선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 增味二陳湯이 역류성 식도염 유발이 된 생쥐의 위와 식도 조직에 대한 영향을 살펴보기 위해 생쥐를 아무처지도 받지 않은 대조군(CON)과 외과적 수술 결찰로 역류성 식도염을 유발한 군(RE), 역류성 식도염 유발전 增味二陳湯 추출액을 투여한군(JYT)군으로 나누어 위식도점막의 형태학적변화, 식도점막의 TNF-α와 IL-1β, MMP-9, apoptotic cell 변화를 관찰하여 유의성있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Apoptosis 확인을 위해 in situ apoptosis detection kit(Apoptag, Intergen, USA)를 이용한 Tunel(terminal deoxynucleotid trasferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling) 염색을 실시하였다. 절편된 조직을 탈파라핀한 후 proteinase K에 5분간 proteolysis 시킨 다음 equilibration buffer에서 20초간 처리하였다.
- PBS로 수세한 후 ABC용액(ABC kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingama, CA. USA)에30분간반응시킨후0.05%3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma)로 발색 반응을 확인하였으며, Hematoxylin으로 대조 염색하여 광학현미경(Olympus BX50, Japan) 하에서 비교 관찰한 후 디지털 카메라(Nikon E995, Japan)로 촬영하였다.
- 절편된 조직을 탈파라핀한 후 proteinase K에 5분간 proteolysis 시킨 다음 equilibration buffer에서 20초간 처리하였다. Strength TdT enzyme을 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 strength stop/wash buffer에서 10분, anti-digoxigenin-peroxidase에서 1시간 처리한 후 DAB로 발색 반응을 확인하고 eosin으로 대조 염색하여 광학현미경 하에서 관찰한 후 통계처리에 이용하였다.
- Tunel 염색한 각 조직 표본 중 5곳을 100배율에서 관찰하였다. 세포자멸사(apoptosis)가 유도된 세포를 개수하여 통계 처리하였으며, 그래프는 means±S.
- 본 실험에서도 역류성 식도염을 유발하는 위 결찰을 행한 6시간 후 위와 식도 조직을 관찰하였을 때 RE군의 위 조직은 많은 손상이 일어났으나 식도 부위에는 형태학적 변화가 뚜렷이 관찰되지 않았다. 대신 RE군의 식도의 상피조직의 바닥층에서 세포분열 중인 세포가 많이 관찰되었는데, 이것은 역류성 식도염에서 기저부과다증식(basal zone hyperplasia)을 관찰 할 수 있는 병리적 근거24,25로, 본 연구의 역류성 식도염 유발에 응용하였다.
- 동물을 sodium pentobarbital(0.3 ml/100 g)로 마취시킨 후 복부를 절개하여 식도와 위를 절취하여 얻어진 조직을 10% 포르말린에 12시간 고정시킨 후 흐르는 물에 수세하였으며, 탈수화과정을 거친 다음 파라핀에 포매시켜 6 μm로 연속 절편하여 조직화학 및 면역조직화학적 염색 그리고 Tunel 염색에 이용하였다.
- 세포자멸사(apoptosis)가 유도된 세포를 개수하여 통계 처리하였으며, 그래프는 means±S.E 값으로 하였다.
- 의 방법으로 유발하였다. 수술은 24시간 전부터 절식시킨 실험쥐를 sodium pentobarbital로 마취시킨 후 복강을 열어 위의 위저부와 유문부쪽을 실크실로 결찰시켰다. 봉합 6시간 후 실험동물을 희생시켜 식도와 위부위를 절취하여 실험에 이용하였다.
- 실험동물군으로는 역류성 식도염 유발군(RE), 增味二陳湯 투여군(JYT)으로 하였으며, 정상적인 실험동물(무처치군)을 대조군(CON)으로 하였다.
- 실험쥐에게(JYT) 위수술하기 전 14일 동안 1일 1회 1.5 ml씩 구강투여(1.5 ml/day/300 g)하여, 수술 1시간 전에 마지막 약물을 투여하였다.
- 약재는 增味二陳湯 2첩(79 g)을 물 1500 ml을 넣어 90 ℃에서 3시간 달인 후 100 ml로 감압 농축한 후, 농축된 JYT(수율, yield=4.06%)를 실험쥐에게 1일 1회 1.5 ml씩(1.5 ml/day/300 g) 구강 투여하였다. 단 세포처리를 위하여 동결건조하여 사용하였다.
- 역류성 식도염을 관찰하기 위해 먼저 위액의 분비로 인한 위조직의 형태적 변화를 확인하고자 H&E염색을 시행하였다.
- 이에 저자는 增味二陳湯 이 역류성 식도염 유발이 된 생쥐의 위와 식도 조직에 대한 영향을 살펴보기 위해 생쥐를 아무처지도 받지 않은 대조군(CON)과 외과적 수술로 결찰로 역류성 식도염을 유발한 군(RE), 역류성 식도염 유발전 증미이진탕 추출액을 투여한 군(JYT)으로 나누어 위식도 연결부 점막의 형태학적 변화, TNF-α와 IL-1β, MMP-9, apoptotic cell 변화를 관찰하였다.
