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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 천연기념물 제 265호 연산오계의 도계 부산물인 내장을 이용하여 산업화에 활용하는 기초자료를 확보하고자 효소 가수분해를 통해 펩타이드를 분리하였으며, 펩타이드 제조 시 최적반응조건(pH, 온도, 분해시간 등)을 확립하고 여러 원료로 사용할 수 있도록 특성을 규명하고자 하였다. 또한, 품질특성(일반성분, 기능성 및 아미노산 분석을 통한 분해율 및 수율 등) 및 품질지표를 선정하고자 분석실험을 하였다.
- 그러므로 본 연구에서는 천연기념물 제 265호 연산오계의 도계 부산물인 내장을 이용하여 산업화에 활용하는 기초자료를 확보하고자 효소 가수분해를 통해 펩타이드를 분리하였으며, 펩타이드 제조 시 최적반응조건(pH, 온도, 분해시간 등)을 확립하고 여러 원료로 사용할 수 있도록 특성을 규명하고자 하였다. 또한, 품질특성(일반성분, 기능성 및 아미노산 분석을 통한 분해율 및 수율 등) 및 품질지표를 선정하고자 분석실험을 하였다.
제안 방법
- BM1200에 효소를 이용하여 연산오계 내장으로부터 효소 가수분해하여 최적 조건요인들인 온도, pH, 효소의 양의 3개의 실험변수에 대하여 Box-Benken 디자인으로 실험을 설계하여 얻어진 실험결과 즉 가수분해도를 [Table 4]에 나타내었다. 가수분해 효율성을 나타내는 중요한 요인들인 가수분해도, 총 수율, 생산속도 측정값을 보여준다.
- 프로테아제 가수분해 양은 L-tyrosine 표준곡선을 이용하여 측정하였고 표준곡선을 구하여 절편의 값은 다음과 같다. Y=0.0078X + 0.0182 절편식을 이용하여, 한 후 가수분해양은 DH(%)의 값을 구하는 가수분해 정도를 이용해 계산하였다.
- 1 g을 18 ml test tube 넣고 6 N HCl 3 ml를 가하여 감압 밀봉(질소가스 충진)한 후 110℃로 setting된 heating block에 24시간 이상 동안 가수분해 시켰다. 가수분해가 끝난 시료는 50℃에서 rotary evaporator로 산을 제거한 후 Sodium dilution buffer로 10 ml 정용한 다음, 이중 1 ml를 취하여 membrane filter 0.2 ㎛로 여과시켜 [Table 2]와 같이 아미노산 자동분석기(S433-H, Sykam GmbH, Germany)로 정량 분석하였다.
- 깨끗한 plate 위에 1 ml 정도 떨어뜨려 열풍건조 시켰다. 건조 후에 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기로 (MALDI-ToF, Voyager DE-STR, Applide biosystems, USA) 레이저(Laser : Nitrogen, 337 nm, 3ns pulse)를 이용하여 측정하였다.
- 1 M phosphate 30 ml이 담긴 플라스크 비커에 넣고 homogenizer를 이용하여 균질화 하였다. 균질화 된 연산오계 내장을 지퍼백에 넣고 샘플이름, 제조날짜를 기입을 하였다.
- ,Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택을 하여 X1 (온도)는 40℃ (-1), 50℃ (0), 60℃ (+1) 로 정하고, X2 (pH)는 5.0 (-1), 6.0 (0) 7.0 (+1) 로하고 X3 (효소의 양)는 1 (-1), 2 (0), 3 (+1)% 로 하였다[Table 1]. 연산오계 내장 펩타이드 생산은 50 ml PBS용매를 담고 있는 250 ml 삼각 플라스크를 이용하였는데, 각각 플라스크 용매에 대하여 효소 양을 넣어주었다.
- 연산오계 내장의 단백질 가수분해 생산 최적 조건을 구하기 위하여 Hwang[17]의 방법을 이용하여 실행하였다. 모든 실험 계획은 3개의 독립변수 즉, 효소반응온도, 반응 pH, 효소의 농도(%)를 각각 50℃, pH 6.0, 2%로 하는 center run을 5번 반복을 포함하여 총 17개의 처리조합으로 구성을 하였다[17]. Box-Benken design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험 (designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수 (coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다.
