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문제 정의
- 그러나 국내에서는 아직 아이스플랜트에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 아이스플랜트의 일반성분과 이노시톨류를 분석하였고, 기능성 식품의 소재로 활용하고자 항산화, 항당뇨 등의 생리 활성을 검증하였다.
제안 방법
- α-Amylase 저해 활성은 Xu 등(1)의 방법을 응용하여 효소원으로 사람의 타액 amylase를 사용하고 기질로서 starch 를 이용하여 효소 활성을 측정하였다.
- 1-MP의 정량 분석은 DB-wax capillary column(0.32 mm i.d.×30 m,0.25 μm film thickness)과 nitrogen-phosphorous detector(NPD)가 장착된 GC(Model 6890, Agilent Technologies)를 사용하였고, 분석조건으로 injector 및 detector의 온도는 모두 250℃로 설정하였다.
- ABTS[2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt] 라디칼을 이용한 항산 화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(16) 을 수정하여 실시하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.
- DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 소거 활성은 Heo 등(15)의 방법을 변형하여 실험하였다. 아이스플랜트 용매분획물을 methanol에 녹여 농도별(1,000, 500, 250, 125, 62.
- HP-5 capillary column(0.32 mm i.d.×30 m, 0.25 μm film thickness, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)과 flame ionization detector(FID)가 장착된 gas chromatograph(Model 6890, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였고, 분석조건으로 injector 및 detector의 온도는 각각 280과 300℃로 설정하였다.
- 96 well plate에 희석한 ABTS 용액 200 μL와 methanol에 녹여 농도별로 희석한 시료 100 μL를 섞고 1분후 microplate reader를 사용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 DPPH와 같이 백분율(%)로 표시하였다. 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 건조된 아이스 플랜트 분말 200 g에 4 L의 methanol을 가하여 실온에서 3일간 각각 3회 추출･여과한 후 합하여 농축하였다. 그 후 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol로 용매의 극성도를 높여가며 순차적으로 분획하였고, 최종적으로 남은 부분을 aqueous 분획으로 하였다. 이 용매분획물들을 농축 하여 -80°C deep freezer에 보관하면서 실험에 사용하였 다.
- 그리고 자석교반기로서 교반하면서 17시간 동안 37℃의 incubator에 둔 후에 4%의 BHT를 50 μL 가하여 10분 동안 방치하여 산화를 정지시켰다.
- 불포화 지방산이 산화될 때 생성되는 malonaldehyde (MA)는 반응성이 너무 크고 불안정하여 정확한 측정이 쉽지 않다. 따라서 MA가 형성된 후 N-methylhydrazine(NMH) 과 반응시켜 유도체인 1-methyl pyrazole(1-MP)로 변환시켜 nitrogen phosphorus detector(NPD)가 장착된 GC로그 함량을 측정하였다. 이 방법은 이미 여러 천연물질의 항산화 효과를 측정하는 데 많이 사용되어온 방법이다(18-20).
- 아이스플랜트의 무기질 함량 분석을 위한 시료의 분해는 AOAC법(12)에 따라 실시하였다. 무기질 분석은 액체크로 마토그래피 유도결합플라즈마 질량분석기(liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometer/LC-ICP-MS, Nexion 350D, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하였다. 표준물질은 혼합표준용액을 사용하였으며 검량방법은 외부표준검량법으로 하여 3회 분석한 결과의 평균값을 나타내었다.
- 페놀화합물은 phenolic hydroxyl기를 가진 식물체 유래의 대사산물로 단백질 등의 거대분자들과 결합하려는 성질을 가지고 있으므로 인체내의 라디칼을 제거하는 항산화 효과가 있고 항암, 항염증 및 항알레르기 등의 생리활성 효과가 있으며, 항산화 활성과 양의 상관관계가 있어 간접적인 지표로 활용된다(25). 본 연구에서는 아이스플랜트의 용매 분획별 페놀화합물의 함량을 측정하여 gallic acid와 비교하 였다. 한편 Ibtissem 등(26)이 M.
- Lipid/MA assay는 불포화 지방산이 산화될 때 malonaldehyde가 생성되는 원리를 이용한 측정방법이다. 아이스 플랜트의 용매분획물을 농도별로 처리하여 지질을 인위적 으로 산화시킨 후 발생하는 malonaldehyde 형성을 억제하는 정도를 BHT와 비교하였다.
