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문제 정의
- 본 연구는 ice plant의 생리활성을 측정하여 기능성 물질로서의 가능성을 조사하고자 하였다. Methanol, ethanol, 열수, 열수 추출 후 methanol로 추출하여 DPPH, pancreatic lipase, mushroom tyrosinase, α-glucosidase, NO 생성 저해활성과같은 여러가지 생리활성을 측정하였다.
- 본 연구에서는 ice plant의 methanol 추출물, ethanol 추출물, 열수 추출물, 열수 추출 후 methanol 추출물의 항산화, 항당뇨, 항비만, 미백 활성을 연구하여, 건강지향적 식품 개발을 위한 기초연구를 수행하였다.
제안 방법
- DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 free radical로서, 방향족, 아민류 등에 의해 환원되어 항산화 물질을 검색하는데 이용되고 있다[3, 7, 16, 30]. Ice plant 추출물 (MCM, MCE, MCHW, MCHM)의 농도를 100, 200, 400 μg/ ml으로 하여 소거능을 분석한 결과 Fig. 1과 같았다. MCM, MCE, MCHM, MCHW 추출물 400 μg/ml의 농도에서는 44.
- Ice plant 추출물(MCM, MCE, MCHW, MCHM)을 250, 500, 1, 000 μg/ml으로 하여 mushroom tyrosinase 저해활성을 측정하였다(Fig. 4). 그 결과, MCHW 추출물을 제외한 MCM, MCE, MCHM 추출물은 약 30%의 낮은 tyrosinase 저해 활성을 보였다.
- [24, 29, 31]. Ice plant 추출물의 염증 억제 활성을 측정하기위하여 mouse macrophage cell line인 Raw 264.7 cell에 LPS (1 μg/ml)로 처리한 후, ice plant 추출물(MCM, MCE, MCHW, MCHM)을 100, 200, 400 μg/ml 로 처리하여 생성된 nitrite (NO₂¯)의 양을 측정하였다(Fig 3). Raw 264.
- 가능성을 조사하고자 하였다. Methanol, ethanol, 열수, 열수 추출 후 methanol로 추출하여 DPPH, pancreatic lipase, mushroom tyrosinase, α-glucosidase, NO 생성 저해활성과같은 여러가지 생리활성을 측정하였다. 식물에서의 항산화활성은 주로 폴라보노이드, 폴리페놀, 탄닌, 페놀릭 테르펜 등과 같은 페놀릭 성분에 의해 나타나며[17, 32, 34], 페놀릭 성분의 용매별 추출 수율은 식물마다 다르게 나타나지만, 식물체에 열처리를 할 경우, 결합형의 폴리페놀 성분이 유리형으로 되어 활성이 증가한다고 보고되었다[10].
- 추출물 대신 추출용매를 가한 것을 대조구로 하여 NO 생성 저해활성(%)은 다음과 같이 나타내었다. NO 생성 저해활성(%)= (1-SAbs / CAbs)×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도)으로 계산하였다.
- Nitric oxide 생성 실험에 필요한 세포 배양액을 회수하고 남은 배지 및 세포를 사용하여 MTT assay를 하였다[14]. MTT 시약은 thiazolyl blue tetrazolium bromide를 최종농도 1 mg/ml가 되도록 PBS에 녹인 후 사용하였다.
- 지방 흡수의 중요한역할을 하는 lipase의 활성저해를 통하여 지방이 체내에 소화, 흡수를 저해 할 수 있다[6]. Pancreatic lipase 저해효과를 확인하기 위해, ice plant 추출물(MCM, MCE, MCHW, MCHM)을 250, 500, 1,000 μg/ml의 농도로 처리하여 저해활성을 측정하였다(Fig. 5). 그 결과, MCM 추출물, MCE 추출물에서 농도의존적으로 강한 저해활성을 보였고, MCHW 추출물, MCHM 추출물에서는 lipase 저해활성이 나타나지 않아서 lipase 저해하는 성분이 열에 불안정 할 것으로 예상된다.
