HPLC의 이동상 용매조건에 따른 인삼 Ginsenoside 분석 Analytical Optimum of Ginsenosides according to the Gradient Elution of Mobile Phase in High Performance Liquid Chromatography원문보기
HPLC에 의한 미량 Ginsenoside의 분석법을 확립하고자 연구를 수행하였던 바, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 인삼 ginsenosid의 분석은 많이 시도되어 왔으나 주요 사포닌 및 미량 사포닌의 분석법이 정립되지 않고 있는 실정인바, 본 연구에서는 이동상 용매의 기울기 용리를 다양하게 변화를 주어 Rb$_1$, Rb$_2$, Rb$_3$, Rc, Rd, Re, Rf Rg$_1$, Rg$_2$, Rg$_3$, Rh$_1$, Rh$_2$의 총 12종의 사포닌을 양호하게 분리하는데 성공하였다. 이동상의 흐름 속도는 1.00ml/min이고 column온도는 35$^{\circ}$C, UV detector의 파장은 203nm로 모두 일정하게 한 결과였으며, 최적의 분석조건은 H$_2$O와 CH$_3$CN의 용매 조성이 82/18, 70/30, 55/45, 50/50으로 각각의 ginsenosides의 안정적인 Area 값을 얻을 수 있었고 재현성을 시도해본 결과, 반복간 편차가 적어 재현성이 매우 양호한 것으로 나타났다.
HPLC에 의한 미량 Ginsenoside의 분석법을 확립하고자 연구를 수행하였던 바, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 인삼 ginsenosid의 분석은 많이 시도되어 왔으나 주요 사포닌 및 미량 사포닌의 분석법이 정립되지 않고 있는 실정인바, 본 연구에서는 이동상 용매의 기울기 용리를 다양하게 변화를 주어 Rb$_1$, Rb$_2$, Rb$_3$, Rc, Rd, Re, Rf Rg$_1$, Rg$_2$, Rg$_3$, Rh$_1$, Rh$_2$의 총 12종의 사포닌을 양호하게 분리하는데 성공하였다. 이동상의 흐름 속도는 1.00ml/min이고 column온도는 35$^{\circ}$C, UV detector의 파장은 203nm로 모두 일정하게 한 결과였으며, 최적의 분석조건은 H$_2$O와 CH$_3$CN의 용매 조성이 82/18, 70/30, 55/45, 50/50으로 각각의 ginsenosides의 안정적인 Area 값을 얻을 수 있었고 재현성을 시도해본 결과, 반복간 편차가 적어 재현성이 매우 양호한 것으로 나타났다.
This study was conducted to analyze not only for the quality guaranteed of red ginseng but also for the minor ginsenosides. Although several studies have reported to analyze ginseng saponins, those were focused to major saponins, including 6 to 7 ginsenosides. As increase of interest in medicinal ef...
This study was conducted to analyze not only for the quality guaranteed of red ginseng but also for the minor ginsenosides. Although several studies have reported to analyze ginseng saponins, those were focused to major saponins, including 6 to 7 ginsenosides. As increase of interest in medicinal effect of ginseng products, anasis of various ginsenosides in both red and white ginseng are strongly demanded. To perform optital condition of 12 ginsenoside analysis, We controlled HPLC conditions, such as the gradient elution of the mobile phase. We found the adequate separation method for 12 ginse-nosides. The optimum condition was as following : H$_2$O/CH$_3$CN ratios were 82/18, 70/30, 55/45 and 50/50, respectively. Sol-vent flow rate was 1.00 ma/min. Column temperature was kept to 35$^{\circ}$C. UV detector was set to 203 nm.
This study was conducted to analyze not only for the quality guaranteed of red ginseng but also for the minor ginsenosides. Although several studies have reported to analyze ginseng saponins, those were focused to major saponins, including 6 to 7 ginsenosides. As increase of interest in medicinal effect of ginseng products, anasis of various ginsenosides in both red and white ginseng are strongly demanded. To perform optital condition of 12 ginsenoside analysis, We controlled HPLC conditions, such as the gradient elution of the mobile phase. We found the adequate separation method for 12 ginse-nosides. The optimum condition was as following : H$_2$O/CH$_3$CN ratios were 82/18, 70/30, 55/45 and 50/50, respectively. Sol-vent flow rate was 1.00 ma/min. Column temperature was kept to 35$^{\circ}$C. UV detector was set to 203 nm.
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문제 정의
그래서 program time을 25분 더 늘렸던 결과, 얻어진 크로마토그램 e의 조건에서는 모든 피크를 분리할 수 있었다. 그러나 Rc의 Area가 안정적이지 않아서 전체의 시간을 동일하게 하고 CH3CN의 비율을 천천히 증가시켜 본 바, 모든 피크.가 완전히 분리되는 크로마토그램 f의 조건을 얻을 수 있게 되었다.
