장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)에 Oryctes rhinoceros nudivirus 감염에 의해서 유전자 발현이 조절되는 5개의 유전자 Five Genes Regulated by Oryctes rhinoceros nudivirus Infection in the Intestinal Tube of Allomyrina dichotoma원문보기
최근에 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 관상용으로 인기가 높으며, 애벌레는 건강보조식품으로 주목을 받고 있다. 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 원인이 Oryctes rhinoceros nudivirus (OrNV)인 것이 2015년에 처음 보고되었다. 그러나 아직 정확한 진단, 발병기전과 치료방법을 찾지 못하고 있으며 곤충 사육농가에 매년 심각한 경제적 손실을 입고 있다. 본 연구는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 OrNV질병의 조기진단과 치료에 실마리를 제공하기 위하여 OrNV에 감염된 장수풍뎅이의 장(intestine)에서 유전자발현이 조절되는 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a, MIMI_L93를 보고한다.
최근에 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 관상용으로 인기가 높으며, 애벌레는 건강보조식품으로 주목을 받고 있다. 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 원인이 Oryctes rhinoceros nudivirus (OrNV)인 것이 2015년에 처음 보고되었다. 그러나 아직 정확한 진단, 발병기전과 치료방법을 찾지 못하고 있으며 곤충 사육농가에 매년 심각한 경제적 손실을 입고 있다. 본 연구는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 OrNV질병의 조기진단과 치료에 실마리를 제공하기 위하여 OrNV에 감염된 장수풍뎅이의 장(intestine)에서 유전자발현이 조절되는 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a, MIMI_L93를 보고한다.
Korean rhinoceros beetles (Allomyrina dichotoma), which can be found in broad-leaved forests in mountainous habitats and lives for around one year in wild. This beetle is currently popular as a pet and traditionally regarded as a medicine for liver-related diseases in Korea. It is reported that the ...
Korean rhinoceros beetles (Allomyrina dichotoma), which can be found in broad-leaved forests in mountainous habitats and lives for around one year in wild. This beetle is currently popular as a pet and traditionally regarded as a medicine for liver-related diseases in Korea. It is reported that the economic losses in the mass-rearing facilities by virus infection have been increased since the 2010s in Korea. The causing virus for the A. dichotoma was firstly reported as an Oryctes rhinoceros nudivirus (OrNV) in 2015. We, here, observes that serious morphological changes in the intestinal tube from the OrNV-infected beetles, and report five genes, which are regulated by OrNV infection in the intestine; Krueppel-like factor 15 (Klf15), Endoplasmic reticulum aminopeptidase 2 (ERAP2), U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase (Snrnp200), Muscleblind-like protein 2a (mbnl2a), and MIMI_L93. The results may provide a clue to the early diagnosis and disease treatment during the mass-rearing facilities of the A. dichotoma.
Korean rhinoceros beetles (Allomyrina dichotoma), which can be found in broad-leaved forests in mountainous habitats and lives for around one year in wild. This beetle is currently popular as a pet and traditionally regarded as a medicine for liver-related diseases in Korea. It is reported that the economic losses in the mass-rearing facilities by virus infection have been increased since the 2010s in Korea. The causing virus for the A. dichotoma was firstly reported as an Oryctes rhinoceros nudivirus (OrNV) in 2015. We, here, observes that serious morphological changes in the intestinal tube from the OrNV-infected beetles, and report five genes, which are regulated by OrNV infection in the intestine; Krueppel-like factor 15 (Klf15), Endoplasmic reticulum aminopeptidase 2 (ERAP2), U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase (Snrnp200), Muscleblind-like protein 2a (mbnl2a), and MIMI_L93. The results may provide a clue to the early diagnosis and disease treatment during the mass-rearing facilities of the A. dichotoma.
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문제 정의
본 연구 결과는 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)가 OrNV 에 감염되면 장에서 조직적인 구조변화가 일어나는 것을 관찰되었다. 이와 함께 장에서 특이적으로 발현이 상승하는 유전자로 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a와 하락하는 유전자로 MIMI_L93을 보고한다. 이 결과는 장수풍뎅이의 대량 사육사 발생하는 virus 질병의 조기진단과 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.
