Background: Valeriana fauriei (Valerianaceae) has been used to as a traditional medicine to treat a variety of symptoms, including headache, insomnia, hypertension, and menstrual irregularity. However, the present study investigates the species' antioxidant activity and its inhibition of oxidative D...
Background: Valeriana fauriei (Valerianaceae) has been used to as a traditional medicine to treat a variety of symptoms, including headache, insomnia, hypertension, and menstrual irregularity. However, the present study investigates the species' antioxidant activity and its inhibition of oxidative DNA damage, which have yet to be studied. Methods and Results: The antioxidant activity was assessed using radical scavenging assays with 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) and, 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and a reducing power assay. The total phenol content was also analyzed, and phenolic compounds were detected using HPLC/UV, whereas the inhibitory effect of Valeriana fauriei on oxidative DNA damage was measured using ${\phi}-174$ RF I plasmid DNA cleavage assay. The DPPH and ABTS radical scavenging activity were $75.17{\pm}3.55%$ and $95.83{\pm}0.63%$, repectively, and the reducing power was $93.14{\pm}1.74$ at $200{\mu}g/m{\ell}$. The total phenol content was $10.24{\pm}0.04mg/g$, whereas chlorogenic acid, catechin, caffeic acid and epicatechin were identified using HPLC/UV, and the ${\phi}-174$ RF I plasmid DNA cleavage assay indicated that V. fauriei provided protection against oxidative damage. Conclusions: The results of the present study suggest that V. fauriei has powerful antioxidant activity that can provide protective effects against the oxidative DNA damage caused by free radicals. The species, therefore, provides a valuable resource for the development of natural pharmaceutical to treat aging, cancer, and degenerative diseases.
Background: Valeriana fauriei (Valerianaceae) has been used to as a traditional medicine to treat a variety of symptoms, including headache, insomnia, hypertension, and menstrual irregularity. However, the present study investigates the species' antioxidant activity and its inhibition of oxidative DNA damage, which have yet to be studied. Methods and Results: The antioxidant activity was assessed using radical scavenging assays with 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) and, 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and a reducing power assay. The total phenol content was also analyzed, and phenolic compounds were detected using HPLC/UV, whereas the inhibitory effect of Valeriana fauriei on oxidative DNA damage was measured using ${\phi}-174$ RF I plasmid DNA cleavage assay. The DPPH and ABTS radical scavenging activity were $75.17{\pm}3.55%$ and $95.83{\pm}0.63%$, repectively, and the reducing power was $93.14{\pm}1.74$ at $200{\mu}g/m{\ell}$. The total phenol content was $10.24{\pm}0.04mg/g$, whereas chlorogenic acid, catechin, caffeic acid and epicatechin were identified using HPLC/UV, and the ${\phi}-174$ RF I plasmid DNA cleavage assay indicated that V. fauriei provided protection against oxidative damage. Conclusions: The results of the present study suggest that V. fauriei has powerful antioxidant activity that can provide protective effects against the oxidative DNA damage caused by free radicals. The species, therefore, provides a valuable resource for the development of natural pharmaceutical to treat aging, cancer, and degenerative diseases.
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문제 정의
본 연구는 쥐오줌풀의 페놀류 화합물의 분석과 에틸아세테이트 분획물의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 억제효과를 평가하여, 기능성 천연 소재로의 활용가치를 높이고자 실시하였다.
제안 방법
Ferrous sulfate (FeSO4) 의한 산화적 스트레스 손상 억제활성 검정을 위해 각 농도별 추출물 40 ㎕와 0.4 mM FeSO4와 0.4 mM hydrogen peroxide (H2O2)를 1:1로 혼합한 용액을 760 ㎕을 첨가한 뒤 37℃에서 15분간 반응하였다. 반응물 20 ㎕와 # RF I plasmid DNA 5 ㎕를 넣고, 37℃에서 3분간 반응한 후, 10X loading buffer와 혼합한 후 1% agarose gel로 전기영동을 실시한 후 UV하에서 사진 촬영하였다.
