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문제 정의
- 하지만 아직 구강암세포에서의 생강에 의한 암전이 효과 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 생강의 유기용매 분획물의 항산화 효과, 항트롬빈 효과 및 암 형성과 암 전이 능력이 우수하다고 이미 보고된 YD-10B 인간구강암세포주에서의 암 침윤 억제 효과를 조사하였다.
- 하지만 이들의 다양한 질환과의 상호 연관된 기능과 기전에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이어서 이 들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 생강 유기용매 분획물들의 YD-10B 인간구강암세포에서 PMA에 의한 암 침윤 및 MMP-2와 MMP-9 활성 증가에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여 40 μg/ml 농도의 생강 유기용매 분획물들과 0.
- 본 연구에서는 생강 유기용매 분획물들의 YD-10B 인간구강암세포에서 thrombin에 의한 암 침윤 및 MMP-2와 MMP-9 활성 증가에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여 40 μg/ml 농도의 생강 유기용매 분획물들과 2.
제안 방법
- 준비한 생강 열수추출물이나 분획물(10 mg/ml) 10 μl를 첨가하고 실온에서 15분간 배양 후, H-D-phenylalanine-L-pipecolyl-L- arginine-paranitroaniline dihydrochloride를 이용하여 준비한 기질 용액(0.5 mM) 50 μl을 가하고 5분 동안 incubation시킨 후 405 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다(UV-1601PC, Shimadzu, Japan).
- 40 μg/ml 농도의 생강 유기용매 분획물과 0.5 μM PMA 또는 2.5 U/ml thrombin을 단독 또는 동시에 처리된 혈청 없는 배지에서 YD-10B (5×105) 세포를 24 hr 동안 배양한 후, 배지를 모아 Centriprep YM-10 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 농축하였다.
- 1) 하였고 얻어진 여액은 초기 중량의 10%가 되도록 감압농축시킨 다음 열수추출물 시료로 사용하였다. 또한 열수추출물을 같은 부피의 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 차례로 3번씩 추출 후 각각의 추출물을 농축 시키고, 동결건조하여 분획물을 얻었다. 실험에 사용한 열수추출물(100 mg/ml)과 함께 준비한 분획별 시료는 50% DMSO와 증류수에 100 mg/ml로 준비하여 항산화활성과 암 침윤억제 측정에 사용하였으며, 50% DMSO에 10 mg/ml의 농도로 준비하여 트롬빈 저해활성 측정에 사용하였다.
- YD-10B 인간구강암세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 DMEM (Gibco-BRL, Life technologies Inc., Grand Island, New York, USA)배지에 10% FBS (Gibco-BRL), 1% penicillin/streptomycin (Gibco-BRL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 계대 배양하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 및 thrombin는 (Sigma-Aldrich, St.
- 생강 유기용매 분획물에 따른 세포독성을 조사하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 well (200 μl)당 YD-10B 세포는 5×103 개의 수로 접종하여 12 hr 동안 배양한 후, 유기용매 분획물을 적정농도로 처리하였다.
- 1 μg의 RNA를 가지고 ReverTra ACE PCR RT Master Mix Kit (TOYOBO Co., Osaka, Japan) 을 이용하여 PCR를 수행하였다.
- , Osaka, Japan) 을 이용하여 PCR를 수행하였다. 본 실험에서는 MMP-2, MMP-9 및Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primers (Table 1)을 사용하였고, Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. 증폭된 PCR 생성물은 ethidium bromide가 포함된 1.
- 본 실험에서는 MMP-2, MMP-9 및Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primers (Table 1)을 사용하였고, Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. 증폭된 PCR 생성물은 ethidium bromide가 포함된 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 UV light상에서 확인하였다.
- YD-10B 인간구강암세포에서 생강 유기용매 분획물들의 세포독성 효과를 조사하기 위해, 시료들을 다양한 농도로 처리하여 48 hr 동안 반응하였다. 그 결과 대조군과 비교했을 때, 40 μg/ml 농도 처리에서 열수 추출물, hexane, butanol 및 H2O 분획물은 72.