가설 설정
Five genes regulated by OrNV infection in the intestine. H; healthy intestine, D; OrNV-infected intestine. Krueppel-like factor 15 (Klf15), U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase (Snrnp200), Endoplasmic reticulum aminopeptidase 2 (ERAP2), Muscleblind-like protein 2a (mbnl2a), GenBank# MIMI_L93.
제안 방법
3령 larvae의 머리 부분을 해부침으로 고정시킨 후 표피를 아래에서 머리 방향으로 한 번에 가른다. Fat body를 제거한 후 장을 통째로 분리하여 장 내부의 톱밥 등의 내용물을 제거하고, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)에 3회 세척하여 불순물질을 모두 제거 후 4% paraformaldehyde (PFA)로 고정 또는 total RNA를 분리하였다. OrNV에 감염된 조직도 동일한 방법으로 취급하였다.
그 다음 파라핀으로 포매하고 마이크로톰을 이용하여 4 μm 두께로 잘라 슬라이드에 올린 후 파라핀을 제거하였다. Hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색한후 봉입하여 현미경으로 관찰하였다.
Target band를 오려서 Gel elution kit (ELPIS Biotech, Korea) 를 이용하여 DNA를 회수한 후 pGEM-T easy vector (Promega, USA)를 이용하여 cloning 하였다. Plasmid miniprep kit (ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후 솔젠트 회사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다(Solgent, Korea).
그런 다음 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 40회 반복한 후, 2% agarose gel에서 확인하였다. Target band를 오려서 Gel elution kit (ELPIS Biotech, Korea) 를 이용하여 DNA를 회수한 후 pGEM-T easy vector (Promega, USA)를 이용하여 cloning 하였다. Plasmid miniprep kit (ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후 솔젠트 회사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다(Solgent, Korea).
Total RNA 3 μg과 oligo-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다.
Total RNA 3 μg과 oligo-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다. cDNA를 증폭시키기 위해서 해당 primer를 이용하여 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반응하여 전기영동으로 확인하였다. 사용된 primer는 다음과 같다.
건강한 장수풍뎅이와 OrNV에 감염된 장수풍뎅이를 각각 4% PFA에 고정한 다음에 물에 충분히 수세하여 저 농도에서 고농도의 에탄올에 순차적으로 담가 탈수시킨 후 자일렌을 이용하여 투명화 하였다. 그 다음 파라핀으로 포매하고 마이크로톰을 이용하여 4 μm 두께로 잘라 슬라이드에 올린 후 파라핀을 제거하였다.
1B). 근육의 변화를 관찰할수 있는 PTAH염색을 하였다. 점막층은 정상에 비하여 많은 조직적 변화가 관찰된다.
발현차이를 보인 유전자에 해당하는 primer를 이용하여 reverse transcription-PCR방법으로 건강한 장수풍뎅이와 OrNV 에 감염된 장수풍뎅이의 장에서 분리한 total RNA을 대상으로 확인하였다. Total RNA 3 μg과 oligo-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다.
그러나 아직 정확한 발병기전과 치료방법을 알지 못하여 사육농가에 매년 심각한 경제적 손실이 발생하고 있다. 본 연구팀은 이 문제를 해결하기 위하여 OrNV에 감염된 장수풍뎅이의 장(intestine)에서 특이적으로 발현하는 유전자를 differential display-PCR방법으로 동정하였다. 이들 유전자에 대한 깊은 연구는 OrNV의 질병예찰과 치료에 도움을 줄 수 있는 실마리를 제공할 것이다.
Total RNA 3 μg (각각의 건강한 장수풍뎅이와 OrNV에 감염된 장수풍뎅이의 장에서 분리)과 dT-ACP1 oligomer 를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하여 dT-ACP2와 20가지의 arbitrary ACP를 이용하여 95℃에서 1분, 50℃에서 3분, 72℃에서 1분 동안 반응하여 double-strand cDNA 를 합성하였다. 그런 다음 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 40회 반복한 후, 2% agarose gel에서 확인하였다.