00이 되도록 에탄올을 이용하여 희석 준비하였다. 각 농도별 추출물 (0.32, 1.6, 8, 40, 200 ㎍/㎖) 40 ㎕ 에 DPPH solution 760 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 20분 반응시켜 UV/ Visible spectrophotometer (Human Co., Xma-3000PC, Korea)를 이용하여 515 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
04 ㎎/g • TAE로 나타났다. 메탄올 추출물 및 페트롤리움 에테르 분획물은 에틸아세테이트 분획물에 비해 비교적 낮은 총 페놀 함량을 나타냈으며, 이 결과를 통해 메탄올 추출물과 페트롤리움 에테르 분획물보다 높은 페놀류 화합물이 포함된 에틸아세테이트 분획물을 HPLC 분석시료로 사용하였다.
쥐오줌풀의 에틸아세테이트 분획물은 건조시료 100 g을 분쇄한 후, 80% 메탄올 3 ℓ 로 3일간 침지한 후 Whatman filter paper (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, England)로 여과하였다. 메탄올 추출물을 40℃이하의 중탕에서 감압 환류 냉각장치 (N-1110S, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 농축한 후 분별 깔대기를 이용하여 페트롤리움 에테르, 에틸아세테이트 순으로 3회 용매분획 하였다. 이 중 에틸아세테이트 분획물을 감압 환류 냉각장치로 농축하여 실험 전까지 −27℃에 보관하였고, DMSO에 4,000 ppm으로 용해하여 시료로 사용하였다.
5 ㎖를 넣어 40분간 실온에서 반응시켰다. 반응물을 흔들지 않고 맑은 액체를 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 725 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Standard는 tannic acid를 사용하였고, 정량 직선방정식을 사용하였다.
실험에 사용된 시료 및 표준품은 1 ㎎을 취하여 1 ㎖의 메탄올에 용해하여 0.45 ㎛membrane filter (Waters, Milford, MA, USA)를 이용해 여과하였고, 시료 10 ㎕를 메탄올 및 1% acetic acid/H2O을 이동상으로 Waters XBridge™ C-18 column (4.6 ㎜ × 250 ㎜) packed with 5.0 ㎛ diameter particles (Waters, Milford, MA,USA)를 이용하여 흡광도 280 ㎚에서 분석하였다.
쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물은 FeCl2 (ferric chloride)의 산화적 스트레스와 FeSO4 (ferrous sulfate)와 H2O2의 fenton반응을 이용한 산화적 스트레스를 이용하여 DNA 손상 억제활성을 평가하였으며, # RF I plasmid DNA cleavage assay를 이용한 비 세포적 시스템으로 평가하였다.
쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 항산화 활성을 비교하기 위해서 강력한 항산화제로 알려진 L-ascorbic acid (Padayatty et al., 2003)와 함께 측정하여 DPPH, ABTS 라디칼 소거활성 그리고 환원력을 비교 분석하여 나타냈다.
0 ㎛ diameter particles (Waters, Milford, MA,USA)를 이용하여 흡광도 280 ㎚에서 분석하였다. 추출물의 각 페놀성 화합물은 각각의 표준품과 비교하여 동정 및 정량하였다. 표준품은 Sigma-Aldrich사의 chlorogenic acid, catechin, caffeic acid, epicatechin (St.
페놀류 화합물의 high performance liquid chromatography(HPLC) 분석은 Waters 2695 system (Waters, Milford, MA, USA)과 Waters 2487 Dual λ absorbance detector (Waters, Milford, MA, USA)를 통해 분석하였다.
대상 데이터
φX-174 RF I plasmid DNA는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 연구에 사용된 쥐오줌풀(Valeriana fauriei)는 충청북도 괴산군 칠성면 쌍곡리 85에서 채집하여 중원대학교 생약자원 개발학과에서 동정하였으며(voucher number: JWU-LSH001), 전초를 사용하였다. HPLC 분석에 사용된 HPLC grade 의 acetonitile, dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol, ethyl acetate, methanol, petroleum ether는 Merck (Frankfurter, Darmstadt, Germany)제품을 사용하였다. 기타 용매는 SK chemicals (Seoul, Korea)제품을 사용 하였다.
