluminescence를 사용하여 현상하였다. Bcl-2, Bax, p53, p21 유전자의 1차 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다(17).
- HepG2 세포의 배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), 0.05% trypsin-0.02% EDTA, 100 unit/mL penicillin-streptomycin을 GIBCO BRL (Grand Island, NE, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- HepG2 인체 간암세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받아 실험에 사용하였다. HepG2 세포의 배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), 0.
- 정제염(PS)은 현재 시판되고 있는 성분의 99% 이상이 NaCl인 H사(Ulsan, Korea)의 제품으로 부산광역시 금정구의 S마트에서 구입하였으며, 국내산 천일염은 전라남도 신안의 T염전(SS-T)과 전라남도 영광의 Y염전(SS-Y)으로부터 1년간의 숙성을 통해 간수가 제거된 것을 제공받아 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험군들과 대조군의 유의성 검증을 위하여 분산분석 (ANOVA)을 행한 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였고 결과를 평균±표준편차로 표시하였으며, PASW statistics 18(IBM Co., Armonk, NY, USA) 통계프로그램을 이용하였다.
이론/모형
- 실험에 사용한 소금의 무기질 함량 측정은 inductively coupled plasma optical emission spectrometry(ICPOES)(Optima 4300DV ICP-OES, PerkinElmer, Shelton, CT, USA)를 이용하여 분석하였다. 실험조건은 주파수 40 MHz(free-running), power 1,300 W, plasma gas flows 20 L/min, auxiliary gas flows 1.
성능/효과
- 1%의 소금 농도에서 SS-Y는 69.3±2.6%로 가장 높은 억제율을 보였으며 SS-T가 61.6 ±2.6%, PS는 52.2±7.6%의 억제율을 보였다.
- HepG2 세포에 아무 것도 처리하지 않은 Control의 Bcl-2 mRNA 발현이 가장 높게 나타났고, 이어서 PS, SS-T, SS-Y 순으로 나타나 SS-Y가 가장 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.05).
- RT-PCR 방법을 통해 mRNA 발현 정도를 살펴본 결과 p53은 SS-Y가 다른 군들에 비해 유의적으로 높았고(P<0.05), 이어서 SS-T, PS, Control 순으로 나타났으나 이들은 통계적으로 비슷한 수준이었다.
- 그 결과 0.5% 농도에서 SS-Y가 48.6±6.2%, SS-T는 41.3±8.9%로 유의적으로 높은 억제율을 나타냈으며, PS도 26.2± 2.6%의 억제율을 보였다.
- 단백질 수준에서는 Bcl-2의 경우 mRNA 발현 때와 같이 Control이 가장 높게 발현되었고, 다음으로 PS, 그리고 천일염 두 종류인 SS-Y와 SS-T가 비슷한 수준으로 유의적으로 낮았다(P<0.05).
- 1% 농도에서 17~28%, 2% 농도에서 97% 정도의 HepG2 세포 성장 억제율을 보여, 소금 2% 함량까지는 농도 의존적인 억제 효과를 보였다(실험 결과 미제시). 따라서 소금 시료 모두 HepG2 세포의 성장을 억제하였으며 정제염보다는 천일염의 세포 성장 억제 효과가 높았다.
- 이들 유전자들은 dimer 형태로 결합하여 균형을 이루고 있으나 그 균형이 깨지게 되면 cytochrome c 같은 apoptosis 유발 물질이 미토콘드리아 내부에서 세포질로 방출되어 caspases, 종양 억제 유전자 p53 등을 활성화하여 apoptosis가 일어나게 된다(21,22). 본 실험에서 HepG2 세포에 세 가지 소금을 처리하였을 때 대표적인 anti-apoptotic Bcl-2의 발현이 mRNA와 단백질 수준에서 모두 감소하고, pro-apoptotic Bax의 발현은 모두 증가하여 정제염과 국내산 천일염, 특히 SS-Y는 DNA 전사 및 번역 단계에서 일어나는 apoptosis에 Bcl-2 family 유전자들을 관여시키는 것으로 나타났다.