- 절편된 조직 표본을 xylene을 이용하여 탈파라핀한 후 가수화(rehydration)하여 조직화학적 염색으로는, 일반적으로 시행하는 H&E 염색과 중성점액다당류를 청색으로 염색시키는 PAS, 비만세포(mast cell) 관찰을 위해 Luna 염색을 행하였다.
대상 데이터
- 역류성 식도염을 관찰하기 위해 먼저 위액의 분비로 인한 위조직의 형태적 변화를 확인하고자 H&E염색을 시행하였다. 대조군은 전형적인 위샘의 구조를 관찰할 수 있었다(Fig. 1A). 그러나 유발군은 위샘의 구조가 명확한 형태를 나타내지 못하며 짓무름(erosion) 현상으로 매우 손상되었으며, 또한 점막내근육층이 소실된 부분이 나타났으며 점막밑층에는 염증세포들의 침투, 증식이 두드러지게 관찰되었다(Fig.
- 본 실험에 사용한 약재의 반하, 적복령, 황련, 감초((주)지오허브), 진피, 치자, 향부자, 천궁, 백작약(선일제약), 지실(진영제약), 신곡(남영제약), 창출(옴니허브)에서 1첩당 용량은 다음과 같다.
- 실험에 사용된 동물은 SD계 수컷 흰쥐(6 주령)를 오리엔트바이오로부터 구입하여, 일주일 동안 온도 22±1 ℃, 습도 55±3%인 실험실 환경에서 12시간 밤낮 주기로 적응시킨 후 실험군 당 5-7마리씩 나누어 사용하였다.
데이터처리
- E 값으로 하였다. 실험군 간의 유의성 검증을 위해 SPSS(ver. 20.0) program을 이용하였으며, one-way ANOVA로 분석하고 DUNCAN으로 사후 검증하였다. 유의수준은 p<0.
이론/모형
- 역류성 식도염은 Nakamura 등1의 방법으로 유발하였다. 수술은 24시간 전부터 절식시킨 실험쥐를 sodium pentobarbital로 마취시킨 후 복강을 열어 위의 위저부와 유문부쪽을 실크실로 결찰시켰다.
성능/효과
- 1. RE군에서 위조직의 염증과 궤양이 유발되나 식도 점막 손상에는 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았다.
- 2. RE군의 식도점막에서는 apoptotic cell의 증가 및 비만세포의 증식이 확인되어 초기 염증 반응에 비만세포가 관여하고 있음을 알 수 있었다.
- 3. JYT군은 RE군에 비해 proinflammatory cytokines인 TNF-α와 IL-1β의 발현 억제로 인해, 혈관의 투과성이 억제되어 조직의 부종 및 비만세포의 침투가 억제됨을 확인할 수 있었다.
- 4. JYT군은 RE군에 비해 TNF-α로 유도되는 MMP-9의 발현 억제로 인해 비만세포의 탈과립 현상이 억제됨을 확인하였다.
- 5. JYT군은 RE 군에 비해 apoptotic cell 증가가 억제되었다.
- MMP-9 발현을 관찰한 결과, 대조군에서는 비만세포에서 매우 약한 양성 반응을 나타내었으나(Fig. 6A), 유발군에서 비만세포에서 매우 강한 양성반응을 나타내었고 탈과립의 형태를 뚜렷이 확인할 수 있었다(Fig. 6B). 처리군에서도 MMP-9에 대한 양성 반응이 관찰되었으나 유발군에 비해 약하거나, 강한 반응을 나타내는 세포들이라도 탈과립 현상은 현저히 낮게 관찰되었다(Fig.
- PAS 염색을 통한 위조직의 변화를 관찰한 결과 대조군에서는 표면상피세포에서 분비된 점액이 적색으로 염색되어 위오목과 위샘의 표면을 덮고 있었으며, 이는 산성의 환경으로부터 보호되고 있음을 알 수 있다(Fig. 1D). 반면, 유발군은 위샘조직손상으로 인해 점액을 분비할 수 있는 세포가 소실되어 대조군에 비해 현저히 감소되었으나(Fig.
- TNF-α의 발현을 확인한 결과, 대조군에서는 점막층 중 고유판(lamina propria)과 점막밑층에서 약한 양성 반응을 나타내었다(Fig. 5A).
- Tunel 염색을 통해 세포자멸사를 유도하는 것을 확인한 결과, 대조군에 비해 유발군은 평균 12.0±0.4개인 반면, 처리군은 평균 4.6±0.5개로 개수되었다.
- 그러나 IL-1β의 경우는 혈관의 내피세포에서 강한 양성반응이 나타났으므로 혈관의 내피세포에 영향을 미쳐 투과성을 증가시킬 것으로 예상되며, TNF-α에 비해 반응의 범위가 극히 제한되어 나타나는 것은 IL-1β의 발현이 TNF-α에 의해 유도되기 때문에39 초기에는 TNF-α에 비해 발현 범위와 발현 양은 낮으나, 혈관의 내피세포에 가장 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
- 그러므로 增味二陳湯이 위 결찰로 유도되는 역류성 식도염에 있어서, pro-inflammatory cytokine인 TNF-α를 억제함으로서 비만세포로부터 유도되는 활성 MMP-9에 의한 탈과립 현상의 억제와 조직의 염증 진행을 억제한다는 것을 알 수 있다.