항산화 활성을 나타내는 성분들은 주로 페놀성 화합물로, 에탄올이나 에틸아세테이트 등의 유기 용매 또는 수용성 에탄올 용액 등에 잘 녹는다. 본 실험에서는 메탄올 추출물 및 페트롤리움 에테르 그리고 에틸아세테이트 분획물을 비교한 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 항산화 활성 및 추출 수율이 효율적으로 나타나 이 분획물을 추출 용매로 사용하였다 (Table 1).
본 연구에 사용된 쥐오줌풀(Valeriana fauriei)는 충청북도 괴산군 칠성면 쌍곡리 85에서 채집하여 중원대학교 생약자원 개발학과에서 동정하였으며(voucher number: JWU-LSH001), 전초를 사용하였다. HPLC 분석에 사용된 HPLC grade 의 acetonitile, dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol, ethyl acetate, methanol, petroleum ether는 Merck (Frankfurter, Darmstadt, Germany)제품을 사용하였다.
추출물의 각 페놀성 화합물은 각각의 표준품과 비교하여 동정 및 정량하였다. 표준품은 Sigma-Aldrich사의 chlorogenic acid, catechin, caffeic acid, epicatechin (St. Louis, MO, USA)을 이용하였으며, 각 표준품의 정량 직선방정식을 사용하여 정량하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 3번 이상 수행하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 (statistical package for the social sciences Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 실험의 평균과 표준편차를 계산하였고, ANOVA를 통한 p < 0.05 수준에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 사후 검정하여 각 실험의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
RF I plasmid DNA 산화적 스트레스 손상 억제활성은 Jung과 Surh (2001)의 방법을 참고하여 측정하였다. Ferric chloride (FeCl2)에 의한 산화적 스트레스 손상 억제 활성 검정을 위해 각 농도별 추출물 40 ㎕와 6 mM FeCl2 60 ㎕와 증류수 700 ㎕를 넣은 후, 37℃에서 15분 반응하였다.
ABTS 라디칼 소거 활성 능력은 Van den Berg의 방법(Van den Berg et al., 1999)을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 7.
DPPH를 이용한 전자 공여능은 Bondet 방법 (Bondet et al., 1997)을 참고하여 측정하였다. DPPH solution은 300 μM 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 를 515 ㎚에서 흡광도값이 1.
반응물을 흔들지 않고 맑은 액체를 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 725 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Standard는 tannic acid를 사용하였고, 정량 직선방정식을 사용하였다.
총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법 (AOAC, 1984)을 참고하여 측정하였다. 추출물 50 ㎕와 증류수 950 ㎕, folin 500 ㎕를 혼합한 후, 20% sodium carbonate 2.
환원력 측정은 Oyaizu (1986)의 방법을 사용하였다. 각 농도별 추출물 100 ㎕ 에 0.
성능/효과
, 2013). ABTS 라디칼 소거활성에서, L-ascorbic acid (10.49 ㎍/㎖)와 비교하여 IC50 값이 15.47 ㎍/㎖로 상당히 높은 소거활성을 보였다. ABTS와 DPPH는 같은 radical이지만 DPPH는 free radical이며 ABTS는 cation radical이다.
Fe2+에 대한 억제효과는 분획물 농도 0.32, 1.6, 8, 40, 200 ㎍/㎖에서 각각 3.18 ± 0.72%, 4.84 ± 1.55%, 15.93 ±2.46%, 22.69 ± 0.94, 28.25 ± 1.88%의 비교적 낮은 효과를 보인 반면, OH에 대한 억제효과는 분획물 농도 0.32, 1.6, 8, 40, 200㎍/㎖ 에서 19.11 ± 1.65%, 20.97 ± 1.64%, 23.66 ± 2.50%, 44.53 ± 1.79%, 63.66 ± 1.54%의 높은 효과를 보였다.
