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문제 정의
- 본 연구에서는 혈중요산 감소에 도움을 주는 건강기능식품 개발을 위하여 다양한 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물의 XOD 저해 효능을 검색하고 표준화를 위하여 함량이 높은 3,5-dicaffeoylquinic acid(3,5-DCQA)를 지표성분으로 선정하여 high performance liquid chromatography-ultraviolet(HPLC-UV)을 활용한 함량 분석법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 3,5-DCQA 1 mg을 정밀히 취하여 메탄올 1 mL에 용해 시켜 표준원액을 제조한 후 메탄올로 희석하여 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6 및 7.81 μg/mL 농도에서 반복 측정하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다(11).
- 섬쑥부쟁이 EtOAc 분획(AGEF, 971E)으로부터 다양한 column chromatography를 실시하여 3,5-DCQA를 분리하여 구조를 동정한 후 지표물질로 이용하였다. 3,5-DCQA 와 상대적인 함량 비교를 위하여 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물에 함유되어있는 5-caffeoylquinic acid(5-CQA)도 분리하여 비교 분석하였다.
- 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ): 검량선의 y절편의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로, 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량선을 작성하여 다음의 식에 따라 계산하여 검출한계와 정량한계를 확인하였다.
- 다양한 AGE에서의 3,5-DCQA의 함량 분석은 3회 반복 실험하여 계산하여 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 이에탄올 추출물에 높은 함량을 나타내고 있는 5-CQA도 분석하여 3,5-DCQA의 함량과 비교하였다.
- 0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 320 nm 파장에서 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. 3,5-DCQA의 검량선으로부터 상관계수(R2)0.
- 이동상으로는 메탄올과 1% 초산용액을 사용하여 1 mL/min의 유속으로 시료 10 μL를 주입하여 gradient condition으로 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다. 분석시료는 320 nm에서 크로마토그램을 추출하여 3,5-DCQA 피크 면적을 얻은 다음 표준화합물의 검량곡선으로부터 각 화합물의 함유량을 계산하였다.
- 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물(AGE)은 70과 80°C에서 30, 50, 70, 80% 에탄올로 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 추출하였으며, 지표물질의 검량곡선을 활용하여 각각의 AGE로부터 3,5-DCQA의 함량을 분석하였다.
- 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물(AGE)의 기능성 원료 개발을 위해 30, 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70과 80°C에서3, 4, 5, 6시간 동안 환류 추출하여 각각의 AGE를 수득하였다.
- 본 실험에 사용한 섬쑥부쟁이는 2015년 10월에 울릉도에서 지상부를 채취하여 전문가(육창수 경희대학교 약학대학 명예교수)의 동정을 받아 사용하였으며, 증거시료(971-12A)는 한국과학기술연구원 표본실에 보관하고 있다. 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물의 성분분석에 사용한 3,5-DCQA는 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획에서 분리한 것으로 기기 분석을 활용한 구조분석 후 사용하였다(Fig. 1)(4,10).
- 섬쑥부쟁이로부터 고요산혈증 개선에 도움을 주는 기능성식품 개발을 위하여 최적의 에탄올 추출물 탐색과 high performance liquid chromatography-ultraviolet(HPLCUV) 분석방법에 의한 validation을 실시하였다. 지표성분으로 3,5-dicaffeoylquinic acid(3,5-DCQA)를 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 3,5-DCQA 정량 분석은 Luna RP-18 칼럼(4.
- 정확성: 일정농도의 3,5-DCQA 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 일내분석(intra-day)과 일간분석(inter-day)의 변이성을 측정하였다. 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 3,5-DCQA의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 나타내었다.
- 6×250 mm, 5 μm)을 이용하여1% 초산용액과 메탄올을 전개용매로 사용하였다. 용출은1.0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 320 nm 파장에서 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다.
- 이동상으로는 메탄올과 1% 초산용액을 사용하여 1 mL/min의 유속으로 시료 10 μL를 주입하여 gradient condition으로 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다.