- 방치가 끝난 시료는 0.2 μm membrane filter로 여과하고 이중 1 ml을 lithium citrate buffer(0.12 N, pH 2.2)와 혼합하여 적절한 농도로 희석한 후 그중 1 ml을 취하여 [Table 3]과 같이 아미노산 자동분석기 automated amino acid analyzer(Sykam GmbH, Germany)를 이용하여 정량분석하였다.
- Box-Benken design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험 (designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수 (coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다. 본 실험에서의 반응 변수들은 TCA 용해 펩타이드 양과 단백질 가수분해율(DH, degree of hydrolysis)로 하였다.
- 본 연구에서 연산오계 내장 단백질 가수분해물의 여러 종류의 펩타이드 분자량 분포에 대한 분석을 시행하였는데 MALDI-TOF의 그래프에서 X 축은 mass(m/z)를 나타내고 Y축은 이온화 된 물질의 강도를 나타낸다. 불순물이 어느 정도 포함이 되어있지만 대부분의 펩타이드 들은 m/z 500에서 1,400 이하 분자량 분포를 보여 주었다.
- 불순물이 제거된 연산오계 내장을 상온에서 해동하였다. 해동 된 연산오계 내장 3 g을 0.
- 통계적인 계산을 원활히 하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화 (code)하여 사용을 하였다. 세 개의 변수들을 각각 X1 (온도), X2 (pH), X3 (효소농도)로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 의하여 구 할 수 있고 그 값을 Z로 하였다.
- 연산오계 내장 펩타이드 분자량 측정을 위해 alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid 사용하였고, 70% ACN 과 0.1% formic acid 로 하여 10 m / ml의 matrix 시료를 만들었다. Sample을 50-100 ppm 정도 준비하였다.
- 연산오계 내장으로부터 펩타이드를 분리하기 위하여 효소가수분해 최적 공정을 개발하기 위하여 온도 (40, 50, 60℃), pH (pH 6.0, 7.0, 8.0), 효소 (1, 2, 3%) 별로 가수분해율을 분석하였다. 가수분해도는 온도, pH 그리고 효소의 양에 영향을 받는 다는 것이 95% 수준 이내에서 인정되었으며, 연산오계 내장의 효소가수분해에 따른 펩타이드 함량은 효소의 값이 3%로 높아질수록 또 온도가 약 58℃로 높아질수록 가수분해도는 높아졌다.
- 연산오계 부산물 내장을 단백질 가수분해 효소를 이용하여 분해한 생성물들의 분자량 분포 특성을 분석하고자 MALDI-TOF를 사용하였다. MALDI-TOF는, PMF(Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 특정 효소를 처리하여 잘라진 peptide fragment들의 mass 값을 측정하고 이를 사용하여 database search를 하여 동정한다.
- 연산오계의 내장을 분리하기 위하여 냉동된 연산오계를 상온에서 해동하였다. 해동이 된 연산오계 내장을 수세하고, 부산물안의 불순물을 제거하였다.
- 필터 된 용액을 578 nm absorbance를 측정한다. 프로테아제 가수분해 양은 L-tyrosine 표준곡선을 이용하여 측정하였고 표준곡선을 구하여 절편의 값은 다음과 같다. Y=0.
- 연산오계의 내장을 분리하기 위하여 냉동된 연산오계를 상온에서 해동하였다. 해동이 된 연산오계 내장을 수세하고, 부산물안의 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 내장은 실험 전까지 -20℃ 냉동보관을 하였다.
- 효소 반응 pH 변화에 따른 연산오계 내장 단백질 가수분해를 실행하기 위하여 냉동된 상태로 보관된 균질화 된 연산오계 내장 5 g 을 phosphate 완충용액 50 ml를 담고 있는 플라스틱 비커에 넣어 homogenizer를 이용해 내장을 균질화 하였다. 균질화 된 내장액을 250 ml 삼각플라스크에 옮겨 효소 BM1200을 첨가하고 배양기에 1시간 반응시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 Folin ciocalteu`s phenol(FCP)과 Tri-chloro-acetic(TCA)산 시약은 Sigma Company(Seoul, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 분해효소 bromelain 1200 GDU(BM1200)은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입을 하였다. BM1200 효소는 pineapple로부터 얻어진 식물성프로테아제이다.