- 아이스플랜트 용매분획물을 methanol에 녹여 농도별(1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 μg/mL)로 희석한 시료 200 μL와 사용 직전에 만든 0.2 mM DPPH를 100 μL 넣고 혼합하여 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader 를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 아이스플랜트(Mesembryanthemum crystallinum)의 일반 성분과 cyclitol 화합물을 분석하였으며, 기능성 식품의 소재로 활용 가능성을 알아보기 위하여 추출물의 용매분획별 항산화 효과 및 항당뇨 활성 등을 검정하였다. 무기질 함량은 K와 Na가 각각 1,213.
- 아이스플랜트의 농도별 용매분획물의 DPPH, ABTS 및 FRAP 활성을 측정하였다(Table 2). 용매분획별 활성을 알아보면 활성을 나타내는 유효물질의 화학적 성질을 짐작할 수 있으므로 생리활성물질의 연구에 도움이 될 것으로 생각된다.
- 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다. 양성대조군으로 BHA의 소거 활성과 비교하였다. 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 1 N NaOH 50 μL를 가하여 반응을 정지시키고 415 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 시료 대신 동량의 증류수로 실험하였으며 양성대조군으로 acarbose를 사용 하였다. 효소 활성의 저해 정도는 아래의 식에 의하여 산출 하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 1 N NaOH 50 μL를 가하여 반응을 정지시키고 415 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 시료 대신 동량의 증류수로 실험하였으며 양성대조군으로 acarbose를 사용 하였다. 효소 활성의 저해 정도는 아래의 식에 의하여 산출 하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 이어서 시료에 trimethylsilylimidazole : pyridine mixture(1:1, v/v) 200 μL를 가하고 70℃ heating block에서 30~40분 동안 반응시켜 유도체화한 후 gas chromatograph(GC)를 사용하여 분석하였다(14).
- 즉 0.5 M trizma buffer(pH 7.4), 1 M potassium chloride, 1% SDS, 0.01 M ferrous chloride, 0.3% hydrogen peroxide, 30 μL 대구 간유(cod liver oil)와 농도별(10, 50, 100 및 500 μg/mL in methanol) 용매분획물을 시험관에 넣고 증류수를 가하여 전체 부피를 5 mL가 되도록 하였다.
- 이 1-MP는 solid phase extraction(SPE)법으로 분리･정제하는 과정을 거쳤다. 즉 SPE cartridge(MEGA BE-C18, Varian, Harbor, CA, USA)의 activation을 위해서 ethyl acetate, methanol, 증류수의 순으로 각각 10 mL씩을 서서히 통과시키고 유도체화된 시료를 가한 후, 증류수 5 mL를 먼저 통과시키고 이어서 ethyl acetate 10 mL를 통과시켜 반응 생성물인 1-MP를 추출하였다. 여기에 내부 표준물질로 2-methyl pyrazine(2-MP)을 20 μL 가하고 전체 부피를 ethyl acetate로서 10 mL로 정용하였다.
- 반응액 200 μL와 methanol에 녹여 농도별로 희석된 시료 50 μL를 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선으로 FeSO4･7H2O를 사용하여 환원력을 계산하였고 양성 대조군으로 Trolox의 환원력과 비교하였으며 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 효소 활성의 저해 정도는 α-glucosidase 저해 활성과 같은 방법으로 산출하였으며 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
대상 데이터
- 이 용매분획물들을 농축 하여 -80°C deep freezer에 보관하면서 실험에 사용하였 다. 무기질의 분석은 동결 건조한 아이스플랜트 분말을 시료로 사용하였다.
- 신선한 아이스플랜트를 송이애농장(Sacheon, Korea)으 로부터 구입하여 동결 건조한 후 사용하였다. 건조된 아이스 플랜트 분말 200 g에 4 L의 methanol을 가하여 실온에서 3일간 각각 3회 추출･여과한 후 합하여 농축하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program Ver. 12.0을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시 하여 유의성이 있는 경우에 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)으로 시료 간의 유의차를 검정하였다(P<0.05).
- 각 시료 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시하였다. 양성대조군으로 BHA의 활성과 비교하였으며 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 무기질 분석은 액체크로 마토그래피 유도결합플라즈마 질량분석기(liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometer/LC-ICP-MS, Nexion 350D, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하였다. 표준물질은 혼합표준용액을 사용하였으며 검량방법은 외부표준검량법으로 하여 3회 분석한 결과의 평균값을 나타내었다.