- 또한 소금의 K, Mg, Ca 등의 무기질은 혈관 확장, 알도스테론과 레닌의 분비 억제, 안지오텐신 Ⅱ 활성 억제 등의 기능을 하고(3), 특히 K는 항암 활성을 나타낸다고 알려진 바 있다(29). 본 연구에서 사용한 천일염두 종류 중 SS-T의 전반적인 무기질 함량이 SS-Y에 비해 더 높은 수준을 보였으나 RT-PCR과 western blot 실험 결과를 보았을 때 SS-T가 다른 소금 시료들에 비해 유의적인 효과를 드러낸 것은 p21 유전자의 단백질 발현 정도였다. SS-T와 SS-Y는 비슷한 정도로 apoptosis 관련 유전자들을 mRNA 및 단백질 수준에서 조절하였고, Bax의 mRNA 발현 및 p53의 단백질 발현은 SS-T, SS-Y, PS가 모두 비슷한 수준으로 나타나 소금의 무기질 함량만이 HepG2 인체 간암세포의 항암 효과에 영향을 미치는 것은 아니며 Na 및 소금 제조 방법, 제조 환경, 미네랄 종류 및 농도 등의 다른 요인이 작용할 것으로 생각된다.
- 6%의 억제율을 보였다. 한편 SS-T, SS-Y, PS는 0.1% 농도에서 17~28%, 2% 농도에서 97% 정도의 HepG2 세포 성장 억제율을 보여, 소금 2% 함량까지는 농도 의존적인 억제 효과를 보였다(실험 결과 미제시). 따라서 소금 시료 모두 HepG2 세포의 성장을 억제하였으며 정제염보다는 천일염의 세포 성장 억제 효과가 높았다.
후속연구
- 5%이상)로 제조할 시에 MNNG와 함께 존재하게 되면 보돌연변이 작용을 한다(20). 따라서 소금은 고농도일 때는 인체에 좋지 않으나 적절한 농도를 이용하면 오히려 좋은 기능성을 나타낼 수 있을 것으로 보이며, 이와 관련된 연구가 더 많이 필요하겠다. 한편 앞서 수행된 연구들에 의하면 소금은 모두 HCT-116 인체 대장암세포의 성장을 억제시켰으며, 이들 중 천일염은 정제염에 비해 암세포 성장을 억제하는 효과가 높았다(8).
- 하지만 본 연구 결과에 의하면 NaCl이 99%인 정제염도 HepG2 세포의 성장 억제 및 Bcl-2, Bax, p53, p21 유전자의 발현을 조절하였으므로 소금이 인체 질병에 부정적으로 작용하지만은 않으며, 오히려 적당량의 Na는 간암세포에 있어서 암을 억제할 수 있을 것으로 사료되어 이에 대한 후속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한 소금은 자체의 돌연변이 활성은 없으나 돌연변이원(발암물질)과 공존할 시에 보돌연변이 활성을 보인다(9)고 하였으므로 소금 섭취를 무조건 배척하기보다는 발암물질과 함께 섭취하는 것을 예방하는 등의 식생활 개선과 함께 소금의 인체 건강 기능성에 대한 연구가 더욱 상세하게 진행되어야 하겠다.
- p21은 cyclin-dependent kinase inhibitor(CDKI)로서 cell cycle arrest뿐 아니라 apoptosis를 조절할 수 있다(25,26). 본 실험에서 사용한 소금의 처리에 의해 HepG2 세포의 p53이 mRNA 및 단백질 수준에서 발현이 증가된 것이 p21 발현과의 연관성을 가지며, 이를 통해 HepG2 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 보이나 flow cytometry 등의 방법을 이용하여 후속 연구를 수행할 필요가 있다.
- 선행된 연구들에 의하면 소금의 Na는 과다섭취할 시 고혈압과 신장 기능의 이상을 야기할 수 있다(27). 하지만 본 연구 결과에 의하면 NaCl이 99%인 정제염도 HepG2 세포의 성장 억제 및 Bcl-2, Bax, p53, p21 유전자의 발현을 조절하였으므로 소금이 인체 질병에 부정적으로 작용하지만은 않으며, 오히려 적당량의 Na는 간암세포에 있어서 암을 억제할 수 있을 것으로 사료되어 이에 대한 후속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한 소금은 자체의 돌연변이 활성은 없으나 돌연변이원(발암물질)과 공존할 시에 보돌연변이 활성을 보인다(9)고 하였으므로 소금 섭취를 무조건 배척하기보다는 발암물질과 함께 섭취하는 것을 예방하는 등의 식생활 개선과 함께 소금의 인체 건강 기능성에 대한 연구가 더욱 상세하게 진행되어야 하겠다.
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