[국내논문]전이금속 갈륨(Ga(NO3)3)을 이용한 biofilm을 형성하는 어류질병세균의 억제 Inhibitory Effect of Transition Metal Gallium [Ga(NO3)3] on Biofilm Formation by Fish Pathogens원문보기
제주도 넙치 양식장에서 주로 발생하는 어류질병세균인 S. parauberis, S. iniae, E. tarda에 대한 피해를 줄이고자 갈륨을 이용하여 어류질병세균을 억제하고자 한다. 본 연구진은 Sp, Si, Et의 생육도와 biofilm 형성능을 확인하였으며, 세균의 성장도와 biofilm 형성능간의 특정한 패턴은 없었으며 세균의 성장도가 높다 하더라도 biofilm을 활발히 형성하지 않음을 알 수 있었다. 어류질병세균이 형성하는 biofilm을 저해하기 위해 갈륨을 2.0, 4.0, 8.0 mg/ml로 첨가하여 저해능을 확인한 결과 72시간째 biofilm의 형성이 크게 저해되는 것을 확인하였다. 또한 biofilm을 저해하는 동시에 균주의 사멸능을 확인하기 위해 resazurin assay와 propidium iodide를 이용하여 염색한 결과 갈륨의 농도에 따라 균주의 사멸이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 따라 in vitro 상에서 갈륨이 어류질병세균의 biofilm을 억제하는 동시에 균주를 사멸시키는 물질로서 가치가 있다고 사료된다.
제주도 넙치 양식장에서 주로 발생하는 어류질병세균인 S. parauberis, S. iniae, E. tarda에 대한 피해를 줄이고자 갈륨을 이용하여 어류질병세균을 억제하고자 한다. 본 연구진은 Sp, Si, Et의 생육도와 biofilm 형성능을 확인하였으며, 세균의 성장도와 biofilm 형성능간의 특정한 패턴은 없었으며 세균의 성장도가 높다 하더라도 biofilm을 활발히 형성하지 않음을 알 수 있었다. 어류질병세균이 형성하는 biofilm을 저해하기 위해 갈륨을 2.0, 4.0, 8.0 mg/ml로 첨가하여 저해능을 확인한 결과 72시간째 biofilm의 형성이 크게 저해되는 것을 확인하였다. 또한 biofilm을 저해하는 동시에 균주의 사멸능을 확인하기 위해 resazurin assay와 propidium iodide를 이용하여 염색한 결과 갈륨의 농도에 따라 균주의 사멸이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 따라 in vitro 상에서 갈륨이 어류질병세균의 biofilm을 억제하는 동시에 균주를 사멸시키는 물질로서 가치가 있다고 사료된다.
The prevalence of pathogenic bacteria such as Streptococcus parauberis (Sp), Streptococcus iniae (Si), and Edwardsiella tarda (Et) in flounder fish farms in Jeju Island and their management by gallium treatment was studied. Sp, Si, and Et were found to exhibit a low rate of cell growth and high biof...
The prevalence of pathogenic bacteria such as Streptococcus parauberis (Sp), Streptococcus iniae (Si), and Edwardsiella tarda (Et) in flounder fish farms in Jeju Island and their management by gallium treatment was studied. Sp, Si, and Et were found to exhibit a low rate of cell growth and high biofilm formation. Hence, in the present study, cell growth and biofilm formation were measured spectrophotometrically 72 h after the addition of different concentrations of gallium (2, 4, or 8 mg/ml). In addition, cell death was measured by resazurin and propidium iodide staining assays. The results showed that bacterial cell death increased and biofilm formation decreased with an increasing concentration of gallium. Hence, the present study signifies that the use of gallium against bacterial pathogens could be useful for disease management in flounder farms.
