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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 커피박의 재활용을 높이기 위해 기능성 커피박 퇴비를 개발하고자 커피박 퇴비로부터 추출한 수용성 추출물의 총페놀함량 및 주요 식물병원균의 균사생육, 포자 발아관 생장, 그리고 유주자낭 형성에 미치는 영향을 비교분석 하였다.
가설 설정
- 2) Its cannot be detected as lower content than detection limit.
제안 방법
- 6종의 식물병원균을 시험 전 PDA배지에 접종하여 5일간 배양한 후, 균사가 자란 PDA 배지 가장자리 부분을 8 mm 지름의 멸균된 corker borer 로 병원균의 균사를 포함하고 있는 agar disk를 뚫은 후, 깨끗한 PDA 배지의 한가운데 접종한 다음 3 cm 정도 떨어진 곳에 8 mm paper disc(Whatman, USA)를 치상하고 각각의 커피박 추출물 원액을 20μL씩 점적 처리하였다.
- capsici)의 유주자낭 형성정도에 미치는 영향을 조사하고자 PDA배지에서 배양한 고추역병균 균총을 V-8 juice agar(4 g CaCO3 , 200 mL V-8 juice, 20 g agar, 1000 mL 멸균수)에서 7일간 배양한 후, 역병균의 균총을 메스를 이용하여 2 cm2의 정사각형으로 절단하여 빈 petri-dish에 3조각씩 치상하였다. 그 다음, 물로 추출하여 여과한 커피박 추출액 20 mL 를 3 조각씩 치상된 petri-dish에 분주하고, 24시간 형광등 아래에서 배양하여 1 mm2당 형성된 유주자낭의 수를 광학현미경(Alphat, Nikon, Tokyo, Japan)으로 처리당 5반복씩 조사하였다.
- 여과 한 용액은 합하여 감압하에 로터리 농축기에서 최종 10 mL까지 농축하였고, 농축액은 더이상의 정제과정 없이 –4℃에서 냉동보관하면서 항균력 검정 및 총 페놀함량 검정실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 커피박 및 커피박 퇴비의 수용성 추출물은 수집한 커피박 및 자가 제조한 커피박 퇴비를 전 처리 없이 100 g을 정량하여 500 mL 삼각플라스크에 넣고 300 mL 멸균증류수를 부은 후에 상온에서 250 rpm에서 24시간 동안 교반하였다. 여과를 통하여 여과액과 찌꺼기를 분리하였고, 여과 후 남은 찌꺼기는 다시 300 mL 멸균증류수를 첨가하여 동일한 방법으로 총 3회에 걸쳐서 추출을 하였다. 여과 한 용액은 합하여 감압하에 로터리 농축기에서 최종 10 mL까지 농축하였고, 농축액은 더이상의 정제과정 없이 –4℃에서 냉동보관하면서 항균력 검정 및 총 페놀함량 검정실험에 사용하였다.
- 여과한 커피박 추출액 100 μL와 검은무늬병원균 분생포자 현탁액 100μL를 혼합하여 오염되지 않은 PDA 배지위에 분주하여 도말하였고, 25℃ BOD incubator (VS-3250, Vision Scientific Co. Ltd., Daejeon, Korea)에서 배양하면서 포자발아 정도를 처리 당 5반복씩 광학 현미경(Alphat, Nikon, Tokyo, Japan)으로 조사하였다.
- 총 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여 UV spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량의 산출은 표준물질로 gallic acid를 사용하여 표준 검량선을 구하였고, 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalents(GAE mg/g)로 환산하였다.
- 6종의 식물병원균을 시험 전 PDA배지에 접종하여 5일간 배양한 후, 균사가 자란 PDA 배지 가장자리 부분을 8 mm 지름의 멸균된 corker borer 로 병원균의 균사를 포함하고 있는 agar disk를 뚫은 후, 깨끗한 PDA 배지의 한가운데 접종한 다음 3 cm 정도 떨어진 곳에 8 mm paper disc(Whatman, USA)를 치상하고 각각의 커피박 추출물 원액을 20μL씩 점적 처리하였다. 치상한 후 25℃ 배양기에서 7일간 배양한 다음 균사 생육 저지원(Inhibition zone)을 측정함으로써 병원균의 균사 생장억제 효과를 처리당 5반복씩 조사하였다26).