- Tyrosinase 활성은 Hearing의 방법[12]을 변형하여 L-ty- rosine이 tyrosinase에 의해 3, 4 dihydroxy-L-phehylalanine (L-DOPA) quinone으로 전환되는 것을 측정하였다. 1 mM L-tyrosine과 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
- α-Glucosidase 저해활성 측정은 Kim의 방법[19]을 변형하여 측정하였다. 시료 6 μl와 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
- 건조된 ice plant 1 g을 각 용기에 넣고, methanol, ethanol을 각각 100 ml씩 넣어서 실온에서 하루 동안 추출하고 여과하여 상등액만을 취해 각각 methanol 추출물(MCM), ethanol 추출물(MCE)을 얻었다. 한편, ice plant 1 g을 용기에 넣어 증류수 100 ml을 넣고, autoclaver 에서 100℃, 1분간 추출하고 여과하여 얻은 열수 추출물(MCHW), 그 pellet에 methanol 100 ml을 넣어 실온에서 하루 동안 추출하여 열수 추출 후 methanol 추출물(MCHM)을 얻었다.
- 제조한 MTT 시약을 100 μl씩 첨가하여 2시간 동안 37℃에 반응시켜 MTT가환원되도록 하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 DMSO를 첨가하여 살아있는 세포의 mitochondria에서 MTT시약과의 반응으로 생성된 formazan이 녹아있는 시료액을 VERSAMAX mi- croplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여대조 구에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 세포 생존율(%)=(SAbs / CAbs)×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도)으로 계산하였다.
- DPPH 시약 180 μl에 시료 20 μl를 넣어 실온의 암실에서 30분간 반응을 한 후, VERSAMAX microplate reader (Molecular Devices, Toronto, Canada)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 추출물 대신 추출용매를 가하여 측정하였고, 저해 활성은 DPPH free radical 소거활성(%)=[1- {(SAbs-BAbs)/(CAbs-BAbs)}]×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs: 시약 무첨가구의 흡광도)으로 계산하였다. Positive control로는 ascorbic acid를 사용하였다.
- Lipase는 10 μl (10 mg/ml)씩 넣고 37℃ warm bath에서 30분간 반응하고, ice에 10분간 반응 정지시킨 후, 13, 000 rpm으로 1분간 원심분리 하여 그 상층액을 96 well plate에 넣어 VERSAMAX mi- croplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 추출물 대신 추출용매를 가하여 측정하였고, 저해 활성은 lipase 저해활성(%)=[1-{(SAbs-BAbs)/(CAbs -BAbs)}]×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs: 시약 무첨가구의 흡광도)으로 계산하였다. Positive control로는 orlistat를 사용하였다.
- 반응 후 변화된색을 VERSAMAX microplate reader를 이용하여 475 nm에서흡광도를 측정하였다. 대조구로는 추출물 대신 추출용매를 가하여 측정하였고, 저해 활성은 tyrosinase 저해활성(%)=[1- {(SAbs-BAbs)/(CAbs-BAbs)}]×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs: 시약 무첨가구의 흡광도)으로 계산하였다. Positive control로는 kojic acid를 사용하였다.
- 반응 후, 10분간 ice에서 반응을 정지시킨 후, 13, 000 rpm에서 1분간 원심분리하고, 96 well plate에 넣어 VERSAMAX microplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 추출물 대신 추출용매를 가하여 측정하였고, 저해 활성은 α-gluco- sidase 저해활성(%)=[1-{(SAbs-BAbs)/(CAbs-BAbs)}]×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs: 시약 무 첨가 구의 흡광도)으로 계산하였다. Positive control로는 acarbose 를 사용하였다.
- 생성된 NO의 농도는 배양액 내의 nitrite (NO₂¯) 농도를 Griess reagent와 반응을 측정하였다[9, 25]. Mouse macro- phage cell line인 Raw 264.
- 그 후, 배양액을 제거하고 DMSO를 첨가하여 살아있는 세포의 mitochondria에서 MTT시약과의 반응으로 생성된 formazan이 녹아있는 시료액을 VERSAMAX mi- croplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여대조 구에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 세포 생존율(%)=(SAbs / CAbs)×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도)으로 계산하였다.