The prevalence of pathogenic bacteria such as Streptococcus parauberis (Sp), Streptococcus iniae (Si), and Edwardsiella tarda (Et) in flounder fish farms in Jeju Island and their management by gallium treatment was studied. Sp, Si, and Et were found to exhibit a low rate of cell growth and high biofilm formation. Hence, in the present study, cell growth and biofilm formation were measured spectrophotometrically 72 h after the addition of different concentrations of gallium (2, 4, or 8 mg/ml). In addition, cell death was measured by resazurin and propidium iodide staining assays. The results showed that bacterial cell death increased and biofilm formation decreased with an increasing concentration of gallium. Hence, the present study signifies that the use of gallium against bacterial pathogens could be useful for disease management in flounder farms.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 전이금속 갈륨을 이용하여 어류질병 세균이 생성하는 biofilm을 억제하여 세균을 사멸시키고자 한다.
제안 방법
48시간 배양된 균주에 따라 각각 resazurin을 20 µl씩 접종하여 6시간동안 반응대기 후 색의 변화를 관찰하였다[12].
갈륨(Gallium nitrate, Sigma., USA)을 이용하여 어류질병세균의 biofilm 저해능을 확인하기 위해 96 well plate에 Muller Hinton Broth (MHB, Difco., USA)를 100 µl를 분주한 뒤, 어류질병세균을 PBS에 105CFU/ml의 농도로 희석하여 에 접종하여 100 µl 접종하였다.
, USA)를 100 µl를 분주한 뒤, 어류질병세균을 PBS에 105CFU/ml의 농도로 희석하여 에 접종하여 100 µl 접종하였다. 갈륨을 농도별(2.0,4.0, 8.0 mg/ml)로 처리하여 각각 25℃에서 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양하여 biofilm의 저해능을 측정하였다[2, 16].
갈륨을 이용하여 어류질병세균에 대한 저해능을 확인하기 위해 Chamber slide (NUNK, USA)에 MHB를 150 µl씩 분주를 한 후, 105CFU로 희석한 어류질병균주를 100 µl씩 접종하였다.
갈륨이 biofilm을 억제하는 동시에 균주를 직접적으로 사멸시키는지 알아보기 위해, RRT를 이용하여 어류질병세균의 사멸을 확인하였다. 갈륨을 처리하지 않은 어류질병세균에 resazurin을 각각 처리하였을 시, 청색에서 진한 분홍색으로 색이 변하였다(Fig.
갈륨이 병원균을 직접적으로 사멸시키는지를 확인하기 위해 균주를 배양한 후 갈륨을 처리하여 PI로 염색을 하여 병원균의 사멸을 확인하였다. 갈륨을 처리하지 않은 그룹에서 세포의 사멸이 일어나지 않았지만, 갈륨을 처리한 그룹에서 세포의 사멸이 눈에 띄게 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig.
또한 어류질병세균의 biofilm 형성능을 알아보기 위해 96 well plate에 BHIB 배지 100 µl를 분주한 뒤, 105CFU/ml로 희석된 균주를 분주한 배지에 100 µl씩 접종하여 25℃에서 48시간 동안 정치 배양시켰다.
PI를 2 mg/ml의 농도로 chamber slide에 10 µl씩 분주하여 25℃에서 30분 반응시켰다[3]. 반응 후 공촛점현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, Olympus Optical Co., Japan)을 이용하여 관찰하였다.
어류질병균주를 이용하여 biofilm 형성능과 생육도를 측정하였다(Fig. 1). 어류질병세균의 생육도의 경우 Et가 Sp, Si에 비해 높게 나타났지만, biofilm 형성능의 경우 Sp가 Si, Et에 비해 높게 나타났다.
어류질병세균에 대해 갈륨이 biofilm을 저해하는지 알아보기 위해 각각의 균주를 배양한 후 갈륨을 농도별(2.0, 4.0, 8.0 mg/ml)로 첨가하여 biofilm을 측정하였다(Fig. 2). 3균주 모두 48시간째부터 biofilm 형성이 저해되기 시작하여, 72시간째 갈륨을 처리하지 않은 컨트롤에 비해 biofilm이 크게 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
어류질병세균의 성장능을 측정하기 위해 전 배양한 균주를 멸균 Phosphate Buffered Saline (PBS)에 105CFU/ml로 희석하여 96 well plate (Thermo Scientific Nunc., USA)에 200 µl씩 접종하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
제주도 내 넙치 양식장에서 주로 발생하는 Streptococcus parauberis KCTC 3651 (Sp), Streptococcus iniae KCTC 3657 (Si), Edwardsiella tarda KCTC 12267 (Et)을 생물자원센터(Korea Collection for Type Culture, KCTC)에서 분양받았다. 분양받은 균주를 Brain Heart Infusion Agar(BHIA, Difco.
