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문제 정의
- Lee 등[16]은 Bax/Bcl-2 family의 발현변화에 의해 mitochondria 투과성이 증대되면 cytochrome c가 세포질로 방출되고 이로 인해 caspase 단백질이 활성화 되어 caspase 의존형 apoptosis를 유도한다고 보고하였다. 본 연구에서 SE의 처리에 의한 primary 전립선 암세포의 apoptosis 유도 및 세포증식 억제효과가 caspase 활성과 관련이 있는지 재확인하기 위하여 caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 처리하여 세포생존율을 SRB assay로 알아보았다(Fig. 5). 그 결과 caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 전처리하여 인위적으로 caspase 활성을 억제한 군에서 250 및 500 μg/ml의 SE를 단독으로 처리한 군과 비교하여 유의적으로 높은 세포생존율을 나타내었으며, 이는 SE에 의한 세포사멸이 caspase 의존형 apoptosis와 관련이 있다는 것을 보여준다.
- 이에 본 연구에서는 수수 에탄올 추출물의 처리가 전이되기 이전의 형태인 primary 전립선 암세포의 사멸 및 면역활성 증진에 미치는 영향을 확인하였으며 이를 기능성 소재로의 이용가능성을 제시하기 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- RAW 264.7 대식세포에 대한 SE의 세포독성을 알아보기 위해 여러 농도의 SE (10, 25, 50, 100, 250 및 500μg/ml)를 24시간 동안 처리하여 확인하였다.
- RAW 264.7 마우스 대식세포를 2×104 cells/ml가 되도록 희석하여 96 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 1 μg/ml의 LPS와 농도 별 수수추출물(1, 2.5, 5, 10 및 25 μg/ml)을 첨가한 후 24시간 동안 반응시켰다.
- SE 처리가 전이되기 이전의 primary 전립선 암세포의 증식억제에 미치는 영향을 정량적으로 측정하기 위하여 RC-58T/h/SA#4 세포에 SE를 10, 100, 250, 500 및 1,000 μg/ml 농도로 처리하여 24시간 동안 반응시킨 후 SRB assay를 이용하여 확인하였다(Fig. 1A).
- T-TBS로 1시간 이상 세척하고 secondary anti-rabbit IgG conjugated HRP를 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후 membrane을 T-TBS로 1시간 이상 세척하고 enhanced chemiluminescence kit (ECL kit)를 사용하여 필름에 노출시켜 단백질을 확인하였다.
- 세포 용해액과 2×sample buffer를 동량으로 섞어 65℃에서 5분간 끓인 후 8%와 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다.
- )을 첨가하여 실온에서 10분 간 염색시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 염색된 핵을 형광현미경으로 관찰하였다.
- incubator에서 24시간 배양하여 시료를 well plate에 처리하고 24시간 동안 반응 시켰다. 이후 세포의 형태학적 변화는 200배율의 광학현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
대상 데이터
- RC-58T/hTER은 primary 전립선 종양에서 유래한 인체전립선 암세포 cell line으로 전립선암 특유의 유전자를 대부분 발현한다고 알려져 있으며[15], 본 연구에서는 보다 정확한 전립선 암 억제효능을 연구하기 위하여 기존의 전이된 형태의 전립선 암세포주가 아닌 primary 전립선 암세포인 RC-58T/h/SA#4 세포를 사용하였다. SE 처리가 전이되기 이전의 primary 전립선 암세포의 증식억제에 미치는 영향을 정량적으로 측정하기 위하여 RC-58T/h/SA#4 세포에 SE를 10, 100, 250, 500 및 1,000 μg/ml 농도로 처리하여 24시간 동안 반응시킨 후 SRB assay를 이용하여 확인하였다(Fig.
- 본 실험에 사용한 primary 인체 전립선 암세포인 RC-58T/h/SA#4는 Center for Prostate Disease Research (Department of Surgery, Uniformed Services University of Health Sciences, Bethesda, MD, USA)로 부터 분양 받아 100 unit/ml의 Antibiotic Antimycotic (GIBCO®/InvitrogenTM, Gran Island, NY, USA)와 10% FBS (Fetal Bovine Serum, GIBCO®/InvitrogenTM)가 첨가된 DMEM (GIBCOⓇ/InvitrogenTM)을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 계대 배양하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 수수는 황금조 품종으로 2015년 농촌진흥청 국립식량과학원에서 분양 받아 4℃에 냉장보관 후 건조 및 분쇄과정을 거쳐 분말을 획득하였다. 수수 에탄올추출물(SE)의 제조는 수수분말에 10배(w/v) 용량의 EtOH과 혼합하고 실내에서 24시간씩 3회 추출하여 여과한 후 농축하여 실험에 사용하였다. 추출물 건조시료는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma chemical Co.
- 실험에 사용한 수수는 황금조 품종으로 2015년 농촌진흥청 국립식량과학원에서 분양 받아 4℃에 냉장보관 후 건조 및 분쇄과정을 거쳐 분말을 획득하였다. 수수 에탄올추출물(SE)의 제조는 수수분말에 10배(w/v) 용량의 EtOH과 혼합하고 실내에서 24시간씩 3회 추출하여 여과한 후 농축하여 실험에 사용하였다.
