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문제 정의
- 특히 퉁퉁마디 추출물에 대한 극성별 분획의 항산화적 특성, 산화방지 효과를 나타내는 폴리페놀성 물질이 가지는 산화촉진 효과 및 이러한 활성이 세포독성에 미치는 영향에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 퉁퉁마디 지상부의 70% 메탄올추출물로부터 극성에 따른 분획을 얻은 후, 각 추출물 분획에 대한 라디칼 소거능, 지방질 과산화 억제 효과와 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성을 통한 산화촉진활성을 조사하였으며, 정상장관계 세포와 대장암 세포에 대한 각 분획의 독성을 평가하고 이에 미치는 산화촉진 활성의 영향을 평가하여 궁극적으로 퉁퉁마디의 식품기능성 소재로서 이용가능성 확대를 위한 기본정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 각 분획 시료 100 μL와 600 μM DPPH 메탄올 용액 100 μL 를 혼합하여 상온의 암소에서 30분간 반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 Jara and Fulgencio의 방법(23)을 변형하여 측정하였다. 10 mM ABTS와 10 mM 과황산포타슘(potassium persulfate)을 7.
- EA에 의해 생성되는 ROS가 세포독성에 미치는 영향을 파악하기 위해 INT-407세포에 Fr.EA와 농도를 달리한 항산화제 ascorbic acid 또는 N-acetylcysteine을 같이 처리하여 독성변화의 추이를 살펴보았다. 흥미롭게도 1 mM ascorbic acid 또는2 mM N-acetylcysteine에 의한 세포독성은 나타나지 않았으나, 각 항산화제와 Fr.
- 3C). Fig. 3C에 나타난 퉁퉁마디분획의 ROS 생성능이 세포 의존성을 띄는지 확인하기 위해 cell free system에서도 ROS 생성능을 분석하였다. 그 결과, 세포가 없는 PBS 환경에서도 Fr.
- B, 및 Fr.W, 5분획의 산화방지 효과, ROS 생성효과, 세포독성 효과 및 관련 기작에 대한 기능성을 검토하였다. 이 중 Fr.
- 각 분획 시료 400μL에 0.8% sodium dodecyl sulfate로 희석한 0.4% 리놀레산을 500 μL 첨가하고 100 μM ascorbic acid 및 10 μM FeSO4를 가하여 총 반응 부피가 1 mL이 되게 하였다.
- 각 분획 시료 50 μL에 5% NaNO2 30 μL를 가하여 5분간 상온에 방치한 후, 60 μL의 AlCl3를 첨가 하여 6분간 반응 시켰다.
- 각 분획은 200 mg/mL 농도로 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹여 aliquot을 만들었고 −80ºC 초저온냉동고(Ilshin Lab., Yangju, Korea)에 저장하였다.
- 이후 4% NaOH 100 μL를 첨가하여 11분간 반응 시킨 다음 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도를 달리한 타닌산 및 카데킨으로 표준검량곡선을 작성하여 시료 내 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 각각 계산하였다.
- 세포 내 ROS 수준은 2',7'-dichlorofluorescin-diacetate (DCFHDA)를 이용하여 측정하였다(27).
- 세포독성은 MTT 를 이용하여 측정하였는데 96 well plate의 well당 1.5×104 세포를 접종하여 24시간 배양한 후, 각 분획 또는 H2O2가 포함된 serum free 배지로 교체하여 24시간 처리하였다.
- 세포에 90분간 분획을 처리한 상기 배양액, 또는 농도를 달리한 각 분획을 PBS에 희석하여 37oC에서 30분간 반응시킨 시료 40 μL에 100 μM xylenol orange와 200 mM 소비톨(D-sorbitol) 및 500 μM ammonium ferrous sulfate를 포함하는 FOX 용액 160 μL을 첨가하였다.
- 시료 50 μL 에 100 μM NaNO2 100 μL를 가하여 37oC의 암소에서 1시간 반응 시킨 후, 5% H3PO4로 희석한 1% sulfanilamide를 첨가하여 암소에서 5분간 반응시켰다.
- 이 용액을 인산완충소금물(phosphate buffered saline, PBS) 와 적정비율로 희석한 후, 시료 50 μL에 희석한 ABTS 라디칼 solution을 150 μL 가하여 상온의 암소에서 30분간 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산이온(nitrite) 소거 활성은 Gray and Dugan의 방법(24)을 변형하여 측정하였다. 시료 50 μL 에 100 μM NaNO2 100 μL를 가하여 37oC의 암소에서 1시간 반응 시킨 후, 5% H3PO4로 희석한 1% sulfanilamide를 첨가하여 암소에서 5분간 반응시켰다.
- 이를 37oC에서 1시간 반응시킨 후, 1 M 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid)과 0.8% 싸이오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA) 125 μL 및 에탄올에 희석한 5% 뷰틸하이드록시톨루엔(buthylated hydroxytoluene, BHT) 20 μL를 가한 후, 100oC에서 1시간 발색시키고 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 폴리페놀 함량 측정을 위하여 각 분획시료 80 μL에 50% 폴린-시오칼토페놀 시약 20 μL를 가한 후 상온에서 3분간 반응시켰다.
