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문제 정의
- AEG 처리에 의한 세포성장 억제와 연관된 apoptosis 유발에 영향을 주는 관련인자를 확인하기 위하여, apoptosis의 메커니즘에 관여하는 대표적 발현 단백질을 확인하였다. Apop- tosis 유발은 크게 mitochondrial pathway라고 알려진 in- trinsic pathway와 death receptor pathway로 알려진 extrinsic pathway로 나누어진다[8].
- 따라서 본 연구에서는 서두에 거론한 바와 같이 전이되기 전의 형태인 primary cancer 조직으로부터 분리된 전립선암세포인 RC-58T/h/SA#4 세포를 이용하여 꼬시래기로부터 얻은 추출물의 처리에 따른 항암효능 및 apoptosis 유도 효과를 확인하였으며, 환경호르몬인 bisphenol A에 의해 성장이 유도된 전립선암세포에서 꼬시래기 추출물들의 처리가 세포 성장을 효과적으로 억제하는지 알아보았다.
제안 방법
- AEG 및 ABEG 처리가 전립선 암세포의 증식억제에 미치는 영향을 정량적으로 측정하기 위하여 LNCaP, PC-3 및 RC- 58T/h/SA#4의 3종의 전립선 암세포에 각 추출물을 0, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/ml 농도로 처리하여 24시간 동안 반응시킨 후 SRB assay를 이용하여 확인하였다(Fig. 1). AEG 는 처리 농도에 비례하여 전립선암세포의 증식을 억제하였다.
- T-TBS로 1시간 이상 세척하고 secondary anti-rabbit IgG conjugated HRP를 희석하여 4℃에서 1시간반응시켰다. 반응 종료 후 membrane을 T-TBS로 1시간 이상세척하고 enhanced chemiluminescence kit (ECL kit)를 사용하여 필름에 노출시켜 단백질을 확인하였다[13].
- 반응이 종료된 dish에서 회수한 세포를 PBS로 3회 세척 후 500 μl lysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 30 mM Na4P2O7, 1 mM PMSF, 2 μg/ml aprotinin)를 첨가하여얼음에서 용해하였다. 세포 용해액과 2×sample buffer를 동량으로 섞어 65℃에서 5분간 끓인 후 8%와 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다. 전기영동이 끝난 gel의 단백질을 nitro-cellulose membrane으로 transfer한 후 blocking buffer (2.
- )을 첨가하여 실온에서 10분 간 염색시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 염색된 핵을 형광현미경으로 관찰하였다.
- 이후세포의 형태학적 변화는 200배율의 광학현미경(Leica Micro- systems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
- 이르게 되는 현상을 말한다[27, 29]. 특히, Apoptosis가 일어난 세포는 DNA의 절단에 의해 염색질이 응축되는 현상을 나타내며[6] RC-58T/h/SA#4 세포에서 AEG와 ABEG를각각의 농도로 처리한 후, hoechst 33258 염색법을 통한 세포의 핵 형태변화를 관찰하였다(Fig. 3). 대조구에서는 암세포핵의 손상이 관찰되지 않았으나, AEG 처리농도가 증가됨에따라 DNA 절단에 의한 염색질의 응축된 형태인 apoptotic body가 증가하는 경향을 나타내었다.
- 환경호르몬으로부터 유도된 암세포의 증식 억제 효과를 측정하였다. Serum의 호르몬 활성을 최소화하기 위하여 FBS에 5% charcoal을 처리하여 55℃에서 30분 동안 교반한 후 3, 000 rpm, 4℃, 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하고, 이를 2회 반복하여 얻은 상등액을 여과하여 charcoal-treated FBS (cFBS)를 얻은 후 -20℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.