HPLC를 통해 가장 높은 총 페놀 함량을 나타낸 쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 페놀류 화합물을 분석 및 동정한 결과 (Table 4), chlorogenic acid, catechin, caffeic acid, epicatechin을 동정하였으며, 각 표준품에 의한 정량직선방정식을 통해 함량을 분석한 결과, 각각 2.61 ± 0.05, 0.21 ± 0.01, 1.79 ± 0.03, 0.57 ± 0.03 ㎍/g으로 나타났다.
54%의 높은 효과를 보였다. 농도 의존적으로 산화적 DNA 손상에 대한 억제효과를 보였으며, Fe2+에 대한 낮은 억제효과에 비해 OH에 대한 강한 억제효과를 나타냈다.
따라서 쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물은 메탄올 추출 및 페트롤리움 에테르 분획물에 비해 높은 페놀류 화합물을 포함하고 있는 것을 확인하였으며, 페놀류 화합물에 의해 높은 항산화 활성 및 환원력을 나타내었다. 이를 기반으로, 하이드록실 라디칼에 의한 산화적 DNA 손상에 대해 높은 억제 활성을 나타냈다.
97 ㎍/㎖의 높은 IC50 값을 나타내었다. 또한 통계적으로 40 ㎍/㎖를 제외한 모든 농도에서 L-ascorbic acid와 유의성 없는 뛰어난 활성을 보였다. 쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 환원력은 분획물 농도 0.
따라서 쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물은 메탄올 추출 및 페트롤리움 에테르 분획물에 비해 높은 페놀류 화합물을 포함하고 있는 것을 확인하였으며, 페놀류 화합물에 의해 높은 항산화 활성 및 환원력을 나타내었다. 이를 기반으로, 하이드록실 라디칼에 의한 산화적 DNA 손상에 대해 높은 억제 활성을 나타냈다.
특히 강력한 라디칼로 알려져 있는 OH에 대한 강한 억제효과를 보였다. 이를 통해 금속 킬레이팅 작용에 비해 하이드록실 라디칼에 대한 소거활성이 상당히 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 높은 항산화 효과를 나타내는 미선나무 꽃 에틸아세테이트 분획물의 억제활성 (82%, 200 ㎍/㎖)과 비교할만한 높은 활성을 나타냈다 (Ahn and Park, 2013).
쥐오줌풀 메탄올 추출물, 페트롤리움 에테르 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 총 페놀 화합물 함량을 분석한 결과(Table 4), 총 페놀 함량은 농도별로 희석한 tannic acid의 표준곡선 (TAE)을 통해 함량을 계산하였으며, 각각 2.70 ±0.11, 1.83 ± 0.06, 10.24 ± 0.04 ㎎/g • TAE로 나타났다.
쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물 모두 대조구와 비교해서 모든 농도에서 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 억제하는 활성을 보였다 (Fig. 1). 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 받은 plasmid DNA는 그 구조가 깨지면서 open-circular로 전환되며, 정상적인 plasmid DNA의 형태인 supercoiled는 대조군 및 추출물에 의한 방어효과에 의해 그 형태가 유지된다.
쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성에서, 농도의존적인 효과를 나타내었지만 L-ascorbic acid(5.08 ㎍/㎖)와 비교하여 IC50(inhibitory concentration) 값이 119.50 ㎍/㎖로 현저히 낮은 소거활성을 보였다. 하지만 동속 근연식물인 Valeriana officinalis의 IC50 값 (38 ㎎/㎖)에 비해 매우 높은 값을 보였다 (Dugaheh et al.
쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 환원력은 L-ascorbic acid(100)와 상대적인 값으로 비교하여 200 ㎍/㎖ 의 농도에서 93.14 ± 1.74의 환원력을 나타냈다.