- 커피박 추출물의 고추 역병균(P. capsici)의 유주자낭 형성정도에 미치는 영향을 조사하고자 PDA배지에서 배양한 고추역병균 균총을 V-8 juice agar(4 g CaCO3 , 200 mL V-8 juice, 20 g agar, 1000 mL 멸균수)에서 7일간 배양한 후, 역병균의 균총을 메스를 이용하여 2 cm2의 정사각형으로 절단하여 빈 petri-dish에 3조각씩 치상하였다. 그 다음, 물로 추출하여 여과한 커피박 추출액 20 mL 를 3 조각씩 치상된 petri-dish에 분주하고, 24시간 형광등 아래에서 배양하여 1 mm2당 형성된 유주자낭의 수를 광학현미경(Alphat, Nikon, Tokyo, Japan)으로 처리당 5반복씩 조사하였다.
- 커피박 추출물의 참깨 검은무늬병원균(A. alternata) 의 포자발아 억제정도는 PDA배지에서 7일간 배양하여 생성된 검은무늬병원균 분생포자를 멸균증류수 15 mL 수거하여 균사를 걸러내고 분생포자 현탁액(103 spores/mL)을 만들었다. 여과한 커피박 추출액 100 μL와 검은무늬병원균 분생포자 현탁액 100μL를 혼합하여 오염되지 않은 PDA 배지위에 분주하여 도말하였고, 25℃ BOD incubator (VS-3250, Vision Scientific Co.
- 커피박 추출물이 6종의 식물병원균에 대해 어떻게 항균력을 가지는 것인지 기작을 설명하고자 커피박 단독, 10% 깻묵+커피박 퇴비, 깻묵 단독 재료를 동일한 조건에서 90일간 부숙시키면서 30일 간격으로 총 폴리페놀 함량을 조사하였다[Table 4]. 총 폴리페놀 함량은 부숙시간의 경과에 따라 커피전문점의 커피박을 재료로 커피박 단독으로 부숙시킬 때보다 10% 깻묵을 첨가한 10% 깻묵+커피박퇴비에서 90일째에 가장 높은 총 페놀 함량인 평균 0.
- 커피박과 깻묵은 7:3의 비율로 혼합한 후, 수분함량을 60%로 조절하여 50 L의 플라스틱 원통에 넣고 교반과 공기를 주입하고자 2주 간격으로 1회 정도 뒤집기를 하여 커피박 퇴비의 부숙온도를 50℃ 이상 2개월간 유지하면서 부숙시켜 제조하였다. 커피박 퇴비의 완성도는 커피박 퇴비의 온도가 더 이상 올라가지 않은 시점에서 다시 최소 30일 간의 후숙과정을 거쳐 커피박 퇴비를 제조하여 시험에 사용할 수 있도록 하였다.
- 커피박 제조에 질소원으로 사용한 깻묵은 충북 영동군 재래시장에서 유기적으로 재배한 참깨로부터 참기름을 추출한 것을 확보하였다. 커피박과 깻묵은 7:3의 비율로 혼합한 후, 수분함량을 60%로 조절하여 50 L의 플라스틱 원통에 넣고 교반과 공기를 주입하고자 2주 간격으로 1회 정도 뒤집기를 하여 커피박 퇴비의 부숙온도를 50℃ 이상 2개월간 유지하면서 부숙시켜 제조하였다. 커피박 퇴비의 완성도는 커피박 퇴비의 온도가 더 이상 올라가지 않은 시점에서 다시 최소 30일 간의 후숙과정을 거쳐 커피박 퇴비를 제조하여 시험에 사용할 수 있도록 하였다.
대상 데이터
- 2016년 커피박은 커피전문점 6곳으로부터 커피액을 추출한 후 버려지는 커피박을 수거하여 시험에 사용하였다. 수거한 커피박은 풍건하여 수분을 제거한 후 사용하였으며, 상업용 커피박은 3곳의 인스던트 커피 전문 생산 업체로부터 폐기하는 커피박을 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 주요 식물병원균은 오이 잘록병을 일으키는 Rhizoctonia solani AG-1B(KACC 40111), 상추 균핵병을 일으키는 Sclerotinia sclerotiorum (KACC 40457), 상추 시들음병을 일으키는 Fusarium oxysporum(KACC40032), 오이 역병을 일으키는 Phytophthora capsici(KACC 40181), 참깨 검은무늬 병을 일으키는 Alternaria alternata(KACC40019), 토마토 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea (KACC 40574) 등 6종으로 국립농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양 받아 사용하였다. 6종의 식물병원균은 PDA(20g Potato, 18g dextrose, 18g Agar, 1000ml 멸균수) 배지에서 기본적으로 배양 하였고 배양조건은 병원균의 최적생육조건을 고려 하여 20~25℃에서 7일간 배양하여 사용하였다.