- 1% NED (N-(1- napthyl) ethylenediamine hydrochloride in dissolved 60% acetic acid)와 1% sulfanilamide (in dissolved 40% acetic acid)를 동량으로 섞은 시약을 100 μl 넣고, 10분간 상온에서반응시킨 후, VERSAMAX microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 대신 추출용매를 가한 것을 대조구로 하여 NO 생성 저해활성(%)은 다음과 같이 나타내었다. NO 생성 저해활성(%)= (1-SAbs / CAbs)×100 (CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도)으로 계산하였다.
대상 데이터
- 각 분리 단계에 이용된 유기용매는 (주) SK 케미칼(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 1, 1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), α-glucosidase, p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (pNPG), pancreatic li- pase (porcrine pancrease), p-nitrophenyl palmitate (pNPP), mushroom tyrosinase, acarbose, ascorbic acid, orlistat, kojic acid 등은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA)에서 구입하였다.
- Ice plant (Mesembryanthemum crystallinum)는 진주의 ㈜ LFT에서 제공한 것을 사용하였다. 각 분리 단계에 이용된 유기용매는 (주) SK 케미칼(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 제공한 것을 사용하였다. 각 분리 단계에 이용된 유기용매는 (주) SK 케미칼(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 1, 1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), α-glucosidase, p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (pNPG), pancreatic li- pase (porcrine pancrease), p-nitrophenyl palmitate (pNPP), mushroom tyrosinase, acarbose, ascorbic acid, orlistat, kojic acid 등은 Sigma-Aldrich Co.
데이터처리
- 모든 실험의 결과는 3번 반복 수행하여 얻어진 것으로, 통계분석은 ANOVA에 의해 분석하여 mean ± S.D로 표시하였고, 통계적 유의성은 p≤0.05로 판정하였다.
이론/모형
- Pancreatic lipase의 활성은 Kim 등[18]의 방법을 변형하여기질로 사용된 p-nitrophenyl palmitate (pNPP)가 lipase 효소에 의하여 p-nitrophenol로 가수분해되는 정도를 이용하였다. 1.
- 추출물의 항산화 활성은 DPPH free radical 소거법을 이용하여 측정하였다[15, 21]. 1, 1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 시약을 1.
성능/효과
- α-Glucosidase를 저해하면 소장에서의 포도당 흡수를 억제시켜, 식후 혈당의 급격한 증가를 막아 혈당을 조절해 준다[1]. Ice plant 추출물(MCM, MCE, MCHW, MCHM)을 이용하여 α-glucosidase 저해활성을 조사하기 위하여 각 추출물을 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도에서 실험한 결과(Fig. 2), MCHM 추출물에서 가장 높은 α-glucosidase 저해활성이 나타났고 2 mg/ml의 농도에서는 positive control로 사용된 acarbose와 유사한 56.6% 저해활성을 보였다. 한편 2 mg/ml의 MCM, MCE 추출물 에서도 39.
- 7 cell에 LPS를 처리한 군은 무처리 군에 비해 NO의 생성이 약 5배증가하였다. LPS를 처리 한 후 ice plant 추출물을 400 μg/ml 농도로 각각 처리했을 때, MCM 추출물, MCE 추출물은 NO 생성을 57.2%, 54.9%로 억제하였고, MCHM 추출물에서는 73.5%가 억제 되는 것을 확인하였다. NO 생성 저해가 세포독성에 기인하는 것인지를 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인한 결과, 세포독성은 나타나지 않았다.
- 1과 같았다. MCM, MCE, MCHM, MCHW 추출물 400 μg/ml의 농도에서는 44.8%, 51.3%, 33.5%, 62.9%의 DPPH free radical 소거 활성을 보였다. 이를 통해 ice plant 의 각 추출물이 항산화 활성을 가지는 것으로 추정된다.