성능/효과
2). 3균주 모두 48시간째부터 biofilm 형성이 저해되기 시작하여, 72시간째 갈륨을 처리하지 않은 컨트롤에 비해 biofilm이 크게 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
2A). Si, Et는 72시간 째 갈륨의 모든 농도에서 컨트롤에 비해 biofilm 형성능이 저해되는 것을 확인하였으며, 이중 갈륨 농도 4.0 mg/ml에서 가장 큰 biofilm 저해능을 보였다(Fig. 2B, 2C).
갈륨이 병원균을 직접적으로 사멸시키는지를 확인하기 위해 균주를 배양한 후 갈륨을 처리하여 PI로 염색을 하여 병원균의 사멸을 확인하였다. 갈륨을 처리하지 않은 그룹에서 세포의 사멸이 일어나지 않았지만, 갈륨을 처리한 그룹에서 세포의 사멸이 눈에 띄게 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 또한 갈륨의 농도가 높아질수록 사멸되는 균주도 같이 증가하는 것을 확인할 수 있었다[19].
균주를 105 CFU/ml로 접종하여 갈륨을 2.0, 4.0, 8.0 mg/ml의 농도로 처리한 그룹에서는 연한분홍색에서 진한 노란색으로 색이 변한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
어류질병 3균주 중 Et에서 가장 큰 biofilm 저해능을 나타났다. 이는 갈륨이 이미 형성된 biofilm 자체를 파괴하는 효과가 있으며, biofilm의 형성능이 높고 낮음에 상관없이 biofilm을 억제하기 때문에 매우 긍정적인 결과가 할 수 있다[2, 9].
1). 어류질병세균의 생육도의 경우 Et가 Sp, Si에 비해 높게 나타났지만, biofilm 형성능의 경우 Sp가 Si, Et에 비해 높게 나타났다. 이러한 결과로 미루어 보아 균주별 성장도와 biofilm 형성능간의 특정한 패턴이 없이 나타났으며, 세균의 성장도가 높다 하더라도 꼭 biofilm을 활발히 형성하지 않음을 알 수 있었다.
어류질병세균의 생육도의 경우 Et가 Sp, Si에 비해 높게 나타났지만, biofilm 형성능의 경우 Sp가 Si, Et에 비해 높게 나타났다. 이러한 결과로 미루어 보아 균주별 성장도와 biofilm 형성능간의 특정한 패턴이 없이 나타났으며, 세균의 성장도가 높다 하더라도 꼭 biofilm을 활발히 형성하지 않음을 알 수 있었다.
이러한 일련의 실험을 통하여 갈륨이 어류질병을 유발시키는 3가지 균주에 biofilm을 억제시키는 동시에 사멸까지 일으키는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 수행된 갈륨이 어류질병세균을 억제하고 항생제 내성균의 요인이 되는 biofilm을 억제하는 물질로서 가치가 있다고 사료된다.
후속연구
이러한 일련의 실험을 통하여 갈륨이 어류질병을 유발시키는 3가지 균주에 biofilm을 억제시키는 동시에 사멸까지 일으키는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 수행된 갈륨이 어류질병세균을 억제하고 항생제 내성균의 요인이 되는 biofilm을 억제하는 물질로서 가치가 있다고 사료된다.
추후 이러한 in vitro 상에서의 실험결과를 이용하여 양식 넙치에 적용하여 독성 및 안전성에 대한 실험을 진행하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
양식기술이 도입된 넙치의 생산력 추이는 어떠한가?