이때에 장의 구조적인 변화를 관찰하기 위하여 haematoxylin & eosin (H&E), phosphotungstic acid-hematoxylin (PTAH), Alcian blue 염색법으로 장을 염색하여 조직학적인 구조변화를 현미경하에서 관찰하였다.
장수풍뎅이가 OrNV에 감염되었을 때에 장에서 일어나는 분자기전을 이해하기 위하여 DD-PCR방법을 이용하여, 특이 적으로 발현하는 유전자를 탐색하였다. GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)는 포유동물의 특이유전자탐색에 사용되는 것이지만, 곤충을 상대로 했을 때에도 잘 적용되는 것을 확인 하였다.
대상 데이터
GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)는 포유동물의 특이유전자탐색에 사용되는 것이지만, 곤충을 상대로 했을 때에도 잘 적용되는 것을 확인 하였다. OrNV에 감염된 장과 비 감염된 장으로부터 total RNA를 얻어서 사용하였다. 그 결과 다수의 1차 결과를 얻었지만 reverse PCR결과 많은 false가 확인되었다.
본 연구에 이용된 장수풍뎅이는 표준 사육기준에 따라 사육된 3령 larvae를 경기도 시흥 아이벅스캠프(영농조합법인)로부터 구입한 후, 약 25℃, 40%의 습도 조건의 발효 톱밥에 보관 하였다. 3령 larvae의 머리 부분을 해부침으로 고정시킨 후 표피를 아래에서 머리 방향으로 한 번에 가른다.
이론/모형
GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)를 사용하여 PCRbased differential display 방법으로 선별하였다. Total RNA 3 μg (각각의 건강한 장수풍뎅이와 OrNV에 감염된 장수풍뎅이의 장에서 분리)과 dT-ACP1 oligomer 를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
1C). 점액물질을 염색하는 Alcian blue 염색법으로 장 조직을 염색하였다. 정상적인 점막층이 유지되지 않고 근육층의 발달된 형태이다.
성능/효과
장수풍뎅이가 OrNV에 감염되었을 때에 장에서 일어나는 분자기전을 이해하기 위하여 DD-PCR방법을 이용하여, 특이 적으로 발현하는 유전자를 탐색하였다. GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)는 포유동물의 특이유전자탐색에 사용되는 것이지만, 곤충을 상대로 했을 때에도 잘 적용되는 것을 확인 하였다. OrNV에 감염된 장과 비 감염된 장으로부터 total RNA를 얻어서 사용하였다.
OrNV에 감염된 장과 비 감염된 장으로부터 total RNA를 얻어서 사용하였다. 그 결과 다수의 1차 결과를 얻었지만 reverse PCR결과 많은 false가 확인되었다. 그러나 Fig.
그 결과 다수의 1차 결과를 얻었지만 reverse PCR결과 많은 false가 확인되었다. 그러나 Fig. 2의 결과에서 보는 것과 같이 5개의 유전자는 OrNV감염에 의해서 특이적으로 발현이 조절하는 것이 확인되었다. 즉, OrNV 감염에 의해서 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a는 유전자발현이 상승하고 MIMI_L93는 유전자발현이 하강하였다.
본 연구 결과는 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)가 OrNV 에 감염되면 장에서 조직적인 구조변화가 일어나는 것을 관찰되었다. 이와 함께 장에서 특이적으로 발현이 상승하는 유전자로 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a와 하락하는 유전자로 MIMI_L93을 보고한다.
2의 결과에서 보는 것과 같이 5개의 유전자는 OrNV감염에 의해서 특이적으로 발현이 조절하는 것이 확인되었다. 즉, OrNV 감염에 의해서 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a는 유전자발현이 상승하고 MIMI_L93는 유전자발현이 하강하였다. Krueppel-like factor 15 (Klf15)는 zinc-finger를 가진 전사인자에 속하며 다양한 세포기능을 가지게 하는 넓은 범위의 유전자조절에 관여한다.