- 2016년 커피박은 커피전문점 6곳으로부터 커피액을 추출한 후 버려지는 커피박을 수거하여 시험에 사용하였다. 수거한 커피박은 풍건하여 수분을 제거한 후 사용하였으며, 상업용 커피박은 3곳의 인스던트 커피 전문 생산 업체로부터 폐기하는 커피박을 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 주요 식물병원균은 오이 잘록병을 일으키는 Rhizoctonia solani AG-1B(KACC 40111), 상추 균핵병을 일으키는 Sclerotinia sclerotiorum (KACC 40457), 상추 시들음병을 일으키는 Fusarium oxysporum(KACC40032), 오이 역병을 일으키는 Phytophthora capsici(KACC 40181), 참깨 검은무늬 병을 일으키는 Alternaria alternata(KACC40019), 토마토 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea (KACC 40574) 등 6종으로 국립농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양 받아 사용하였다. 6종의 식물병원균은 PDA(20g Potato, 18g dextrose, 18g Agar, 1000ml 멸균수) 배지에서 기본적으로 배양 하였고 배양조건은 병원균의 최적생육조건을 고려 하여 20~25℃에서 7일간 배양하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 커피박 및 커피박 퇴비의 수용성 추출물은 수집한 커피박 및 자가 제조한 커피박 퇴비를 전 처리 없이 100 g을 정량하여 500 mL 삼각플라스크에 넣고 300 mL 멸균증류수를 부은 후에 상온에서 250 rpm에서 24시간 동안 교반하였다. 여과를 통하여 여과액과 찌꺼기를 분리하였고, 여과 후 남은 찌꺼기는 다시 300 mL 멸균증류수를 첨가하여 동일한 방법으로 총 3회에 걸쳐서 추출을 하였다.
- 에 따라 측정하였다. 커피박 및 커피박 퇴비에서 물로 추출한 시료를 10배로 희석하여 실험에 사용하였다. 이 희석액 0.
- 커피박을 이용한 커피박 퇴비는 국립농업과학원 유기농업과 온실에서 자가제조하여 사용하였다. 커피박 제조에 질소원으로 사용한 깻묵은 충북 영동군 재래시장에서 유기적으로 재배한 참깨로부터 참기름을 추출한 것을 확보하였다. 커피박과 깻묵은 7:3의 비율로 혼합한 후, 수분함량을 60%로 조절하여 50 L의 플라스틱 원통에 넣고 교반과 공기를 주입하고자 2주 간격으로 1회 정도 뒤집기를 하여 커피박 퇴비의 부숙온도를 50℃ 이상 2개월간 유지하면서 부숙시켜 제조하였다.
- 커피박을 이용한 커피박 퇴비는 국립농업과학원 유기농업과 온실에서 자가제조하여 사용하였다. 커피박 제조에 질소원으로 사용한 깻묵은 충북 영동군 재래시장에서 유기적으로 재배한 참깨로부터 참기름을 추출한 것을 확보하였다.
데이터처리
- 시험별 통계분석은 커피전문점과 상업용 커피박의 화학성분 및 polyphenol 함량 비교 및 커피박 추출물 처리에 따른 6종의 식물병원균에 대한 항균력과 곰팡이 포자 발아관 생육 및 유주자낭 형성 억제효과를 분석하기 위해 SAS ver. 8.2(SAS Institute, Inc. 2003, Cary, NC) program27)을 이용하여 ANOVA분석을 하였으며, 처리평균 간 비교를 위하여 Turkey’s test(P = 0.05)를 실시하였다.
이론/모형
- 커피박 단독, 10% 깻묵+커피박 퇴비, 깻묵 단독 재료를 동일한 조건에서 90일간 부숙시키면서 30일 간격으로 총 폴리페놀 함량을 Folin-Ciocalteu법25)에 따라 측정하였다. 커피박 및 커피박 퇴비에서 물로 추출한 시료를 10배로 희석하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 6 mm)을 제외하고 5종의 식물병원균의 균사생육 저지원이 10 mm 이상으로 활성이 높게 조사되었다. 3종의 상업용 커피박 퇴비 수용성 추출물의 항균력이 일반 매장용 커피박 추출물에 비해 낮은 것으로 조사되었지만, F. oxysporum(6.4~6.6 mm)을 제외하고 균사 생육 저지원이 8.4 mm 이상의 항균활성을 나타내었다. 커피전문점과 상업용 커피박 퇴비 수용성 추출물 모두 6종류의 식물병원균 중 B.