- 5 μM 농도의 PMA을 단독 또는 동시에 처리하여 YD-10B세포를 혈청 없는 배지에서 배양하였다. 그리고 24 hr 동안 배양한 후, 배지의 상층액은 gelatin zymography법을 통해 MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 관찰하였고, 배양된 세포에서는 RT-PCR법을이용하여 MMP-2 및 MMP-9 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과는 Fig.
- 5 U/ml Thrombin을 단독 또는 동시에 처리하여 YD-10B세포를 혈청 없는 배지에서 배양하였다. 그리고 24 hr 동안 배양한 후, 배지의 상층액은 MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 관찰하였고, 배양된 세포에서는 MMP-2 및 MMP-9 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과는 Fig.
- 생강 유기용매 분획물의 항산화 효과, 트롬빈 억제 효과 및 인간구강암세포, YD-10B세포에서의 MMP-2와 MMP-9의 발현 및 활성 억제에 의한 암 침윤 및 전이 억제 효과를 확인하였다. 본 연구를 통하여 생강 추출 hexane 분획물은 가장 우수한 항산화 효과를 보였으며 또한 YD-10B 구강암세포에서 MMP2 및 MMP-9의 발현과 활성을 억제함으로써 암 침윤 및 전이를 억제하는 것으로 나타났다.
- 20 μg농도의 농축된 단백질은 non-reducing sample buffer (0.5 M Tris-Cl pH 6.8, 5% SDS, 20% glycerol, 1% bromophenol blue)와 함께 혼합하여 0.1% gelatin이 포함된10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에서 전기영동 하였다.
- 이를 위하여 40 μg/ml 농도의 생강 유기용매 분획물들과 0.5 μM 농도의 PMA을 단독 또는 동시에 처리하여 YD-10B세포를 혈청 없는 배지에서 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 생강은 국내에서 수확된 것을 가락시장에서 구입하여 실험에 사용하였다. 시료는 깨끗이 수세하여 0.
- 또한 열수추출물을 같은 부피의 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 차례로 3번씩 추출 후 각각의 추출물을 농축 시키고, 동결건조하여 분획물을 얻었다. 실험에 사용한 열수추출물(100 mg/ml)과 함께 준비한 분획별 시료는 50% DMSO와 증류수에 100 mg/ml로 준비하여 항산화활성과 암 침윤억제 측정에 사용하였으며, 50% DMSO에 10 mg/ml의 농도로 준비하여 트롬빈 저해활성 측정에 사용하였다.
- YD-10B 인간구강암세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 DMEM (Gibco-BRL, Life technologies Inc.
- , Grand Island, New York, USA)배지에 10% FBS (Gibco-BRL), 1% penicillin/streptomycin (Gibco-BRL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 계대 배양하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 및 thrombin는 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 세포로부터 TRIzol 시약(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 μg의 RNA를 가지고 ReverTra ACE PCR RT Master Mix Kit (TOYOBO Co.
데이터처리
- 3회 반복 실험을 통하여 얻은 결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Student t-test를 실시하여 유의한 결과를 얻었다.
이론/모형
- 트롬빈에 대한 저해활성은 Doljak [7]의 실험 방법을 이용하였다. 즉, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.
성능/효과
- 생강 300 g을 열수추출 후 여러 종류의 용매를 이용하여 추출한 분획물의 수율을 측정한 결과, hexane 분획물이 0.33%, chloroform 분획물 0.23%, ethyl acetate 분획물 0.12%, butanol 분획물 1.27%, H2O 분획물 9.79%로 H2O 분획물의 수득율이 가장 높았다.