그 중 우리나라의 대표적인 해상양식어류인 넙치는 1989년부터 종묘생산기술이 확립되어 경제성 증대를 위한 고밀도 사육방법으로 양식기술이 보급되어 왔다. 양식 넙치의 생산력증대는 다각적인 연구 노력으로 2004년 32,141톤,2009년 56,674톤, 2011년 40,805톤, 2013년 36,944톤,2014년 42,137톤으로 꾸준히 성장해왔다[14].
S. parauberis, S. iniae, E. tarda는 무엇인가?
제주도 넙치 양식장에서 주로 발생하는 어류질병세균인 S. parauberis, S.
어류양식기술이 처음 도입된 시기는 언제인가?
우리나라는 1980년대부터 어류양식기술을 도입하여 육성하였다. 그 중 우리나라의 대표적인 해상양식어류인 넙치는 1989년부터 종묘생산기술이 확립되어 경제성 증대를 위한 고밀도 사육방법으로 양식기술이 보급되어 왔다.
참고문헌 (19)
Ansar AS, Gogal RM, Walsh JE. 1994. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H] thymidine incorporation assay. J. Immunol. Method. 170: 211-224.
Banin E, Lozinski A, Brady KW, Berenshtein E, Butterfield PW, Moshe M, et al. 2008. The potential of desferrioxamine-gallium as an anti-Pseudomonas therapeutic agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 16761-16766.
Chiang WC, Cilsson M, Jensen PO, Hoiby N, Nielsen TE, Givskov M, et al. 2013. Extracellular DNA Shields against Aminoglycosides in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 57: 2352-2361.
De Fries R, Mitsuhashi M. 1995. Quantification of mitogen induced human lymphocyte proliferation: Comparison of alamarbluetm assay to 3hthymidine incorporation assay. J. Clin. Lab. Anal. 9: 89-95.
Im JT, Park IK, Koh TS. 2007. Proliferation assay of splenocyte and PBMC by the evaluation of alamar blue dye reduction value in broiler chicks. J. Anim. Sci. Technol. 49: 213-224.
Jung SH, Choi DL, Kim JW, Jo MR, Jee BY, Seo JS. 2009. Pharmacokinetics of oxolinic acid in cultured olive flounder Paralichthys olivaceus by oral administration, injection and dipping. J. Fish. Pathol. 22: 125-135.
Kaneko Y, Thoendel M, Olakanmi O, Britigan BE, Singh PK. 2007. The transition metal gallium disrupts Pseudomonas aeruginosa iron metabolism and has antimicrobial and antibiofilm activity. J. Clin. Invest. 117: 877-888.
Kim JH, Kim CH, Hacker J, Ziebuhr W, Lee BK, Cho SH. 2008. Molecular characterization of regulatory genes associated with biofilm variation in a Staphylococcus aureus strain. J. Microbiol. Biotechnol. 18: 28-34.
Lee CH, Kim PY, Ko CS, Oh DC, Kang BJ. 2007. Biological characteristics of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from cultured flounder, Paralichthys olivaceus, in Jeju. J. Fish. Pathol. 20: 33-40.
Lee JH. 2015. A review on microbialites: a Korean perspective. J. Petrol. Soc. Korea 24: 291-305.
Ministry for Food Agriculture Forestry and Fisheries. 2014. Statistical year book of maritime affairs and fisheries.
National Fisheries Research & Development Institute. 2015. Prevention of bacterial fish disease and medical treatment for produce health fish.
Nguyen HT, Kanai K. 1999. Selective agars for the isolation of Streptococcus iniae from Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, and its cultural environment. J. Appl. Microbiol. 86: 769-776.
Park JS, Ju SA, Heo MS, Jung CR, Ju JW. 1999. Purification siderophore from Vibrio mimicus ATCC 33653 and its effect to bacterial pathogenicity. J. Korean Soc. Microbiol. 34: 461-470.
Statistics Korea. 2015. Aquaculture Status Survey.
Woo SH, Lee JH, Kim YK, Cho MY, Jung SH, Kim JW, et al. 2010. Effects of garlic Allium sativum extract immersion on the immune responses of olive flounder Paralichthys olivaceus prechallenged with pathogenic bacteria. J. Fish. Pathol. 23: 199-209.
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