- 커피전문점과 상업용 커피박의 이 화학성 분석결과 pH나 EC등의 조건도 안정적이고 K2O, CaO, MgO도 일정 함량 보유하고 있는 것으로 나타나 유기물 재료로 사용하기에 적합하였다. 또한 커피박 퇴비의 수용성 추출물은 주요 식물병원균 6종에 대하여 항균력을 가지는 것으로 확인되 었다. 특히 커피박 퇴비 추출물이 A.
- 60 g/kg으로 보고되었다29). 본 실험결과에서 조사된 K2O, CaO, MgO, Na2O 등의 성분함량보다 매우 낮은 수치를 나타낸 반면, Zn은 9~12 mg/kg으로 본 실험에서 조사한 함량보다 매우 높게 조사되어 커피박의 출처에 따라 기본적인 화학성분의 함량 차이가 있음을 확인할 수 있었다.
- 부숙 90일 후, 상업용 커피박 단독의 경우에는 평균 0.19±0.02 mg GAE/g이었고 커피전문점의 커피박 단독은 0.22±0.04 mg GAE/g이었으며 깻묵 단독은 0.14±0.03 mg GAE/g로 가장 낮게 조사되었다[Table 4].
- 부숙시간 및 10% 깻묵 첨가에 따른 총 폴리페놀 함량이 통계학적으로 유의적인 관계가 있음을 보였다(p<0.05).
- 앞의 시험결과에서 식물병원균에 대한 항균력 조사 결과 상업용 커피박을 재료로 한 것 보다 커피전문점 커피박을 재료로 사용한 추출물의 항균력이 유의적으로 높은 것으로 나타났으며 총 페놀함량의 조사결과에서도 상업용 커피박 추출물보다 커피전문점 커피박 추출물의 총 폴리페놀함량이 높은 것으로 보아 커피박 퇴비의 폴리페놀 성분이 식물병원균에 대해 항균력을 작용한 것으로 생각된다.
- 주요 식물병원균 6종에 대한 커피전문점과 상업용 커피박 퇴비 수용성 추출물의 항균활성을 검정한 결과, 6종의 식물병원균에 대한 항균력이 있음을 확인하였다. 특히, 커피전문점에서 수거한 6종의 커피박의 항균력은 F.
- 총 폴리페놀 함량은 부숙시간의 경과에 따라 커피전문점의 커피박을 재료로 커피박 단독으로 부숙시킬 때보다 10% 깻묵을 첨가한 10% 깻묵+커피박퇴비에서 90일째에 가장 높은 총 페놀 함량인 평균 0.35±0.03 mg GAE/g로 나타냈다.
- O, Mn 함량은 두 종류의 커피박 처리별로 유의 적인 차이가 없는 것으로 나타났다[Table 1]. 커피 전문점 커피박 6종류의 평균 pH와 EC는 5.4 와 2.7 dS/m로 상업용 커피박의 평균 pH와 EC가 5.1과 1.9 dS/m에 비해 각각 약 0.3과 0.8 정도 유의적으로 높은 것으로 나타났다. Zn의 함량은 상업용 커피박이 1.
- 커피박 퇴비 수용성 추출물의 고추 역병균(P. capsici)의 유주자낭 형성 억제정도를 처리별 유주자낭의 갯수로 조사한 결과, 커피박 단독으로 제조한 커피박 퇴비의 수용성 추출물의 경우 역병균의 유주자낭의 개수가 평균 16.5개 인데 비해 10% 깻묵을 첨가하여 제조한 10% 깻묵+커피박 퇴비의 수용성 추출물은 역병균의 유주자낭의 갯수가 평균 7.5개로 커피박 단독으로 제조한 커피박 퇴비의 수용성 추출물에 비해 평균 9개 적고 무처리에 비해 평균 36개 이상 적게 형성되어 유의적으로 역병균의 유자낭 형성을 억제하는 것으로 조사되었다[Table 3, Fig. 1-D, E]. 무처리의 경우 고추 역병원균의 유주자낭이 평균 43.