이론/모형
- FRAP 실험은 Benzie와 Strain(17)의 방법에 따라 측정하였다. Reaction solution은 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.
- 시료 중의 총페놀 함량은 Folin-Denis법(13)으로 측정하였다. 시료는 용매분획물을 1 mg/mL의 농도로 methanol에 녹여 조제하고 filter paper로 여과한 것을 사용하였다.
- 아이스플랜트의 무기질 함량 분석을 위한 시료의 분해는 AOAC법(12)에 따라 실시하였다. 무기질 분석은 액체크로 마토그래피 유도결합플라즈마 질량분석기(liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometer/LC-ICP-MS, Nexion 350D, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하였다.
성능/효과
- ･가 항산화 물질에 의해 환원되어 소거되는 정도를 측정하는 방법이다. ABTS 라디칼 소거능 또한 모든 용매분획물에서 농도가 증가함에 따라 상승하였다. Chloroform 분획에서 26.
- Chloroform 분획에서 26.75±1.75~83.44±0.14%로 가장 높은 활성을 나타내었고, ethyl acetate와 butanol 분획이 각각 19.09±1.57~83.12±0.00%와 12.56±0.75~82.22±0.28 %로 높게 나타났다.
- Chloroform과 ethyl acetate 분획에서 각각 25.99±2.20~81.71±0.03%, 16.81±0.72~79.73 ±0.13%로 높은 활성을 나타내었고, butanol, hexane 및 aqueous 분획은 각각 4.64±1.10~48.46±1.14%, 1.71± 0.58~26.59±0.65% 및 1.37±1.02~17.76±1.08%로 다소 낮은 활성을 나타내었다.
- Chloroform과 ethyl acetate 분획에서 각각 4.83±0.74~65.52±0.33%, 4.66 ±0.81~65.74±0.70%로 활성이 높았으나, butanol, hexane 및 aqueous 분획은 각각 2.25±0.89~21.02±3.21%, 2.20±0.00~8.47±0.43% 및 0.91±0.64~8.58±0.83%로 활성이 비교적 낮게 나타났다.
- Cyclitol 화합물의 함량은 D-pinitol이 4.04±0.08 mg/g으로 가장 많았으며, chiro-inositol과 myo-inositol은 각각 2.82± 0.01과 0.25±0.01 mg/g으로 비교적 적게 함유되어 있었 다.
- 62 mg GAE/g으로 많았다. DPPH, ABTS, FRAP 및 lipid/MA assay에 의한 항산화 활성은 공통적으로 chloroform 분획에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, ethyl acetate 분획에서 비교적 높은 활성을 나타내었다. 항산화 활성은 용매분획별 총페놀 함량과 비례적이었다.
- Lipid/MA assay에 의한 항산화 활성은 500 μg/mL 처리하였을 때 chloroform 분획에서 67.24±4.33%로 가장 높았고, ethyl acetate와 butanol 분획에서 각각 58.50±1.94 와 56.12±2.28%로 비교적 높은 활성을 나타내었다.
- 그 결과 α-glucosidase 저해 활성은 전반적으로 모든 용매분획에서 50% 이상의 높은 저해 활성을 나타내었다.
- 또한, Larner(30,31)의 연구에서 chiro-inositol 및 pinitol이 인슐린 비 의존형 당뇨병에서 당대사를 조절하는 능력을 가졌다는 연구 결과가 발표되었고, chiro-inositol의 섭취로 혈당 강하 효과가 나타나는 것이 확인되었다(32). 따라서 pinitol과 chiro-inositol을 함유한 아이스플랜트를 섭취함으로써 제2형 당뇨병에서 혈당치를 조절하는 데 도움을 줄 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 아이스 플랜트 추출물의 항산화능에 대한 검증에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능과 FRAP assay에 의한 항산화 효과는 chloroform과 ethyl acetate 분획이 거의 같은 수준으로 가장 높은 활성을 띠었고, butanol> hexane> aqueous 분획의 순으로 나타났다. 또한, 총 phenolic 함량과 lipid/MA assay에 의한 항산화 효과도 chloroform 분획이 가장 높았다. 따라서 chloroform과 ethyl acetate 분획에 항산화 활성을 나타내는 물질이 분포되어 있을 것으로 짐작되었다.