- 따라서 이 DPPH을 환원시키는 능력이 크다면 높은 활성의 활성산소 및 유리 라디칼 제거능력이 클 것으로 기대할 수 있다. DPPH 용액을 이용하여 생강 열수추출액과 유기용매 분획물의 활성산소 제거능력을 측정한 결과 열수추출액은 82.85%의 항산화 활성을 나타냈으며, hexane 분획물은 92.38%, chloroform 분획물 80.80%, ethyl acetate 분획물 76.33%, butanol 분획물 84.93%, H2O 분획물은 92.96%의 항산화활성을 나타냈다(Fig. 1). Hexane 분획물과 H2O 분획물의 높은 항산화 활성으로부터 생강이 함유하고 있는 항산화 물질에는 극성 물질과 비극성 물질이 함께 섞여있는 것으로 예상된다.
- Hexane 분획물과 H2O 분획물의 높은 항산화 활성으로부터 생강이 함유하고 있는 항산화 물질에는 극성 물질과 비극성 물질이 함께 섞여있는 것으로 예상된다. 두 추출물들의 항산화 효과는 기존에 알려진 홍화 chloroform 추출물[15]의 81.85%, 빈랑 chloroform 추출물[17]의 87.13%, 황기 ethyl acetate 추출물[16]의 89.96%, 산사 butanol 추출물[22]의 91.74% 보다 높은 항산화효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.
- H-D-Phenylalanine-L-pipecolyl-L-arginine-paranitroaniline dihydrochloride를 기질로 이용하여 분획물들의 thrombin 저해활성을 측정한 결과, 생강 열수추출액(10 mg/ml)이 61.69%의 트롬빈 저해효과를 나타냈으며, chloroform 분획물, ethyl acetate 분획물, H2O 분획물은 열수추출물과 비슷한 61.59%, 65.40%, 65.86%의 저해활성을 나타냈지만, hexane 분획물과 butanol 분획물은 각각 39.56%와 38.75%의 낮은 저해율을 나타냈다(Fig. 2). 결과로부터 트롬빈 저해물질들이 chloroform 분획물, ethyl acetate 분획물, H2O 분획물에 고르게 분포되어 있음을 알 수 있다.
- 2). 결과로부터 트롬빈 저해물질들이 chloroform 분획물, ethyl acetate 분획물, H2O 분획물에 고르게 분포되어 있음을 알 수 있다.
- 그 결과 대조군과 비교했을 때, 40 μg/ml 농도 처리에서 열수 추출물, hexane, butanol 및 H2O 분획물은 72.67%, 81.00%, 79.44% 및 78.40%로 모두 70% 이상의 생존율을 보였으며, chloroform 과 ethyl acetate 분획물은 64.83%와 68.52%로 낮은 생존율을 나타냈다(Fig. 3).
- 그러므로 40 μg/ml 농도에서는 열수 추출물, hexane, butanol 및 H2O 분획물들이 YD-10B 인간구강암세포에서 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었으며, 암 침윤 및 전이 억제 효과가 세포에 영향을 주어 나타나는 효능이 아님을 알 수 있었다.
- 3). 이와 같은 결과를 바탕으로 열수 추출물, hexane, butanol 및 H2O분획물은 YD-10B세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었고, chloroform과 ethyl acetate 분획물은 YD-10B세포의 증식 억제 효과를 보였다. 그러므로 40 μg/ml 농도에서는 열수 추출물, hexane, butanol 및 H2O 분획물들이 YD-10B 인간구강암세포에서 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었으며, 암 침윤 및 전이 억제 효과가 세포에 영향을 주어 나타나는 효능이 아님을 알 수 있었다.
- 그리고 24 hr 동안 배양한 후, 배지의 상층액은 gelatin zymography법을 통해 MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 관찰하였고, 배양된 세포에서는 RT-PCR법을이용하여 MMP-2 및 MMP-9 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과는 Fig. 4에서 나타난 것처럼, PMA를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한 PMA와 생강 유기용매 분획물을 동시 처리한 세포에서 hexane 분획물이 PMA에 의해 유도된 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현 모두에서 가장 뚜렷하게 억제함을 확인할 수 있었다.