쥐오줌풀의 메탄올 추출물 및 페트롤리움 에테르 분획물, 에틸아세테이트 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성을 비교 측정한 결과 (Table 1), 소거활성이 뛰어난 에틸아세테이트 분획물을 시료로 선택하였으며, 쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 각 추출물의 농도가 높을수록 DPPH 소거 활성이 높았으나 8 ㎍/㎖ 이하의 저농도에서도 낮은 활성을 나타내었다. 추출물의 농도 200 ㎍/㎖에서 75.
쥐오줌풀의 뿌리 및 근경에서 chlorogenic acid, lignans, flavonoids, valerenic acids and valpotrates의 HPLC 분석에 의한 동정 및 확인에 대한 연구 (Navarrete et al., 2006)를 참고하여, HPLC 분석을 통한 페놀류 화합물을 동정한 결과, chlorogenic acid, catechin, caffeic acid, epicatechin이 각각 2.61 ± 0.05, 0.21 ± 0.01, 1.79 ± 0.03, 0.57 ± 0.03 ㎍/g으로 확인되었다.
하지만 쥐오줌풀 에틸아세테이트 분획물의 ABTS 라디칼 소거활성을 평가한 결과 (Table 2), 분획물 농도 200 ㎍/㎖에서 95.83 ± 0.63%의 소거 활성을 나타내었으며 15.97 ㎍/㎖의 높은 IC50 값을 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
정상세포가 종양 세포로 진행될 때 어떤 과정을 거치는가?
DNA 손상을 일으키는 4가지의 중요한 과정으로는 oxidation, methylation, deamination, depurination 등이 있으며, 이중에서 oxidation이 가장 크게 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Ames, 1985). 정상세포에서 종양 세포로 진행하는 과정은 개시 (initiation), 촉진 (promotion), 진행 (progression)의 과정을 거쳐 발생하며, 개시 (initiation)는 전자 친화성 발암인자(initiator)가 생체 내 대사에서 활성화되어, 유전자의 핵산에 비가역적으로 결합하여 정상세포의 DNA를 손상시키고, 신생물 전구세포 (preneoplastic cell)를 형성하는 돌연변이 현상이다. 암의 개시 (initiation) 단계에서 발생되는 DNA 손상은 암발생과 83% 이상의 높은 상관성을 나타내므로, 개시 (initiation)단계에서의 DNA 손상 억제는 항암활성에 있어서 중요한 역할을 한다 (Surh, 1999; Johnson et al.
쥐오줌풀은 무엇인가?
본 연구에서 사용된 쥐오줌풀 (Valeriana fauriei)은 마타리과 (Valerianaceae)에 속하는 다년생 초본으로서 뿌리 및 뿌리 줄기는 약용 또는 정유 채취를 위한 소재로서 이용되고 있다(Houghton, 1988; Lawrence, 1985). 쥐오줌풀의 식물명은 식물의 뿌리에서 쥐오줌 냄새 같은 독특한 향이 나기 때문에 붙여진 이름으로서 성분으로는 valeric acid, isovalerianic acid, bornylvalerianate, valrerianone, bornylacetate, camphene, αβ-pinene, limonene, kessane, kassanol, kanokonol 등을 함유하고 있다 (Cho et al.
활성산소종 과다에 의해 항산화효소와의 항상성이 깨지면 어떤 문제가 생기는가?
활성산소종인 radical은 세포대사과정에서 끊임없이 생성되고, 체내에서 생성되는 활성산소종과 항산화효소와의 항상성이 깨어지게 되면 산화적 스트레스로 인한 노화, 당뇨, 비만과 같은 각종 질병들을 야기하게 된다(Halliwell, 1995). 이러한 산화적 스트레스로 인한 활성산소의 강한 반응성이 체내의 당, 지질, 단백질과 DNA까지도 비가역적인 변형과 파괴를 유래하여 여러 가지 질병을 유발 하는 것으로 알려져 있다 (Seifried et al., 2007).
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