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문제 정의
- 그러나 현재까지 블랙커런트의 항혈전 활성에 대해서는 알려진 바 없다. 본 연구에서는 다양한 유용생리활성을 가진 블랙커런트의 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 항산화 및 항혈전 활성을 평가한 결과, 폴리페놀 고함유 분획물에서 강력한 항혈전 활성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 블랙커런트 착즙액 및 이의 분획물의 세포독성 평가를 위해 인간 적혈구 용혈활성을 측정하였다. 먼저 대조구로 사용된 DMSO는 용혈활성이 없었으며, triton X-100 (1 mg/ml)와 amphotericin B (0.02 mg/ml)는 적혈구를 100% 및 96.5% 이상 용혈시켜 세포독성을 확인하였다. 반면 블랙커런트의 모든 시료에서는 0.
- 보다 자세하게는 10 mM CaCl2 50 μl, suspending buffer 147.5 μl, 블랙커런트 시료 5 μl가 포함된 반응 cuvette에 50 μl의 인간 유래 혈소판(5×108 cells/ml)을 첨가하고 3분 동안 37℃로 가온 후, 응집유도제로 collagen (1 mg/ml)을 2.5 μl를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다.
- 블랙커런트 착즙액 및 이의 분획물의 세포독성 평가를 위해 인간 적혈구 용혈활성을 측정하였다. 먼저 대조구로 사용된 DMSO는 용혈활성이 없었으며, triton X-100 (1 mg/ml)와 amphotericin B (0.
- 블랙커런트 착즙액 및 이의 분획물의 항혈전 활성 평가를 위해 시료들의 인간 혈소판 응집저해능을 평가하였다. 혈소판은 혈관 손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다, 따라서 혈소판 응집저해는 혈전 생성을 방지하는 매우 중요한 활성이다[24].
- 블랙커런트 착즙액 및 이의 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 시료들의 항응고 활성을 평가하였다. 혈액응고는 다양한 혈액응고인자 및 prothrombin의 cascade 활성화에 의해 최종적으로 thrombin을 활성화시키며, thrombin은 fibrinogen을 fibrin monomer로 전환시키고, 이후 fibrin monomer는 Ca++에 의해 중합되어 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며, XIII 인자에 의해 교차 결합된 fibrin polymer를 형성하는 과정이다[23].
- 블랙커런트의 항산화 활성은 기존 보고[1]와 동일하게 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 음이온 소거능, ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] 양이온 소거능, nitrite 소거능 및 환원력 측정으로 평가하였다. 한편 다양한 농도의 시료를 이용하여 각각의 활성 라디컬 소거활성을 측정한 후, 실험결과로부터 RC50 (표준조건에서 활성 radical을 50% 제거하는 데 소요되는 시료의 양)을 계산하였으며, 이를 근거로 시료들의 항산화 활성 정도를 비교하였다.
- 블랙커런트의 혈액응고 저해 활성은 기존의 보고한 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT) 을 측정하여 평가하였다[19]. 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co.
- 응집반응은 Whole Blood Aggregometer의 교반장치를 이용하여 반응액을 500 rpm으로 교반시키면서 collagen 첨가 후 12분간 측정하였다. 이후 얻어진 응집곡선으로부터 amplitude, slope, area under 를 측정하여 혈소판 응집을 평가하였다[30]. 이때, amplitude (Ω)는 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 혈소판의 최대 응집도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면 적을 나타낸다[23, 24].
- Japan)하여 분말로 조제하였다. 이후, 조제시료를 증류수에 현탁한 후 hexane, ethylacetate (EA), butanol로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 조제된 추출물과 분획물은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 항산화 활성, 혈액응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구 용혈활성 평가에 사용하였다.
- 이후, 조제시료를 증류수에 현탁한 후 hexane, ethylacetate (EA), butanol로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 조제된 추출물과 분획물은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 항산화 활성, 혈액응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구 용혈활성 평가에 사용하였다. 실험에 사용한 블랙커런트 시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2014-RN1~RN5).
- 블랙커런트의 항산화 활성은 기존 보고[1]와 동일하게 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 음이온 소거능, ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] 양이온 소거능, nitrite 소거능 및 환원력 측정으로 평가하였다. 한편 다양한 농도의 시료를 이용하여 각각의 활성 라디컬 소거활성을 측정한 후, 실험결과로부터 RC50 (표준조건에서 활성 radical을 50% 제거하는 데 소요되는 시료의 양)을 계산하였으며, 이를 근거로 시료들의 항산화 활성 정도를 비교하였다. 이때 활성 대조구로는 vitamin C (Sigma Co.