후속연구
이 결과는 장수풍뎅이의 대량 사육사 발생하는 virus 질병의 조기진단과 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있을 것으로 기대한다. 그리고 안정적인 대량 생산을 통해서 소득증대 효과 및 균일화된 식품원료로 인정받을 수있을 것이다.
이와 함께 장에서 특이적으로 발현이 상승하는 유전자로 Klf15, ERAP2, Snrnp200, mbnl2a와 하락하는 유전자로 MIMI_L93을 보고한다. 이 결과는 장수풍뎅이의 대량 사육사 발생하는 virus 질병의 조기진단과 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있을 것으로 기대한다. 그리고 안정적인 대량 생산을 통해서 소득증대 효과 및 균일화된 식품원료로 인정받을 수있을 것이다.
이들 유전자에 대한 깊은 연구는 OrNV의 질병예찰과 치료에 도움을 줄 수 있는 실마리를 제공할 것이다. 이는 장수풍뎅이의 안정적인 대량생산을 통해서 생산성 향상과 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 곤충식품원료의 품질관리 가능하게 할 것이다.
본 연구팀은 이 문제를 해결하기 위하여 OrNV에 감염된 장수풍뎅이의 장(intestine)에서 특이적으로 발현하는 유전자를 differential display-PCR방법으로 동정하였다. 이들 유전자에 대한 깊은 연구는 OrNV의 질병예찰과 치료에 도움을 줄 수 있는 실마리를 제공할 것이다. 이는 장수풍뎅이의 안정적인 대량생산을 통해서 생산성 향상과 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 곤충식품원료의 품질관리 가능하게 할 것이다.
용도별로는 학습용이 49억4,000만원, 애완용 372억~496억원, 화분매개 432억원, 천적 30억~50억원, 식용 60억원, 사료용 60억원, 약용 20억~30억원, 행사 소재용 1,816억원이다. 향후 2020년에는 현재 수준보다 약 1.7배 성장한 약 5,500억원 규모에 이를 것으로 전망됐다. 그리고 ‘세계 주요국에서 친환경 농업의 중요성 대두로 화분매개, 천적곤충의 가치가 조명되고 있다’며, ‘우리나라 역시 친환경농업과 시설농업의 성장으로 천적곤충과 화분매개 곤충 시장의 성장가능성이 크다’고 보고하였다[7, 15].
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 치명적인 질병의 원인은 무엇인가?
이들은 관상용으로 시판되고 있으며, 특히 애벌레는 건강보조식품으로도 주목을 받고 있다. 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 치명적인 질병의 원인이 Oryctes rhinoceros nudivirus(OrNV)인 것이 보고되었다[8]. 그러나 아직 정확한 발병기전과 치료방법을 알지 못하여 사육농가에 매년 심각한 경제적 손실이 발생하고 있다.
사육곤충에서 잘 나타나는 곤충질병은 무엇이 있는가?
그러나 영세한 곤충사육농가가 곤충질병에 대한 직접적인 치료와 예방에는 무방비상태이다. 사육곤충에서 잘 나타나는 곤충질병으로는 virus에 의한 백강병, 녹강병, 고름병, bacteria에 의한 물렁물렁병등과 함께 fungus, 원충, 선충, 응애 등이 알려지고 있다. 국내에서도 곤충의 대량 집단사육에 의한 질병피해가 만성적으로 일어나고 있는 것이 보고되고 있다[10].
장수풍뎅이의 생활사는 어떠한가?
수컷은 반짝이는 광택이 나며 머리에 긴 뿔이나 있는데, 그 길이가 몸길이의 절반 정도이다. 이들은 주로 낮에는 어두운 썩은 나무속 혹은 땅 속에 숨어 있다가 밤에 나와서 졸참나무, 상수리나무의 수액을 먹는다. 6-8월에 짝짓기를 한 다음에 썩은 부엽토에 30~70개의 알을 낳는다. 유충은 일생 중 두 번 탈피를 한 뒤 월동하였다가 다음해 초여름에땅 속에서 번데기가 되었다가, 15~20일 뒤에 성충으로 우화한다[13]. 이들은 관상용으로 시판되고 있으며, 특히 애벌레는 건강보조식품으로도 주목을 받고 있다.
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