- 잔틴과 잔틴산화효소의 반응으로 생성된 요산은 고요산 혈증 유발물질로, XOD를 억제하는 기능성 식품 개발을 위하여 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물을 제조하여 XOD 억제 효능을 검색하였으며 알로퓨리놀을 대조약물로 사용하여 결과를 Table 5에 나타내었다.
- 잔틴산화효소 저해 효능은 Noro 등(12)의 방법을 약간 수정하여 검색하였으며, 잔틴과 잔틴산화효소가 반응하여 생성되는 요산의 양을 spectrophotometry를 이용하여 측정하였다.
- 정밀성: 성분피크 면적비의 표준편차를 각 성분피크 면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율로서 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 확인하여 정밀성을 나타내었다.
- 정확성: 일정농도의 3,5-DCQA 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 일내분석(intra-day)과 일간분석(inter-day)의 변이성을 측정하였다. 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 3,5-DCQA의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 나타내었다.
- 제조공정의 추출조건을 검토하기 위하여 섬쑥부쟁이 건시료 10 g에 150 mL의 30, 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70 및 80°C에서 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 환류 추출한 후 종료시점에 상층액을 취하여 0.45 μm PVDF syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
- 지표성분으로 3,5-dicaffeoylquinic acid(3,5-DCQA)를 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 3,5-DCQA 정량 분석은 Luna RP-18 칼럼(4.6×250 mm, 5 μm)을 이용하여1% 초산용액과 메탄올을 전개용매로 사용하였다.
- 45 μm PVDF syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다. 추출물은 감압 여과한 후 농축하고 진공 상태로 완전 건조시켜 에탄올 추출물을 수득하였으며 잔틴산화효소(XOD) 저해 효능 검색에 사용하였고 같은 방법으로 총 3회 실시하였다.
- 특이성: 3,5-DCQA 표준용액과 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물을 HPLC로 분석하여 크로마토그램상의 retention time과 spectrum을 비교하였다.
대상 데이터
- HPLC 기기는 Waters 1500 Series System, Waters 2998 PDA Detector(Waters, Worcester, MA, USA), Luna C18(5 μm, 250×4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)칼럼을 사용하였으며 분석에 사용된 모든 용매는 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 HPLC급 용매를 사용하였다.
- Xanthine oxidase와 allopurinol은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 효능검색에 사용한 검출기는 Epoch microplate spectrophotometer(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 295 nm에서 흡광도를 측정하여 억제 효능을 분석하였다.
- 본 실험에 사용한 섬쑥부쟁이는 2015년 10월에 울릉도에서 지상부를 채취하여 전문가(육창수 경희대학교 약학대학 명예교수)의 동정을 받아 사용하였으며, 증거시료(971-12A)는 한국과학기술연구원 표본실에 보관하고 있다. 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물의 성분분석에 사용한 3,5-DCQA는 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획에서 분리한 것으로 기기 분석을 활용한 구조분석 후 사용하였다(Fig.
- 섬쑥부쟁이 EtOAc 분획(AGEF, 971E)으로부터 다양한 column chromatography를 실시하여 3,5-DCQA를 분리하여 구조를 동정한 후 지표물질로 이용하였다. 3,5-DCQA 와 상대적인 함량 비교를 위하여 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물에 함유되어있는 5-caffeoylquinic acid(5-CQA)도 분리하여 비교 분석하였다.
- 섬쑥부쟁이 에탄올 추출은 95% 에탄올(Samchun Chemical, Gyeonggi, Korea)을 사용하였다. 제조공정의 추출조건을 검토하기 위하여 섬쑥부쟁이 건시료 10 g에 150 mL의 30, 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70 및 80°C에서 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 환류 추출한 후 종료시점에 상층액을 취하여 0.
데이터처리
- 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며 표준편차(σ)는 정량한계 내에 있는 분석대상 물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한 후 y절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용하였다.
- 다양한 AGE에서의 3,5-DCQA의 함량 분석은 3회 반복 실험하여 계산하여 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물의 건강기능 식품 기능성 원료 및 기준규격인정 및 품질관리를 위한 벨리데이션은 식품의약품안전처의 의약품 등 분석법의 벨리데이션 가이드라인에 기초하여 수행되었다(11).