- 본 실험에 사용된 Folin ciocalteu`s phenol(FCP)과 Tri-chloro-acetic(TCA)산 시약은 Sigma Company(Seoul, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 분해효소 bromelain 1200 GDU(BM1200)은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입을 하였다.
- 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejon, Korea)에서 구입을 하였다. 실험에 사용된 연산오계육은 (주)지산농원(Nonsan, Chungnam, Korea)에서 제공을 하였다.
- 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejon, Korea)에서 구입을 하였다. 실험에 사용된 연산오계육은 (주)지산농원(Nonsan, Chungnam, Korea)에서 제공을 하였다.
데이터처리
- 실험 후에 확정 된 결과들의 통계분석은 Design Expert (Couresy: Stat-ease Inc.,Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택을 하여 X1 (온도)는 40℃ (-1), 50℃ (0), 60℃ (+1) 로 정하고, X2 (pH)는 5.
이론/모형
- ΔX는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법으로 사용을 하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.
- 연산오계 내장의 단백질 가수분해 생산 최적 조건을 구하기 위하여 Hwang[17]의 방법을 이용하여 실행하였다. 모든 실험 계획은 3개의 독립변수 즉, 효소반응온도, 반응 pH, 효소의 농도(%)를 각각 50℃, pH 6.
- 효소가수분해도의 측정은 Hoyle and Merritt[18]의 방법을 조정을 하여 수행하였다. 연산오계 내장의 단백질 가수분해물 1 ml에 0.
성능/효과
- 가수분해도는 펩타이드 생산효율을 평가하는데 지표가 된다. pH 6-8 사이에서 크게 변화가 없었던 반면 온도의 경우 40℃에서 서서히 증가하다가 약 58℃ 근처에서 최고생산량 72.52%까지 펩타이드 생산량이 높아지는 것으로 확인되었다.
- 0), 효소 (1, 2, 3%) 별로 가수분해율을 분석하였다. 가수분해도는 온도, pH 그리고 효소의 양에 영향을 받는 다는 것이 95% 수준 이내에서 인정되었으며, 연산오계 내장의 효소가수분해에 따른 펩타이드 함량은 효소의 값이 3%로 높아질수록 또 온도가 약 58℃로 높아질수록 가수분해도는 높아졌다. 하지만 pH변화에 따른 펩타이드의 생산량은 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 149 mg/100 g 이다. 그 중 glutamic acid가 전체 구성 아미노산의 13.4% (51.640 mg/100 g)으로 가장 많은 함량을 차지하고 있었다. 다음으로 aspartic acid (11.
- 149 mg/100 g 이다. 그 중 glutamic acid가 전체 구성 아미노산의 13.4% (51.640 mg/100 g)으로 가장 많은 함량을 차지하고 있었다. 다음으로 aspartic acid (11.
- 불순물이 어느 정도 포함이 되어있지만 대부분의 펩타이드 들은 m/z 500에서 1,400 이하 분자량 분포를 보여 주었다. 따라서 연산오계 내장 가수분해물 펩타이드들은 아미노산 염기 4에서 12개 정도의 분포를 보여 주었다. 그리고 대부분의 펩타이드들이 염기서열 10개 이하로 이루어져 있었다.
- 반응표면 분석 실험의 결과를 종합해 보면 연산오계 내장의 효소가수분해에 따른 펩타이드 생산양에 가장 영향을 미치는 것은 온도이고, 효소의 양과 pH 순으로 나타났으며, pH의 영향은 아주 미미한 것으로 판단되었다[Fig. 4].
- 05). 본 실험결과 반응온도, pH, 효소의 농도에 대한 영향은 1차, 2차, 교호항(cross product term)에서 유의성이 나타나 요인들의 단독 또는 교호적으로 영향을 미침을 알 수 있다. 이들에 대한 회귀식은 [Table 7] 에 있다.