- Serum의 호르몬 활성을 최소화하기 위하여 FBS에 5% charcoal을 처리하여 55℃에서 30분 동안 교반한 후 3, 000 rpm, 4℃, 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하고, 이를 2회 반복하여 얻은 상등액을 여과하여 charcoal-treated FBS (cFBS)를 얻은 후 -20℃에서 보관하여 실험에 사용하였다. 환경호르몬으로부터 증식이 유도된 암세포를 1×105 cells/ml 가 되도록 희석하여 24 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 5% cFBS, 5% cFBS+bisphenol A, 5% cFBS+bisphenol A 또는 bisphenol A+AEG를 농도별로 첨가하고 48시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 12% TCA를넣어 4℃에서 세포를 고정시키고 well을 세척한 후 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 LNCaP과 PC-3 전입선 암세포 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, primary 인체 전립선 암세포인 RC-58T/h/SA#4 및 RWPE-1 전립선상피세포는 Center for Prostate Disease Research (Depar™ent of Surgery, Uniformed Services University of Health Sciences, Bethesda, MD, USA)로 부터 분양 받아 100 unit/ml의 Antibiotic Anti- mycotic (GIBCO®/Invitrogen™, Gran Island, NY, USA)와 10% FBS (Fetal Bovine Serum, GIBCO®/Invitrogen™)가 첨가된 DMEM (GIBCO®/Invitrogen™)을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 에서계대 배양하여 사용하였다.
- 거쳐 분말을 획득하였다. 산처리 추출물(acid extraction of Gracilaria verrucosa, AEG)의 제조는 분말에 10배(w/v) 용량의 0.1 N acetic acid과 혼합하고 실내에서 72시간 추출하여 여과한 후 동결건조하여 실험에 사용하였다. 산처리후 중화추출물 (acid-base extraction of Gracilaria verrucosa, ABEG)의 제조는산처리 추출물을 0.
- 1 N acetic acid과 혼합하고 실내에서 72시간 추출하여 여과한 후 동결건조하여 실험에 사용하였다. 산처리후 중화추출물 (acid-base extraction of Gracilaria verrucosa, ABEG)의 제조는산처리 추출물을 0.1 N NaOH로 중화 적정한 후 농축하여동결 건조한 것을 실험에 사용하였다. 건조시료는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma chemical Co.
- 실험에 사용한 꼬시래기는 2015년 전라남도 장흥군 인성수산에서 구입하여 증류수로 염분을 제거 후, 건조 및 분쇄과정을 거쳐 분말을 획득하였다. 산처리 추출물(acid extraction of Gracilaria verrucosa, AEG)의 제조는 분말에 10배(w/v) 용량의 0.
데이터처리
- D (n=3). *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by Student’s t-test.
- Anti-proliferation effects of AEG in RC-58T/h/SA#4 can- cer cells treated with 1 μM bisphenol. Data values are expressed as mean ± S.D (n=3.) *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by Student’s t-test.
- 각군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.001).
- 실험결과는 3 반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(* p<0.
이론/모형
- 암세포 증식 억제능은 생존 세포 내의 단백질 총량을 흡광도로 나타내어 세포 사멸 정도를 확인하는 방법인 sulforhod- amine B (SRB, SigmaAldrich Co., St. Louis, MO, USA) 법을이용하여 측정하였다. Trichloroacetic acid (TCA, Sigma- Aldrich Co.
성능/효과
- 4와 같다. RC-58T/h/SA#4 세포에 AEG를 농도 별로 처리하였을 때 Bax의 발현은 농도의존적으로 증가하는 반면 Bcl-2의 발현은 감소되는 것으로 나타났다 (Fig. 4). 따라서, RC-58T/h/SA#4 전립선 암세포 모델에서 AEG 처리로 인한 암세포 증식억제 및 apoptosis 유도효과는 Bcl-2 단백질의 감소 및 Bax 단백질의 증가와 관련이 있음을확인할 수 있었다.
