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문제 정의
- 따라서 본 연구는 초고압 처리기를 이용하여 오계육 부산물인 내장육 단백질로부터 펩타이드형태의 단백질 가수 분해물 최적 생산 공정 조건을 연구하고 펩타이드의 특성을 연구하였다.
- 본 연구는 단백질 가수분해 효소 bromelain를 이용하여 오계육 가공 부산물인 내장육으로부터 펩타이드 최적 생산 조건을 확립하기 위하여 수행되었다. 효소가수분해 공정은 고압 반응기에서 수행이 되었고 효소 반응 pH 6.
제안 방법
- Column은 cation separation column(LCA K06/Na, 4.6× 150 mm; Sykam GmbH)로 정량분석 하였다.
- 샘플의 농도는 50 -100 ppm 정도로 준비하였으며, matrix시료와 시료를 1:1비율로 섞었다. MS plate위에 1 mL 정도 떨어뜨려 건조한 후 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기(MALDI-TOF, Voyager DE-STR, Applied biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 0 과 온도 60℃는 효소 제조 업체에서 제공이 되었다. 따라서 본 연구는 고압반응기의 압력(30-100 MPa), 반응시간(1-5시간), 내장육의 양 (10- 30%)의 범위에서 수행이 되었다.
- 표면 반응 분석 모델인 Box-Behnken Design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식모델의 계수(coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다[19] 본 연구에서 펩타이드 생산 최적화 공정을 위한 실험 계획은 3개의 독립변수 효소 반응압력(MPa), 반응시간(h), 내장육의 농도(%)를 각각 65 MPa, 3시간, 20%로 하는 Center run을5번 반복을 포함하여 총 17개의 처리 조합으로 구성 되었다. 반응 변수는 가수분해도(DH,Degree of Hydrolysis)로 하였고, 통계적인 계산을 원활하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code)하여 사용하였다(Table 1).
- 세 개의 변수들을 각각 X1(압력), X2(시간), X3(기질농도)로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 의하여 구할 수 있고 그 값을 Z로하였다.
- ,MA, USA)로 여과하였다. 여과된 샘플은 아미노산 자동분석기(Sykam GmbH, S433-H, Germany)로 아미노산량을 측정하였다. Column은 cation separation column(LCA K06/Na, 4.
- 오계 내장육의 총 가수분해 값은 육 0.1 g을 110℃에서 6N HCl로 24 시간 가수분해를 실시하여 가수분해물의 tyrosine 양을 측정하여 이 값을 Dmax 로 하였다. 효소 반응 t 시간 후 날개육의 가수분해물의 tyrosine 양으로 측정 된 값을 Dt 로 하였다.
- 오계의 내장을 분리하기 위하여 냉동된 오계를 상온에서 해동하였다. 해동이 된 오계내장을 수세하여 불순물을 제거하였다.
- 표면 반응 분석 모델인 Box-Behnken Design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식모델의 계수(coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다[19] 본 연구에서 펩타이드 생산 최적화 공정을 위한 실험 계획은 3개의 독립변수 효소 반응압력(MPa), 반응시간(h), 내장육의 농도(%)를 각각 65 MPa, 3시간, 20%로 하는 Center run을5번 반복을 포함하여 총 17개의 처리 조합으로 구성 되었다. 반응 변수는 가수분해도(DH,Degree of Hydrolysis)로 하였고, 통계적인 계산을 원활하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code)하여 사용하였다(Table 1).
- 오계의 내장을 분리하기 위하여 냉동된 오계를 상온에서 해동하였다. 해동이 된 오계내장을 수세하여 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 오계내장을 0.
- 균질화된 오계 내장은 지퍼백에 넣고 실험 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다. 효소 반응은 진공파우치에 균질화 된 내장육과 효소를 첨가하여 고압기(TFS, Toyoko Tasu Co., LTD, Hiroshima,Japan)에 반응시켰다. 최적 효소 반응 pH 6.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 오계 내장은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 냉동상태로 공급 되었고, 실험 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다. Trichloroacetic acid(TCA)시약과 Folinciocalteu`s phenol(FCP)시약은 Sigma Company사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 단백질 분해효소 bromelain 1200GDU(BM 1200)은 대종상사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejeon, Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 오계 내장은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 냉동상태로 공급 되었고, 실험 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다. Trichloroacetic acid(TCA)시약과 Folinciocalteu`s phenol(FCP)시약은 Sigma Company사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 단백질 분해효소 bromelain 1200GDU(BM 1200)은 대종상사(Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- Trichloroacetic acid(TCA)시약과 Folinciocalteu`s phenol(FCP)시약은 Sigma Company사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 단백질 분해효소 bromelain 1200GDU(BM 1200)은 대종상사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejeon, Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
- 실험 후에 확정된 결과들의 통계분석은 Design Expert(Couresy: Statease Inc., Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다.
이론/모형
- △X는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법으로 사용을 하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.
성능/효과
- 1. 가수분해도 최적 조건은 압력은 높을수록 증가를 하였고, 반응 시간은 3시간, 기질의 농도는 20%에서 결정이 되었다. 이때 최대 가수분해도가 34.
- 2. 단백질 가수분해물의 분자량은 MALDITOF로 분석을 하였는데 평균 분자량 300이상 1,000 이하의 분자량 분포를 보여 대부분이 펩타이드로 평가되었다.