성능/효과
- 1)IC50 is the concentration of a sample needed to inhibit 50% of xanthine oxidase; allopurinol (positive control): IC50=2.14±0.21μM.
- 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. 3,5-DCQA의 검량선으로부터 상관계수(R2)0.9999의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 90% 이상의 회수율과 5% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 검출한계는 2.
- 41%를 나타내 5% 이내의 정밀성을 나타내었다. Inter-day 분석은 95.04~103.61%를 나타내 우수한 회수율을 보여주고 있으며, RE는 0.97~4.96%로, RSD는 0.39~4.05%로 나타나 정확성과 정밀성을 확인할 수 있었다.
- 3,5-DCQA 표준용액 일내(intra-day), 일간(inter-day) 분석의 정밀성, 정확성 및 회수율을 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. Intra-day 분석에서 회수율은 시료 면적을 검량선에 근거하여 회수되는 시료 양을 백분율로 계산한 결과 91.81~101.08%의 범위로 나타났으며, 상대오차(relative error, RE)는 10% 이내였다. 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 0.
- 22 mg/A. glehni 100 g으로 가장 높게 측정되었으며, 80% 에탄올 용액 추출물은 40.50 mg(5시간 추출)과 33.64 mg/A. glehni 100 g(6시간 추출)으로 6시간 추출물에서 가장 낮은 3,5-DCQA의 함량을 나타내고 있다.
- 77 mg/A. glehni 100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었으나, 80℃에서 추출한 경우와 유사하게 에탄올 함량이나 추출시간 변화에 따른 5-CQA 함량 변화는 미미하게 나타나 3,5-DCQA 함량과 다소 상이한 결과를 보여주었다. 그러므로 AGEs에서의 표준화를 위해서는 지표성분으로 3,5-DCQA를 선정함이 타당할 것으로 생각한다.
- 45 mg/A. glehni 100 g의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났으며, 3,5-DCQA의 함량에 따라 잔틴산화효소 저해 효능이 나타났기에, HPLC-UV를 이용한 3,5-DCQA 함량 분석 방법이 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물의 표준화에 유용할 것으로 생각한다.
- 또한, 다양한 AGE에 대하여 XOD 저해 효능을 검색하였을 때, 3,5-DCQA의 함량이 가장 높은 70°C에서 추출한 70% AGE에서 우수한 효능을 나타내 기능성 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다.
- 3). 또한, 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물에서 분리한 3,5-DCQA 표준용액의 검량곡선은 3회 반복 실험하여 얻은 평균값으로 계산하였으며 y=6320.8x+6163.8, 상관관계(R2)=0.9999로 나타나 매우 우수한 직선성을 나타내었다. 여기서 y는 peak area 값이며 x는 농도(μg/mL)이다(Fig.
- 본 시험법으로 분석한 3,5-DCQA의 함량은 70°C에서 추출한 70% AGE가 52.59±3.45 mg/Aster glehni 100g의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다.
- 08 μg/mL의 비교적 우수한 효능을 나타내고 있다. 이 결과는 Table 4의 에탄올 추출물의 3,5-DCQA 함량 분석과 일치하는 결과를 나타내고 있는데, 3,5-DCQA 함량이 높은 추출물에서 잔틴산화효소 저해 효능도 우수하게 나타나고 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합하면, 섬쑥부쟁이는 70°C에서 70%에탄올로 추출한 AGE가 52.59±3.45 mg/A.
- 표준용액과 같이 시료 전처리 방법으로 처리한 섬쑥부쟁이 추출액의 크로마토그램을 비교하여 3,5-DCQA 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 표준용액 3,5-DCQA의 머무름 시간(Rt)은 15.
후속연구
- 또한, 다양한 AGE에 대하여 XOD 저해 효능을 검색하였을 때, 3,5-DCQA의 함량이 가장 높은 70°C에서 추출한 70% AGE에서 우수한 효능을 나타내 기능성 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 확립된 3,5-DCQA의 분석법은 섬쑥부쟁이 에탄올 추출물로부터 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
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