- 퉁퉁마디 분획에 의한 지방질 과산화물 생성 억제 효과는 Ambati 등의 방법(25)을 응용하여 측정하였다. 각 분획 시료 400μL에 0.
- 퉁퉁마디 지상부 분획이 세포 내에서 나타내는 산화방지 효과를 조사하기 위하여 각 분획을 처리한 세포 내 ROS 수준을 분석하였다. DCFH-DA는 세포 투과성 물질로 세포 내로 이동하여 에스테르가수분해효소(esterase)에 의해 비형광성 분자인 DCFH로 전환된 후, 세포 내의 ROS에 의해 형광성 DCF로 전환된다.
- 퉁퉁마디 지상부 추출물 분획을 대장암 세포주인 HCT-116와 정상장관계 세포주인 INT-407에 처리하여 세포 독성을 평가하였다. 각 분획을 400 μg/mL 농도로 처리하였을 때 Fr.
- 퉁퉁마디 지상부 추출물 분획의 지방질과산화 억제효과를 Fenton 반응에 의해 유발된 리놀레산 산화반응계에서 분석하였다. 그 결과 모든 분획이 1 mg/mL 농도에서 유의적으로 지방질과산화를 억제하였으며, Fr.
대상 데이터
- 대장암 세포주인 HCT-116와 정상 장관계 세포인 INT-407는 10% 송아지태아혈청(fetal bovine serum, FBS)와 항생제(100 U/ mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin)가 첨가된 RPMI 1640과 MEM 배지(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)를 각각 사용 하여 37oC, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다. 세포독성은 MTT 를 이용하여 측정하였는데 96 well plate의 well당 1.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 대장암 세포주인 HCT-116와 정상 장관계 세포인 INT-407는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, 3-(-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다. 이외에 사용된 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하여 이용하였다.
- 수세한 퉁퉁마디 지상부를 −80ºC 초저온냉동고에서 냉동한 후, 동결건조기(Labconco Co., Kansas city, MO, USA)를 이용하여 건조시키고, 분말 형태로 만들어 dry keeper (Sanplatec Corp., Osaka, Japan)에 저장하였다.
- 대장암 세포주인 HCT-116와 정상 장관계 세포인 INT-407는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, 3-(-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다. 이외에 사용된 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하여 이용하였다.
- 퉁퉁마디는 대신함초(Sinan, Korea)로부터 8월에 수확한 것을 구입하였다. 폴린-시오칼토페놀(Folin-Ciocalteu’s phenol) 시약은 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였고, AlCl3은 Junsei (Tokyo, Japan)에서, 1,1-diphenyl-2-picrydrazyl (DPPH), 2,2'-azobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic-acid) (ABTS) 및 N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride (NED)는 Sigma-Aldrich사(St.
- 폴린-시오칼토페놀(Folin-Ciocalteu’s phenol) 시약은 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였고, AlCl3은 Junsei (Tokyo, Japan)에서, 1,1-diphenyl-2-picrydrazyl (DPPH), 2,2'-azobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic-acid) (ABTS) 및 N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride (NED)는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test (in A).
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test.
- 모든 측정값은 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험군별 유의차 분석은 Student’s t-test 또는 One-way ANOVA와 Tukey’s HSD test를 실시하여 95% 또는 99%의 유의 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거활성은 Blois의 방법(22)에 의하여 측정하였다. 각 분획 시료 100 μL와 600 μM DPPH 메탄올 용액 100 μL 를 혼합하여 상온의 암소에서 30분간 반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 535 nm에서 측정하였다. 각 분획으로부터 생성된 H2O2량은 ferrous oxidation xylenol orange (FOX) 분석법을 이용하여 측정하였다 (28). 세포에 90분간 분획을 처리한 상기 배양액, 또는 농도를 달리한 각 분획을 PBS에 희석하여 37oC에서 30분간 반응시킨 시료 40 μL에 100 μM xylenol orange와 200 mM 소비톨(D-sorbitol) 및 500 μM ammonium ferrous sulfate를 포함하는 FOX 용액 160 μL을 첨가하였다.
- 이 반응액에 2% Na2CO3 100 μL를 첨가하여 상온에서 30분간 방치한 후, 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max 250; Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다(20). 총 플라보노이드 함량은 Lee 등의 방법(21)을 응용하여 측정하였다. 각 분획 시료 50 μL에 5% NaNO2 30 μL를 가하여 5분간 상온에 방치한 후, 60 μL의 AlCl3를 첨가 하여 6분간 반응 시켰다.
성능/효과
- E는 DPPH 라디칼에 대해 동일한 농도에서 각각 54, 35, 및 25%의 소거 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거 능을 측정한 결과, DPPH 라디칼 소거능과 유사한 활성순서를 나타내었다(Fig. 1B). 각 분획은 농도 의존적으로 ABTS 라디칼을 소거하였으며, Fr.
- B와 Fr.EA가 가장 높은 활성을 나타내어, 약 80%의 리놀레산의 산화물질인 TBA 반응물질(TBARS)의 생성 억제활성을 보였다(Fig. 2A). Fr.