- 5%가 억제 되는 것을 확인하였다. NO 생성 저해가 세포독성에 기인하는 것인지를 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인한 결과, 세포독성은 나타나지 않았다. 따라서 ice plant의 성분이 macrophage 에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 저해하여 항염증 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 NO 생성의 저해는 염증반응의 조절 치료제로서의 가능성이 있고, ice plant의 methanol과 ethanol 추출물은 농도 의존적으로 iNOS 발현을 저해하여 NO 생산을 감소시킬 것으로 예상된다. Pancreatic lipase 저해활성에서도 MCM, MCE, MCHM 추출물에서 농도 의존적으로 저해 활성이 나타났지만, positive control인 orlistat에 비해 현저히 낮은 저해율을 보였다. 하지만, 천연 식물 추출물의 경우 단일물질로 정제되면 활성이 높아지는 경향이 보이므로 활성 물질의 추출 및 분리로 더욱 효과적인 lipase 저해능을 가질 것으로 보인다.
- 따라서 기존의 비만 치료제의 부작용을 대체 할 수 있는 천연항비만 물질로 기대되었다. α-Glucosidase 저해활성을 조사한 결과, MCHM 추출물에서 강한 활성을 보였으나, acarbose에 비해 낮은 α-glucosidase 저해활성을 보였다. Ice plant에서는 D-pinitol과 inositol이 풍부한 것으로 알려졌고, HPLC를 사용하여 ice plant 추출물에 D-pinitol이 포함된 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
- 각추출물의 추출 수율은 MCMe 0.37%, MCEe 0.33%, MCHWe 0.5%, MCHMe 0.07%로 나타났으며 열수 추출물의 추출수율이 가장 높게 나타났고, 열수 추출 후 methanol로 추출한 MCHM의 경우 추출물의 수율이 가장 낮았다.
- 4). 그 결과, MCHW 추출물을 제외한 MCM, MCE, MCHM 추출물은 약 30%의 낮은 tyrosinase 저해 활성을 보였다. 따라서, ice plant는 저해 활성은 낮지만 melanin 합성을 저해하여 미백작용에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 5). 그 결과, MCM 추출물, MCE 추출물에서 농도의존적으로 강한 저해활성을 보였고, MCHW 추출물, MCHM 추출물에서는 lipase 저해활성이 나타나지 않아서 lipase 저해하는 성분이 열에 불안정 할 것으로 예상된다. 따라서 ice plant 추출물은 pancreatic lipase에 대해 저해활성을 보여 항비만 효과가 기대되었다.
- NO 생성 저해가 세포독성에 기인하는 것인지를 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인한 결과, 세포독성은 나타나지 않았다. 따라서 ice plant의 성분이 macrophage 에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 저해하여 항염증 효과가 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 그러나 D-pinitol이 인슐린의 역할을 하여 혈당을 낮추는데 도움을 준다고 알려져[26, 27] α-gluco- sidase의 저해활성이 기대되었으나 저해활성이 강하지는 않았다. Ice plant의 α-glucosidase 저해활성과 D-pinitol의 존재로 당뇨병 치료나 예방에 효과가 좋은 기능성 식품의 가능성이 기대되었다.
- 결론적으로 ice plant는 pancreatic lipase, α-glucosidase, NO 생성 등을 저해하고, DPPH free radical 소거능이 우수하여, 항산화 물질로서 비만, 당뇨, 염증 치료용 기능성 식품으로서의 가능성을 보여 이를 위한 추가 연구를 진행할 예정이다.
- 따라서 MCHW 추출물에서 가장 높은 항산화 활성을 보인 것은, ice plant의 열수 추출물 또한 열처리로 인하여 조직과 강하게 결합되어 있던 유효성분이 유리형으로 전환되어 항산화 효과가 증가된 것으로 생각된다. 차후에 ice plant의 폴리페놀과 폴라보노이드 화합물의 함량에 대한 연구를 추가로 진행할 예정이다. NO 생성억제 능에서는 MCM, MCE, MCHM와 같이 유기용매에 의한 추출물에서 농도 의존적으로 저해활성을 보여 염증 저해 활성이 예상된다.
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