- 본 연구에서 아이스 플랜트 추출물의 항산화능에 대한 검증에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능과 FRAP assay에 의한 항산화 효과는 chloroform과 ethyl acetate 분획이 거의 같은 수준으로 가장 높은 활성을 띠었고, butanol> hexane> aqueous 분획의 순으로 나타났다.
- 본 연구의 분획별 총페놀 함량은 chloroform> ethyl acetate> butanol> hexane> aqueous 분획 순으로 많았으며, 각각 35.80±1.33, 23.70±0.62, 10.28±0.99, 7.69±1.52, 4.52±0.08 mg GAE/g의 함량을 나타내었다 (Fig. 2).
- 36 mg/g으로 나타났고, 콩의 chiro-inositol 성분 중 30~40%가 pinitol의 형태로, 40~50%가 galactopinitol의 형태로, 나머지 10~20%가 chiro-inositol의 형태로 존재한다고 밝혀졌다(29). 본실험에서는 총함량이 7.11 mg/g으로 더 많은 이노시톨 함유량을 나타내었다. 또한, Larner(30,31)의 연구에서 chiro-inositol 및 pinitol이 인슐린 비 의존형 당뇨병에서 당대사를 조절하는 능력을 가졌다는 연구 결과가 발표되었고, chiro-inositol의 섭취로 혈당 강하 효과가 나타나는 것이 확인되었다(32).
- 시료의 무기질 중 K와 Na의 함량이 각각 100 g당 1,213.33 ±2.52, 545.53±12.01 mg으로 가장 많았고, S, Ca, P, Mg 의 순으로 함유되어 있었다.
- 항산화 활성의 측정으로 DPPH는 분자내에 안정한 라디칼을 함유하지만, 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 라디칼이 소거되는 원리를 이용한 시료의 전자 공여능력을 측정하는 방법(33)으로 주로 phenolic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용된다. 아이스플랜트 분획 추출물의 농도에 따른 DPPH 라디칼소거능은 모든 용매분획물 에서 농도가 증가함에 따라 상승하였다. Chloroform과 ethyl acetate 분획에서 각각 4.
- 아이스플랜트의 cyclitol 화합물의 함량은 D-pinitol이 4.04±0.08 mg/g으로 가장 많았으며 myo-inositol은 0.25±0.01 mg/g, chiro-inositol은 2.82±0.01 mg/g으로 상대적으로 적게 함유되어 있었다(Table 1).
- 28 %로 높게 나타났다. 양성대조군인 BHA와 활성을 비교하였을 때 이들 세 분획에 높은 항산화능을 가진 물질이 분포되어 있음을 짐작할 수 있었다. Hexane과 aqueous 분획에서는 각각 8.
- 이 중에서 ethyl acetate 분획에서 90.33±0.40%로 가장 높았고, butanol과 chloroform 분획은 각각 87.98±0.16%와 86.38±0.51%로 비교적 높은 저해 활성을 나타내었다.
- 한편 항당뇨효과는 α-glucosidase 저해 활성에서 모든 용매분획에서 50% 이상의 활성을 나타내었으며, ethyl acetate, butanol 및 chloroform 분획에서 각각 90.33±0.40, 87.98±0.16 및 86.38±0.51%의 높은 활성을 나타내었다.
후속연구
- 아이스플랜트의 농도별 용매분획물의 DPPH, ABTS 및 FRAP 활성을 측정하였다(Table 2). 용매분획별 활성을 알아보면 활성을 나타내는 유효물질의 화학적 성질을 짐작할 수 있으므로 생리활성물질의 연구에 도움이 될 것으로 생각된다. 항산화 활성의 측정으로 DPPH는 분자내에 안정한 라디칼을 함유하지만, 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 라디칼이 소거되는 원리를 이용한 시료의 전자 공여능력을 측정하는 방법(33)으로 주로 phenolic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용된다.
- 67%로서 α-glucosidase 저해 활성보다는 낮았으나, 용매분획별 저해 활성은 유사한 경향을 보였다. 이와 같은 연구 결과로 볼 때 아이스플랜트가 항산화 및 항당뇨 기능성 천연소재로 활용이 가능할 것으로 생각되었다.
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