- 결과를 종합해 보면 표면 반응의 분석결과 정상점이 최대점으로 판명되어 고압처리 효소가수분해에 가장 영향을 미치는 것은 압력, 시간, 기질의 순으로 나타났다(Fig. 5). 즉, 압력은 낮을수록, 반응시간을 연장할수록, 기질이 적을수록 가수분해도가 높았다.
- 43%로 나타났다. 고압처리 효소가수분해를 이용한 최적조건은 기질의 양보다 시간 영향을 받는 것으로 확인되었다(Fig. 4).
- 7에서 보여준다. 구성 아미노산 중에서 비극성 소수성 아미노산인 isoleucine이 전체 10.6%를 차지하였고 관련 아미노산들인 alanine, valine, leucine, proline, phenylalanine, tyrosine들이 42.3%를 차지하였다. 이어서 극성 비전하 아미노산들26.
- 3에 나타내었다. 기질의 양의 변화에 따른 가수분해도 변화 보다는 압력의 변화에 상당히 민감하였으며, 기질의 양 20%, 압력 약 90 MPa 근처에서 정상점이 나타났는데, 이것이 가수분해도의 최대점이 되어 그 값은 약 61.59%로 압력이 높을 때 펩타이드의 생산량이 증가함을 알 수 있다.
- 소수성 및 방향족 아미노산들은 수소이온공여를 통하여 라디칼 소거능과 키이레이팅능력이 높고 세포막 통과가 용이하기 때문에 생체이용율이 높은 것으로 보고되어 왔다. 따라서 본 연구 결과 생산된 펩타이드의 구성 아미노산 중에서 비극성 소수성 아미노산들이 42.3%를 차지하여 항산화 기능이 뛰어날 것으로 기대한다.
- 05). 본 실험결과 압력, 시간, 기질의 양에 대한 영향은 1차, 2차, 교호항(cross product term)에서 유의성이 나타나 요인들의 단독 또는 교호적으로 영향을 미침을 알 수 있다. 이들에 대한 회귀식은 Table 5에 있다.
- BM1200을 이용하여 오계 내장으로부터 효소가수분해 최적 조건요인들인 압력, 시간, 내장육양의 실험변수에 대하여 Box-Behnken 디자인으로 실험을 설계하여 얻어진 실험결과 즉, 가수분해도를 Table 2에 나타내었다. 실험 결과 가수분해도의 값은 32.46-66.28 범위에서 측정값이 얻어졌다.
- 가수분해도에 대한 시간과 기질의 영향에 대한표면반응이다. 오계 내장 고압처리 효소가 수분해하여 시간과 기질에 따른 최적 표면 반응의 분석결과 정상점이 최대점으로 판명되어 예측 최대 펩타이드 생산은 3-4시간 반응 하였을 때, 그리고 기질의 양이 약 27%에서 반응할 때 정상점이 나타났다. 이곳이 최대 펩타이드 양이 생산되는 것으로 확인되었으며 그 값은 약 57.
- 오계 내장 고압처리 효소가 수분해하여 시간과 기질에 따른 최적 표면 반응의 분석결과 정상점이 최대점으로 판명되어 예측 최대 펩타이드 생산은 3-4시간 반응 하였을 때, 그리고 기질의 양이 약 27%에서 반응할 때 정상점이 나타났다. 이곳이 최대 펩타이드 양이 생산되는 것으로 확인되었으며 그 값은 약 57.43%로 나타났다. 고압처리 효소가수분해를 이용한 최적조건은 기질의 양보다 시간 영향을 받는 것으로 확인되었다(Fig.
- Quadratic 회기 모델의 분석 결과가 Table 3에서 보여준다. 이들의 결과에 따르면 가수분해도는 압력과 시간과 기질의 양에 영향을 받는다는 것이 95% 수준 이내에서 유의성이 인정되었다.
- 96 이므로, 이 모델은 4%범위에서 설명되지 않는다는 것을 보여준다. 적합결여(lack of fit) 테스트 검정에서는 유의성이 나타나지 않아 본 실험에 사용한 모델이 매우 적절함을 알 수 있다. Table 4에서는 모델의 회귀계수를 나타내는 것으로 가수분해도가 3가지 요인들에 대하여 크게 영향을 받는 것으로 나타났다(P<0.
- 5). 즉, 압력은 낮을수록, 반응시간을 연장할수록, 기질이 적을수록 가수분해도가 높았다.
- 따라서 오계 내장 가수분해물 펩타이드들은 아미노산 염기 4에서 8개 정도의 분포를 보여 주었다. 평균분자량으로 환산을 한다면 다수를 차지하는 펩타이드의 분자량들은 아미노산 잔기가 5, 6, 8, 10개로 이루어져 있다고 평가되었다.
- 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 고압 처리한 효소가 수분해는 시간보다 압력에 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 가수분해도는 펩타이드 생산효율을 평가하는데 지표가 된다.
후속연구
- 4. 그러므로 본 연구 결과를 바탕으로 생산된 펩타이드들에 대한 생리활성 특성 연구가 후속으로 진행하여 건강 기능 식품소재로 활용할 가치가 매우 높은 것으로 기대한다.
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