- RC-58T/h/SA#4 세포에서 AEG의 처리에 의한 caspase-3의 활성변화를 확인한 결과, AEG를 처리한 군에서 농도 의존적으로 procaspase-3는 감소되면서 active caspase-3가 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과를 통해 AEG에의한 인체 암세포의 증식억제 및 apoptosis 유도효과는 cas- pase-3 활성과 밀접한 연관을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
- 2와 같다. 대조구에서는 안정적으로 부착되어 정상적으로 암세포가 증식되는모습을 확인할 수 있었으며, AEG를 처리한 세포는 농도가 높아짐에 따라 세포가 부착되지 못하고 부유하였으며, 세포의수가 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 특히, 800 μg/ml 의 농도에서는 거의 모든 세포가 외형이 붕괴되어 부유하는것을 확인할 수 있었다.
- 3). 대조구에서는 암세포핵의 손상이 관찰되지 않았으나, AEG 처리농도가 증가됨에따라 DNA 절단에 의한 염색질의 응축된 형태인 apoptotic body가 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 600 μg/ml 이상의농도에서 세포 수축 및 apoptotic body의 증가가 확연히 관찰되었다.
- 5와 같다. 대조구와 비교하여 bisphenol A를 처리한 군에서는 세포의 성장을 비정상적으로 촉진시켜 암세포의 성장이 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 5). 반면에 bisphenol A를 처리한 세포에 AEG를 각각의 농도로 처리 하였을 때에 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/ml 농도에서 각각 41.
- 1). 따라서 24시간의 AEG 처리는 인체 전립선 암세포 증식을 억제하는 효과가 있는 것으로 판단되며, RWPE-1 세포에서 거의 독성을 나타내지 않았기 때문에 암세포의 성장만을 선택적으로 억제함을 추측할 수 있었다. 한편, ABEG는 LNCaP, PC-3 및 RC-58T/h/SA#4 세포에서 유의적인 성장억제효능을 나타내지 못하였다.
- 4). 따라서, RC-58T/h/SA#4 전립선 암세포 모델에서 AEG 처리로 인한 암세포 증식억제 및 apoptosis 유도효과는 Bcl-2 단백질의 감소 및 Bax 단백질의 증가와 관련이 있음을확인할 수 있었다.
- 23% 유의적인 암세포의 성장 억제효과를 나타내었다. 반면 ABEG를 처리하였을 때 bisphenol A에 의해 증가된 암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. Park 등[21]과 Kwon 등[17]은 당귀 산수율 추출물의 처리가 환경호르몬에의해 증식이 유도된 유방암 암세포 및 전립선 암세포의 증식을 억제한다고 보고 하였으며, 이는 해조류 추출물이 환경호르몬에 의한 전립선암세포의 비정상적인 증식을 억제할 수있다는 것을 시사한다.
- 5). 반면에 bisphenol A를 처리한 세포에 AEG를 각각의 농도로 처리 하였을 때에 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/ml 농도에서 각각 41.70, 63.22, 86.64, 102.45 및 103.23% 유의적인 암세포의 성장 억제효과를 나타내었다. 반면 ABEG를 처리하였을 때 bisphenol A에 의해 증가된 암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다.
- 4). 이러한 결과를 통해 AEG에의한 인체 암세포의 증식억제 및 apoptosis 유도효과는 cas- pase-3 활성과 밀접한 연관을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
- AEG 는 처리 농도에 비례하여 전립선암세포의 증식을 억제하였다. 특히, PC-3 및 RC-58T 세포에서 200 μg/ml의 농도부터 유의적인 세포사멸을 보였으며 LNCaP 세포는 400 μg/ml의 농도부터 유의적인 암세포 증식 억제 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 반면, 200, 400, 600, 800 및 1,000 μg/ml의 AEG를 24시간 동안 RWPE-1 전립선상피세포에 처리하였을 때 유의적인 세포 성장 억제효능이 관찰되지 않았으나(Fig.
- 특히, 600 μg/ml 이상의농도에서 세포 수축 및 apoptotic body의 증가가 확연히 관찰되었다. 한편, ABEG를 처리한 세포에서는 핵의 응축을 유도하지 못하였으며 이를 통해 Fig. 1 및 2의 결과와 마찬가지로암세포의 사멸에 영향을 미치지 못한다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 AEG의 처리에 따른 암세포 성장억제효과는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 판단된다.
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