- 4에서 나타난 것처럼, PMA를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한 PMA와 생강 유기용매 분획물을 동시 처리한 세포에서 hexane 분획물이 PMA에 의해 유도된 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현 모두에서 가장 뚜렷하게 억제함을 확인할 수 있었다.
- 그리고 24 hr 동안 배양한 후, 배지의 상층액은 MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 관찰하였고, 배양된 세포에서는 MMP-2 및 MMP-9 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과는 Fig. 5에서 나타난 것처럼, thrombin를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한 thrombin과 생강 유기용매 분획물을 동시 처리한 세포에서 hexane 분획물이 thrombin에 의해 유도된 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현 모두에서 가장 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다.
- 5에서 나타난 것처럼, thrombin를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한 thrombin과 생강 유기용매 분획물을 동시 처리한 세포에서 hexane 분획물이 thrombin에 의해 유도된 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현 모두에서 가장 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다. 그리고 MMP-2의 단백질 활성 및 mRNA 발현은 YD-10B세포에서는 MMP-9에 비해 endogenous하게 이미 높은 활성 및 발현을 보였으며 또한thrombin를 단독 처리한 YD-10B세포에서 약한정도로 억제되는 경향을 확인할 수 있었다.
- 또한 thrombin과 생강 유기용매 분획물을 동시 처리한 세포에서 hexane 분획물이 thrombin에 의해 유도된 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현 모두에서 가장 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다. 그리고 MMP-2의 단백질 활성 및 mRNA 발현은 YD-10B세포에서는 MMP-9에 비해 endogenous하게 이미 높은 활성 및 발현을 보였으며 또한thrombin를 단독 처리한 YD-10B세포에서 약한정도로 억제되는 경향을 확인할 수 있었다. 하지만 thrombin과 생강 유기용매 분획물을 동시에 처리했을 경우에근 hexane 분획물이 MMP-9과 유사한 결과를 나타냈다.
- 하지만 thrombin과 생강 유기용매 분획물을 동시에 처리했을 경우에근 hexane 분획물이 MMP-9과 유사한 결과를 나타냈다. 그러므로 이와 같은 결과를 통하여 thrombin과 생강유기용매 분획물을 동시에 처리한 YD-10B 구강암세포에서는 hexane 분획물이 MMP-9 및 MMP-2의 단백질 활성 및 mRNA발현을 가장 유의하게 억제함을 알 수 있었다.
- 생강 유기용매 분획물의 항산화 효과, 트롬빈 억제 효과 및 인간구강암세포, YD-10B세포에서의 MMP-2와 MMP-9의 발현 및 활성 억제에 의한 암 침윤 및 전이 억제 효과를 확인하였다. 본 연구를 통하여 생강 추출 hexane 분획물은 가장 우수한 항산화 효과를 보였으며 또한 YD-10B 구강암세포에서 MMP2 및 MMP-9의 발현과 활성을 억제함으로써 암 침윤 및 전이를 억제하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 hexane 분획물이 구강 암의 예방 및 치료제 개발을 위한 우수한 후보 물질로서의 가능성을 제시하고 있으며 hexane 분획물에 대한 유효한 성분분석과 이들에 대한 in vivo에서의 암전이 억제 효능 및 기전 연구들이 추가적으로 더 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 연구를 통하여 생강 추출 hexane 분획물은 가장 우수한 항산화 효과를 보였으며 또한 YD-10B 구강암세포에서 MMP2 및 MMP-9의 발현과 활성을 억제함으로써 암 침윤 및 전이를 억제하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 hexane 분획물이 구강 암의 예방 및 치료제 개발을 위한 우수한 후보 물질로서의 가능성을 제시하고 있으며 hexane 분획물에 대한 유효한 성분분석과 이들에 대한 in vivo에서의 암전이 억제 효능 및 기전 연구들이 추가적으로 더 필요할 것으로 사료된다.
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