- 커피박 퇴비 수용성 추출물의 참깨 검은무늬병원균(A. alternata)의 분생포자 발아 억제정도를 발아관 길이로 측정한 결과,ghkg 커피박 단독으로 제조한 커피박 퇴비의 수용성 추출물을 처리하였더니 참깨 검은무늬병원균의 분생포자 발아관의 길이가 평균 175 μm인데 비해 10% 깻묵을 첨가하여 제조한 10%깻묵+커피박 퇴비의 수용성 추출물은 참깨 검은무늬병원균의 분생포자 발아관의 길이가 평균 100 μ m로 커피박 단독으로 제조한 커피박 퇴비의 수용성 추출물에 비해 75% 이상 분생포자 발아관의 신장을 유의적으로 억제하는 것으로 조사되었다[Table 3, Fig. 1-A, B].
- capsici 유주자낭 형성을 억제하는 효과가 있었다. 커피박 퇴비의 총 폴리페놀 함량은 부숙시간의 경과에 따라 증가하였으며, 10% 깻묵+ 커피박 퇴비에서 90일째에 가장 높은 총 페놀 함량인 평균 0.35±0.03 mg GAE/g로 분석되어 유기농 토양 개량 및 토양병 방제를 위한 기능성 커피박 퇴비의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
- 4 mm 이상의 항균활성을 나타내었다. 커피전문점과 상업용 커피박 퇴비 수용성 추출물 모두 6종류의 식물병원균 중 B. cinerea에 A. altanata균에 대한 항균력이 유의적으로 가장 우수하였다[Table 2].
- 커피박은 단백질, 탄수화물뿐만 아니라 polyphenol과 같은 기능성 물질을 다량 함유하고 있다. 커피전문점과 상업용 커피박의 이 화학성 분석결과 pH나 EC등의 조건도 안정적이고 K2O, CaO, MgO도 일정 함량 보유하고 있는 것으로 나타나 유기물 재료로 사용하기에 적합하였다. 또한 커피박 퇴비의 수용성 추출물은 주요 식물병원균 6종에 대하여 항균력을 가지는 것으로 확인되 었다.
- 커피전문점의 커피박 6종류와 상업용 커피박은 3종류에 대해 유기물 퇴비 재료로서 이화학성을 분석하고자 pH, EC, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 붕소, 망간, 아연 함량을 각각 분석하였더니, pH, EC, Zn의 함량은 상업용 커피박보다 커피전문점의 커피박에서 높게 나타난 반면 K2O, CaO, MgO, Na2O, Mn 함량은 두 종류의 커피박 처리별로 유의 적인 차이가 없는 것으로 나타났다[Table 1]. 커피 전문점 커피박 6종류의 평균 pH와 EC는 5.
- 또한 커피박 퇴비의 수용성 추출물은 주요 식물병원균 6종에 대하여 항균력을 가지는 것으로 확인되 었다. 특히 커피박 퇴비 추출물이 A. altanata 포자발아 억제 및 P. capsici 유주자낭 형성을 억제하는 효과가 있었다. 커피박 퇴비의 총 폴리페놀 함량은 부숙시간의 경과에 따라 증가하였으며, 10% 깻묵+ 커피박 퇴비에서 90일째에 가장 높은 총 페놀 함량인 평균 0.
- 주요 식물병원균 6종에 대한 커피전문점과 상업용 커피박 퇴비 수용성 추출물의 항균활성을 검정한 결과, 6종의 식물병원균에 대한 항균력이 있음을 확인하였다. 특히, 커피전문점에서 수거한 6종의 커피박의 항균력은 F. oxysporum(8.3~8.6 mm)을 제외하고 5종의 식물병원균의 균사생육 저지원이 10 mm 이상으로 활성이 높게 조사되었다. 3종의 상업용 커피박 퇴비 수용성 추출물의 항균력이 일반 매장용 커피박 추출물에 비해 낮은 것으로 조사되었지만, F.
후속연구
- 83 mg/g으로 보고한 바있다38). 커피박 퇴비의 항균력에 대한 기작을 구명 하고자 총 폴리페놀함량을 조사하였으나 chlorogenic acid와 nicotinic acid를 추가적으로 분석할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 커피박의 출처에 따른 항균력의 차이를 보이는 것은 커피원두의 종류나 추출방법에서 나타나는 차이는 있지만 커피전문점이나 상업용 커피박 모두에서 6종의 식물병원균에 대한 항진균능력을 확인할수 있어 향후 커피박 퇴비를 이용한 토양병 방제에 활용이 가능성이 높을 것으로 사료된다.
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