- 혈소판 응집저해 활성은 수세된 농축 혈소판에 블랙커런트 시료를 첨가한 후, Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, U.S.A)의 미세전극에 혈소판이 부착, 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하여 평가하였다[24]. 보다 자세하게는 10 mM CaCl2 50 μl, suspending buffer 147.
대상 데이터
- 본 실험의 블랙커런트 시료는 2014년 오스트리아에서 재배, 수확한 블랙커런트를 착즙한 주스(100%)를 구입하여 사용하였다. 착즙액은 filter paper (Whatsman No.
- 먼저 PBS로 3회 수세한 인간적혈구(4%) 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모 글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 활성 대조구로는 triton X-100과 amphotericin B를 사용하였다. 용혈활성은 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
- 조제된 추출물과 분획물은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 항산화 활성, 혈액응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구 용혈활성 평가에 사용하였다. 실험에 사용한 블랙커런트 시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2014-RN1~RN5).
- 한편 다양한 농도의 시료를 이용하여 각각의 활성 라디컬 소거활성을 측정한 후, 실험결과로부터 RC50 (표준조건에서 활성 radical을 50% 제거하는 데 소요되는 시료의 양)을 계산하였으며, 이를 근거로 시료들의 항산화 활성 정도를 비교하였다. 이때 활성 대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를, 용매 대조구로는 DMSO (Sigma Co., USA)를 사용하였다.
- 블랙커런트의 혈액응고 저해 활성은 기존의 보고한 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT) 을 측정하여 평가하였다[19]. 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China), PT reagent와 aPTT reagent는MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을, 기타 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 각각의 혈액응고활성은 3회 반복 측정하였으며, thrombin, prothrombin, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 TT, PT 및 aPTT의 평균값을 용매 대조구인 DMSO첨가시의 TT, PT및 aPTT 평균값의 비로 각각 나타내었다[17].
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean±SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다.
- 이때 시료 대조군으로는 aspirin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였으며, 각각의 실험결과는 3회 반복실험의 평균± 표준편차로 나타내었다[13].
이론/모형
- 32이었으며, 시료당 3회 측정하여 평균값을 구하여 색차를 계산하였다[14]. Total polyphenol 및 Total flavonoid 함량은 기존의 보고된 방법[20]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[27].
- Total polyphenol 및 Total flavonoid 함량은 기존의 보고된 방법[20]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[27]. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.
성능/효과
- DSA의 경우 EA 분획> 착즙액> butanol 분획> 물 잔류물 순으로, ASA의 경우 EA 분획= 착즙액> 물 잔류물> butanol 분획 순, 환원력의 경우 착즙액> EA 분획>물 잔류물> butanol 분획순으로 활성이 나타났으며, hexane 분획물의 DSA, ASA 및 환원력은 0.5 mg/ml 농도까지는 매우 미미한 활성을 나타내었다.
- 9%의 응집도를 보여 오히려 혈소판 응집 촉진활성이 나타났다. 다양한 농도에서의 혈소판 응집저해 결과를 바탕으로 50% 응집저해 농도를 계산한 결과 아스피린은 0.395 mg/ml인 반면, 블랙커런트 착즙액, EA 분획 및 butanol 분획은 각각 0.735, 0.192 및 0.261 mg/ml로 나타났다. 이러한 결과는 블랙커런트의 EA 분획 및 butanol 분획은 강력한 항응고 활성과 함께 혈소판 응집저해능이 우수하여 위장장애 등의 부작용을 나타내는 아스피린을 대치할 수 있는 항혈전제로 개발 가능함을 제시하고 있다.
- 다양한 농도의 블랙커런트 착즙액 및 이의 분획물의 항산화 활성 측정 결과, 농도의존적인 DSA, ASA, NSA 및 환원력을 나타내었다(Fig. 1). DSA의 경우 EA 분획> 착즙액> butanol 분획> 물 잔류물 순으로, ASA의 경우 EA 분획= 착즙액> 물 잔류물> butanol 분획 순, 환원력의 경우 착즙액> EA 분획>물 잔류물> butanol 분획순으로 활성이 나타났으며, hexane 분획물의 DSA, ASA 및 환원력은 0.
- 혈액응고는 다양한 혈액응고인자 및 prothrombin의 cascade 활성화에 의해 최종적으로 thrombin을 활성화시키며, thrombin은 fibrinogen을 fibrin monomer로 전환시키고, 이후 fibrin monomer는 Ca++에 의해 중합되어 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며, XIII 인자에 의해 교차 결합된 fibrin polymer를 형성하는 과정이다[23]. 먼저 활성 대조구인 아스피린은 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 모두 15배 이상 연장시켰으며, 1.5 mg/ml 농도에서는 각각 1.8, 1.8, 1.7배 연장효과를 나타내어 우수한 항응고 활성을 나타내었다(Table 4). 블랙커런트 착즙액은 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 모두 15배 이상 연장시켰으며 2.