- EA가 가장 높은 활성을 나타내었고, 20 μg/mL 농도에서도 약 80%의 아질산이온을 소거하여 그 이상의 농도에서 활성이 포화되는 현상을 보였다(Fig. 1C).
- EA가 더 강한 활성을 보이면서 HCT-116와 INT-407에 대해 각각 138 μg/mL와 211 μg/mL의 IC50를 나타내었고, 정상장관계 세포인 INT-407보다 대장암 세포인 HCT-116에 대해 더 강한 독성 효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 4D).
- Fr.EA는 DPPH와 ABTS 라디칼 및 아질산이온의 소거에 있어서도 다른 분획들보다 유의적으로 높은 활성을 나타내었으며, 특히 아질산이온의 소거에 가장 뛰어난 활성을보였다. 리놀레산 지질과산화 시스템에서는 Fr.
- 한편 Fr.W를 제외한 모든 분획에서도 DPPH와 ABTS 라디칼에 대한 소거활성 보다 아질산이온에 대한 소거활성이 유의적으로 높게 나타났다.
- EA에 의해 생성되는 수준의 ROS는 세포독성의 유발보다는 세포성장을 촉진하여 오히려 독성발현 효과에 대한 길항작용을 하는 것으로 판단된다. 결론적으로 퉁퉁마디 분획중의 폴리페놀 성분들은 세포배양액 중에서 ROS를 생성하여 세포의 성장을 일부 촉진하는 반면, 세포 내부의 환경에서 ROS를 제거하는 산화방지 효과를 나타내어 세포의 성장및 사멸의 조절에 관여할 수 있을 것으로 판단된다.
- 일반적으로 폴리페놀 물질 및 플라보노이드 화합물은 DPPH 라디칼을 비롯한 각종 라디칼에 뛰어난 소거작용을 나타낸다고알려졌다(30). 본 결과는 각 분획의 폴리페놀류 및 플라보노이드 물질의 함량과 비교적 일관된 경향을 나타내어 퉁퉁마디 지상부분획의 산화방지 활성은 대부분 각 분획이 함유한 폴리페놀 및 플라보노이드성 물질로부터 기인한 것으로 판단된다.
- DCFH-DA는 세포 투과성 물질로 세포 내로 이동하여 에스테르가수분해효소(esterase)에 의해 비형광성 분자인 DCFH로 전환된 후, 세포 내의 ROS에 의해 형광성 DCF로 전환된다. 산소에 노출된 세포에서는 정상적인 호흡 및 성장과정 중에 필연적으로 ROS가 발생하는데, 퉁퉁마디 분획은 이러한 세포 내 ROS 수준을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 각 퉁퉁마디 분 획을 400 μg/mL 농도로 처리하였을 때 Fr.
- 3C). 이상의 결과는 각 퉁퉁마디 분획이 세포 내로 이행되어 세포 내에서는 ROS를 제거하는 산화방지 효과를 발휘하지만, 세포 외부의 배양액 환경에서는 오히려 ROS를 생성 하여 산화촉진 작용을 할 수 있다는 것을 의미한다.
- 이상의 결과에서 퉁퉁마디 지상부 분획 특히 폴리페놀류와 플라보노이드 화합물을 다량 함유한 중간 극성 분획들이 각종 라디칼에 대한 강한 소거활성과 함께 지방질 과산화 억제 활성 및 세포독성 유도효과를 나타내었으며, 이들 분획은 ROS를 생성하는 산화촉진 효과도 같이 나타냄을 확인하였다. 향후 이러한 기능성과 관련된 유효성분의 단리, 동정 및 보다 면밀한 관련 기작의 연구를 통하여 염생식물 퉁퉁마디의 식품 기능성 소재로서 활용방향의 다양화와 이용성이 더욱 확대되어야 할 것으로 보인다.
후속연구
- EA와 항산화제인 ascorbic acid 및 N-acetylcysteine을 같이 세포에 처리하였을 때 세포 독성이 유의적으로 증가하는 현상을 나타내었다. 본 연구에서는 퉁퉁마디 지상부 분획의산화방지 및 산화촉진 효과와 세포독성 효과를 보고하였으며, 향후 계속적인 연구를 통해 기능성 소재로서의 퉁퉁마디의 이용성 확대가 지속될 것으로 기대한다.
- 이상의 결과에서 퉁퉁마디 지상부 분획 특히 폴리페놀류와 플라보노이드 화합물을 다량 함유한 중간 극성 분획들이 각종 라디칼에 대한 강한 소거활성과 함께 지방질 과산화 억제 활성 및 세포독성 유도효과를 나타내었으며, 이들 분획은 ROS를 생성하는 산화촉진 효과도 같이 나타냄을 확인하였다. 향후 이러한 기능성과 관련된 유효성분의 단리, 동정 및 보다 면밀한 관련 기작의 연구를 통하여 염생식물 퉁퉁마디의 식품 기능성 소재로서 활용방향의 다양화와 이용성이 더욱 확대되어야 할 것으로 보인다.
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