- 또한 유발군(RE)에서 비만세포(mast cell)의 증식과 탈과립 현상이 대조군에 비해 현저히 증가되었으나 JYT군의 경우 RE에 비해 감소되어, 비만세포의 증식과 탈과립 현상이 초기 역류성 식도염에 중요한 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.
- 1D). 반면, 유발군은 위샘조직손상으로 인해 점액을 분비할 수 있는 세포가 소실되어 대조군에 비해 현저히 감소되었으나(Fig. 1E), 처리군에서는 유발군에 비해 현저히 증가되었다(Fig. 1F).
- 반면, 처리군에서는 비만세포에서의 양성반응은 관찰되었으나, 혈관의 내피세포에서는 IL-1β의 발현이 유발군에 비해 현저히 감소되거나 반응이 거의 나타나지 않았다(Fig. 4C).
- 본 실험에 있어서 TNF-α의 양성 반응은 유발 군(RE)의 점막고유판과 점막밑층에서 강하게 나타났으며 부종이 관찰됨으로 인해 TNF-α에 의한 염증진행임을 알 수 있다.
- Apoptosis는 Bcl-2 family protein과 cysteine acid proteases인 caspase들이 중요한 조절인자로 작용하는 것으로 알려지고 있다40. 본 실험에서 apoptosis에 의한 염증 손상이 유도되는지 알아보고자 tunel 염색으로 확인한 결과, 유발군(RE)에서 apoptosis 증가된 것을 확인하였으며 약물을 투여한 결과 식도부분에서 apoptosis가 억제됨으로 인해 增味二陳湯이 apoptosis 유도를 억제하는 효과도 있는 것을 확인하였다.
- 본 실험에서도 TNF-α의 증가와 MMP-9의 발현 증가가 확인되었으며, 특히 MMP-9은 비만세포에서 관찰되었는데 유발군(RE)에서 매우 강한 과립형태의 발현이 확인되었으나 JYT군 에서는 비만세포에서 MMP-9의 발현이 현저히 감소되었다.
- 본 실험에서도 역류성 식도염을 유발하는 위 결찰을 행한 6시간 후 위와 식도 조직을 관찰하였을 때 RE군의 위 조직은 많은 손상이 일어났으나 식도 부위에는 형태학적 변화가 뚜렷이 관찰되지 않았다. 대신 RE군의 식도의 상피조직의 바닥층에서 세포분열 중인 세포가 많이 관찰되었는데, 이것은 역류성 식도염에서 기저부과다증식(basal zone hyperplasia)을 관찰 할 수 있는 병리적 근거24,25로, 본 연구의 역류성 식도염 유발에 응용하였다.
- 본 실험을 통하여 증미이진탕은 실험적으로 유발된 위식도점막에서 식도점막의 염증을 억제하는 효과가 있고, 기전은 식도점막에서 염증 초기 발현 인자인 TNF-α와 IL-1β MMP-9 발현 억제와 apotosis 억제로 이루어지는 것으로 판단된다.
- 식도에서 IL-1β 발현은 대조군에서 혈관의 내피세포에 매우 약한 반응을 나타내거나 반응이 거의 없었으며, 관찰되는 비만세포에서 양성 반응을 나타내었다(Fig. 4A).
- 식도의 H&E 염색 결과, 대조군과 약물처리군은 형태적인 변화의 차이를 비교할 수 없었으나(Fig. 2A, 2C), 유발군은 식도 상피조직의 바닥층에서 세포분열이 일어나고 있는 세포가 대조군에 비해 많이 관찰되었다(Fig. 2B).
- 1B). 약물 처리군에서는 유발 군에 비해 위샘의 손상 정도가 감소되었으며, 점막 밑층에서 관찰되는 염증세포도 유발군에 비해 현저히 감소하였다(Fig. 1C).
- 유발군에서는 비만세포 뿐만 아니라 혈관의 내피세포에서 매우 강한 양성 반응을 나타내어(Fig. 4B), 역류성 식도염으로 인해 혈관의 내피세포에서 IL-1β 발현의 증가됨을 알 수 있었다.
- 5개로 개수되었다. 유의성 검증에서 처리군과 유발군은 유의적인 차이를 나타내어 증미이진탕이 세포자멸사에 매우 효과적인 억제제로 작용함을 나타내었다(Fig. 7)
- 이상의 결과로 증미이진탕은 염증초기발현인자의 발현 억제와, apotosis 억제로 식도점막의 염증 진행을 억제시키는 항염증 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 처리군에서는 TNF-α에 대한 양성 반응이 대조군에 비해 강하게 나타나는 부분이 있었으나 유발군에 비해 현저히 감소되었으며 부종 현상도 거의 관찰되지 않았다(Fig. 5C).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.