- 가수분해 효율성을 나타내는 중요한 요인들인 가수분해도, 총 수율, 생산속도 측정값을 보여준다. 실험 결과 가수분해도의 값은 15.07-94.38 범위에서 측정값이 얻어졌으며, 수율은 16.439-102.915 %, 생산속도는 0.822-4.311 g/h-L의 범위에서 측정되었다. 실험결과를 이용한 회귀식에 대한 분산분석의 결과는 반응표면분석법에 의해 수립된 모델의 적합성 여부를 알려준다.
- 연산오계 내장을 분리하여 효소가수분해 처리한 가수분해물의 유리 아미노산 함량은 다음과 같다[Table 9]. 연산오계 내장 효소가수분해물에서는 28종류의 유리아미노산이 검출되었으며, leucine이 9.8% (15.163 mg/100g) 로 가장 많았다. 그 다음으로 arginine (9.
- 유리아미노산은 총 28종류의 유리아미노산이 분석되었으며, leucine(9.8%)로 가장 높게 나타났다.
- 49%였으나 약 58℃로 높아질수록 펩타이드 생산량의 정상점이 나타났다. 이 결과 효소는 약 3%가 되었을 때 그리고 온도는 약 58℃로 반응을 주었을 때 정상점이 나타났으며, 이곳이 최대 펩타이드 양이 생산되는 것으로 보이며, 그 값은 약 78.82%로 나타났다.
- 이 연구 결과 연산오계 내장을 이용하여 기능성 소재의 생산체계 확보를 위한 제조 공정을 표준화, 추출물 및 분말 등 대량 생산 공정을 매뉴얼, 소비자 맞춤형 가공식품 생산 체계 및 실용화에 필요한 기초자료를 확보할 수 있었다.
- Quadratic 회기 모델의 분석 결과가 [Table 5] 에서 보여준다. 이들의 결과에 따르면 가수분해도, 총 수율, 생산속도들은 온도, pH, 효소의 양에 영향을 받는다는 것이 95% 수준 이내에서 유의성이 인정되었다.
- 96 이므로 이 모델은 10% 범위에서 설명되지 않는다는 것을 보여준다. 적합결여(lack of fit) 테스트 검정에서는 유의성이 나타나지 않아 본 실험에 사용한 모델이 매우 적절함을 알 수 있다. [Table 6]에서는 모델의 회귀계수를 나타내는 것으로 가수분해도, 가수분해 수율, 생산속도들이 3가지의 요인들에 대하여 크게 영향을 받는 것으로 나타났다.
- 그리고 대부분의 펩타이드들이 염기서열 10개 이하로 이루어져 있었다. 평균 분자량으로 환산을 한다면 다수를 차지하는 펩타이드의 분자량들은 아미노산 잔기가 5, 6, 8, 10개로 이루어 져있음을 확인하였다.
- 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대적으로 판명되어 연산오계 내장을 이용한 효소가수분해도 즉 펩타이드 생산량은 pH보다 온도에 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 가수분해도는 펩타이드 생산효율을 평가하는데 지표가 된다.
- 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 연산오계 내장을 이용한 효소가수분해도는 [Fig. 3] 에서와 같이 효소의 양에 의해 생산되는 가수분해도의 변화보다는 온도의 변화에 상당히 민감하였다. 효소의 값이 높아질수록 펩타이드의 생산량은 미미하게 높아졌다.
- 8%) 등의 순서였다. 필수아미노산으로는 lysine (31.773 mg/100 g), leucine, valine, isoleucine, tyrosine 순으로 높게 나타났다. 이상의 결과는 Lee[21]의 연구에서와 비슷한 경향을 나타낸 것으로 내장에서 필수아미노산의 함량대비 양은 비슷한 것을 알 수 있다.
- 2]에서 보듯이 효소의 양에 따른 펩타이드 생산량 변화가 pH의 변화보다 민감한 것을 알 수 있다. 효소의 양 1.7% 부터 서서히 증가하여 3%로 올렸을 때 78.82%로 효소의 양을 점차 늘렸을 때 최고 생산량을 보여주었으나 이에 반해 pH의 경우 pH 7-7.5에서 약간의 증가함을 보였으나 pH의 변화에 따른 값이 크게 변화되지 않았음을 확인하였다. 그러므로 pH의 변화 보다는 효소의 양이 3%로 높아졌을 때 펩타이드의 생산량이 증가함을 알 수 있다.
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