- 본 실험의 오스트리아산 블랙커런트의 착즙액은 14.0 brix, 2.81% 산도, pH 2.85를 나타내어 새콤달콤한 전형적인 베리류의 관능성을 나타내었다(Table 1). 이는 기존의 뉴질랜드산 블랙커런트 착즙액이 15.
- 21 mg/g의 높은 함량을 나타내었으며, 이는 통상의 한약재[19] 및 체리[1]보다는 높았으나, 아로니아보다는 낮은 함량을 보였다[3]. 분획물 중에서는 hexane 분획물을 제외한 EA 및 butanol 분획물, 물 잔류물에서는 37.70~48.86 mg/g을 나타내었으며, 특히 분획 수율이 1.7%인 EA 분획에서 가장 높은 함량을 나타내었다(Table 2). 총 플라보노이드의 경우, 착즙액에서는 0.
- 블랙커런트 착즙액 및 이의 분획물의 총 폴리페놀 분석결과, 착즙액에서 34.21 mg/g의 높은 함량을 나타내었으며, 이는 통상의 한약재[19] 및 체리[1]보다는 높았으나, 아로니아보다는 낮은 함량을 보였다[3]. 분획물 중에서는 hexane 분획물을 제외한 EA 및 butanol 분획물, 물 잔류물에서는 37.
- 7배 연장효과를 나타내어 우수한 항응고 활성을 나타내었다(Table 4). 블랙커런트 착즙액은 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 모두 15배 이상 연장시켰으며 2.5 mg/ml 농도에서 PT를 15배 이상 연장하여 아스피린에 필적하는 강력한 활성을 나타내었다. 특히 내인성 혈전 생성에 관련되는 aPTT의 경우 1.
- 블랙커런트 착즙액은 농도 의존적인 혈소한 응집저해를 나타낸 바, 1.5 mg/ml 농도에서는 4.2%의 응집을 나타내었으나 0.3 mg/ml 농도에서는 무첨가구와 유사한 92.4% 응집도를 나타내어 아스피린보다 약한 활성을 보였다(Table 5, Fig. 2) 반면 블랙커런트 착즙액의 EA 분획 및 butanol 분획에서는 0.25 mg/ml 농도에서 각각 38.4% 및 50.9%의 응집도를 나타내어 아스피린보다 강력한 응집저해가 나타났으며, 특히 EA 분획은 0.12 mg/ml 농도에서 아스피린 0.25 mg/ml 농도에 해당하는 혈소판 응집저해능을 나타내었다.
- 전체적으로 가장 우수한 항산화 활성은 EA 분획에서 확인되었으며, 추출물 및 분획물의 DSA, ASA 및 NSA에 대한 RC50를 계산한 결과 EA 분획은 136.3, 66.2 및 115.5 μg/ml 값을 나타내어 가장 강력한 radical 소거능을 나타내었다.
- 7%인 EA 분획에서 가장 높은 함량을 나타내었다(Table 2). 총 플라보노이드의 경우, 착즙액에서는 0.4 mg/g으로 낮은 함량을 나타내었으나 EA 분획에서는 15.51 mg/g의 높은 함량을 나타내어, EA 분획은 폴리페놀 및 플라보노이드가 농축되어 있음을 확인하였다. 기타 분획에서는 0.
- 28 mg/g의 매우 높은 함량을 나타내었으며, 물 잔류물 및 butanol 분획에서는 438~501 mg/g의 총당, 420~468 mg/g의 환원당을 나타내었으며, EA 분획은 이의 1/10 수준의 총당, 환원당을 포함하고 있었다. 특히 hexane 분획에서는 총당 및 환원당 함량은 9.48 및 3.48 mg/g을 나타내어 거의 당을 포함하지 않음을 확인하였다(Table 2).
- 73 mg/g의 함량을 나타내었으며, 물 잔류물> butanol 분획> hexane 분획순으로 나타났다. 한편 총당 및 환원당 분석 결과, 착즙액은 805.56, 및 677.28 mg/g의 매우 높은 함량을 나타내었으며, 물 잔류물 및 butanol 분획에서는 438~501 mg/g의 총당, 420~468 mg/g의 환원당을 나타내었으며, EA 분획은 이의 1/10 수준의 총당, 환원당을 포함하고 있었다. 특히 hexane 분획에서는 총당 및 환원당 함량은 9.
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