- 수수 에탄올추출물(SE)의 제조는 수수분말에 10배(w/v) 용량의 EtOH과 혼합하고 실내에서 24시간씩 3회 추출하여 여과한 후 농축하여 실험에 사용하였다. 추출물 건조시료는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma chemical Co., St Louis, MO) 이용하여 100 mg/ml의 농도로 녹여 stock solution을 각각 만든 다음 적정 농도로 배지에 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- Significant differences were compared with the control at *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 using Student’s t-test.
- 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
- 실험결과는 3 반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(* p<0.
이론/모형
- 암세포 증식 억제능은 생존 세포 내의 단백질 총량을 흡광도로 나타내어 세포 사멸 정도를 확인하는 방법인 sulforhod-amine B (SRB, Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)법을 이용하여 측정하였다. Trichloroacetic acid (TCA, SigmaAldrich Co.
성능/효과
- 10-250 μg/ml의 SE를 처리하였을 때 RAW 264.7 세포의 생존율에 유의적인 변화가 나타나지 않았으나, 500 μg/ml 이상의 농도에서부터 유의적인 세포사멸을 관찰할 수 있었다(Fig. 6A).
- 4와 같다. RC-58T/h/SA#4 세포에 SE를 농도 별로 처리하였을 때 pro-apoptotic 단백질인 Bax 및 암 억제 단백질로 알려진 p53 단백질의 발현은 농도의존적으로 증가하는 반면 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현은 감소되는 것으로 나타났다. 또한 apoptosis 유도에서 중요한 조절인자로 작용하는 cytochrome c, caspase-3, -8 및 -9 단백질도 SE의 처리에 따라 활성이 증가하였으며, 116 kDa의 PARP 단백질도 82 kDa의 분절된 형태로 변화되는 것을 확인할 수 있었다.
- SE의 처리는 농도의존적으로 primary 전립선암세포의 증식을 억제하였으며, 대조군과 비교하여 250 μg/ml의 농도부터 약 60%의 세포 생존율을 나타내어 유의적인 RC-58T/h/SA#4 세포 증식억제 효능을 보였다.
- 그 결과 caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 전처리하여 인위적으로 caspase 활성을 억제한 군에서 250 및 500 μg/ml의 SE를 단독으로 처리한 군과 비교하여 유의적으로 높은 세포생존율을 나타내었으며, 이는 SE에 의한 세포사멸이 caspase 의존형 apoptosis와 관련이 있다는 것을 보여준다.
- 2와 같다. 대조군 암세포의 핵 형태는 비교적 일정한 반면 SE를 처리한 군에서는 핵이 손상되어 응축이 일어나는 것을 관찰할 수 있었으며, apoptosis의 특징 중 하나인 apoptotic body가 확인되었다. 특히 250 μg/ml 이상의 농도에서 세포수축 및 apoptotic body의 증가현상이 확연히 나타났다.
- RC-58T/h/SA#4 세포에 SE를 농도 별로 처리하였을 때 pro-apoptotic 단백질인 Bax 및 암 억제 단백질로 알려진 p53 단백질의 발현은 농도의존적으로 증가하는 반면 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현은 감소되는 것으로 나타났다. 또한 apoptosis 유도에서 중요한 조절인자로 작용하는 cytochrome c, caspase-3, -8 및 -9 단백질도 SE의 처리에 따라 활성이 증가하였으며, 116 kDa의 PARP 단백질도 82 kDa의 분절된 형태로 변화되는 것을 확인할 수 있었다.
- SE의 처리는 농도의존적으로 primary 전립선암세포의 증식을 억제하였으며, 대조군과 비교하여 250 μg/ml의 농도부터 약 60%의 세포 생존율을 나타내어 유의적인 RC-58T/h/SA#4 세포 증식억제 효능을 보였다. 또한 각 농도의 SE를 처리한 후 위상 차 현미경으로 관찰한 결과 RC-58T/h/SA#4 세포가 부착된 형태를 잃고 culture plate로부터 분리되어 부유하였으며 세포수도 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1B). 이러한 결과를 통해 SE는 primary 인체 전립선 암세포에서 증식억제 효능을 가지는 것으로 판단된다.
- 양성 대조군으로 LPS를 단독 처리 하였을 때 대조군과 비교하여 NO 생성량이 유의적으로 증가하였으며, LPS와 10, 25, 50 및 100 μg/ml의 SE를 병용 처리한 군에서는 양성 대조군과 비교하여 유의적인 NO 생성량의 증가를 나타내었다(Fig. 6B).
- 1B). 이러한 결과를 통해 SE는 primary 인체 전립선 암세포에서 증식억제 효능을 가지는 것으로 판단된다.
후속연구
- 특히 적정량의 NO는 인체 내 암세포 증식을 조절한다고 알려져 있다[14]. 따라서 SE에 의한 NO 분비능 증가는 수수의 섭취가 면역기능 활성화에 효능을 가질 수 있는 한 예로서 사용될 수 있을 것으로 판단되며, 동시에 암을 예방할 수 있는 우수한 기능성 소재로도 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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