현재의 성분 분석 실태는 인삼뿐만 아니라 홍삼까지도 분석이 용이하고 주로 수삼에서 확인할 수 있는 주요 사포닌만 측정되고 있는 실정이며, 미량 사포닌 등을 포함한 다양한 ginsenosides에 대한 분석 방법의 연구는 아직까지 미흡하며 특히, 미량 사포닌은 주요사포닌에 비해 Retention time (RT)이 늦거나, 주요 사포닌과 Peak 겹침이 심하여 분리하기가 용이하지 않은 어려움이 있다. 따라서, 본 연구에서는 HPLCC의 역상 칼럼을 사용하여 이동상 용매를 다양하게 gradient elution의 변화를 주어, 주요 사포닌과 분리가 용이하지 않은 미량 사포닌의 최적 분리 조건과 Rbb Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rgi, Rg2, Rg3, Rhi, Rh?의 12종의 ginsenosides를 완전하게 분리하여 정확한 Area 를 얻음으로써 정량분석 방법을 최적화하고자 실시하였다.
제안 방법
HPLC의 Columiie ZORBAX Eclipse XDB- C18 (4.6 x 150 mm, 5-Micron)을 사용하였고 실험에서 기기의 조건은 peak의 분리를 위해 pump program에서 gradient를 준 것과 Detector time의 변화를 준 것 외에는 모두 동일한 조건에서 실험을 하였다 (Table 1).
희석하여 만든 용액들을 주입하면서 크로마토그램을 얻고 Peak area와 Injection volume으로 검량선을 만들었다. 각 사포닌의 비슷한 RT 때문에 생기는 peak의 겹침을 해결하기 위하여 이동상 용매의 조성 시간과 비율을 Table 2에서 보는 바와 같이 바꾸어 가면서 12종의 사포닌을 분리할 수 있도록 하였다. 분리 후, 재현성 검증을 위하여 홍삼 시료 분말 1 g에 70%의 메탄올 수용액 10 ul를 가하여 80℃ 항온 수조에서 환류 냉각시키는 방법으로 3회 추출하고, 추출액을 합하여 여과하고 추출액을 감압 건조하여 10ml의 증류수를 더하고, 여기에 같은 양의 diethyl ether를 가하여 분액법으로 지용성 성분을 제거 한 후에, 수포화 n-buthanol 추출 방법으로 사포닌 성분을 3회 추출하여 감압 농축하였다.
현재의 성분 분석 실태는 인삼뿐만 아니라 홍삼까지도 분석이 용이하고 주로 수삼에서 확인할 수 있는 주요 사포닌만 측정되고 있는 실정이며, 미량 사포닌 등을 포함한 다양한 ginsenosides에 대한 분석 방법의 연구는 아직까지 미흡하며 특히, 미량 사포닌은 주요사포닌에 비해 Retention time (RT)이 늦거나, 주요 사포닌과 Peak 겹침이 심하여 분리하기가 용이하지 않은 어려움이 있다. 따라서, 본 연구에서는 HPLCC의 역상 칼럼을 사용하여 이동상 용매를 다양하게 gradient elution의 변화를 주어, 주요 사포닌과 분리가 용이하지 않은 미량 사포닌의 최적 분리 조건과 Rbb Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rgi, Rg2, Rg3, Rhi, Rh?의 12종의 ginsenosides를 완전하게 분리하여 정확한 Area 를 얻음으로써 정량분석 방법을 최적화하고자 실시하였다.
각 사포닌의 비슷한 RT 때문에 생기는 peak의 겹침을 해결하기 위하여 이동상 용매의 조성 시간과 비율을 Table 2에서 보는 바와 같이 바꾸어 가면서 12종의 사포닌을 분리할 수 있도록 하였다. 분리 후, 재현성 검증을 위하여 홍삼 시료 분말 1 g에 70%의 메탄올 수용액 10 ul를 가하여 80℃ 항온 수조에서 환류 냉각시키는 방법으로 3회 추출하고, 추출액을 합하여 여과하고 추출액을 감압 건조하여 10ml의 증류수를 더하고, 여기에 같은 양의 diethyl ether를 가하여 분액법으로 지용성 성분을 제거 한 후에, 수포화 n-buthanol 추출 방법으로 사포닌 성분을 3회 추출하여 감압 농축하였다. methanol 2 를 가하여 용해시킨 후 0.
이렇게 조제된 용액을 5배, 10배로 희석하여 총 3개의 vial을 만들어 Autosampler로 용액들을 10 ul 씩을 주입하여 이동상 조성을 pump program에서 변화시키면서 용리시켰다. 희석하여 만든 용액들을 주입하면서 크로마토그램을 얻고 Peak area와 Injection volume으로 검량선을 만들었다. 각 사포닌의 비슷한 RT 때문에 생기는 peak의 겹침을 해결하기 위하여 이동상 용매의 조성 시간과 비율을 Table 2에서 보는 바와 같이 바꾸어 가면서 12종의 사포닌을 분리할 수 있도록 하였다.
대상 데이터
HQ와 CH3CN, CH3OH 모두 SK Chemical의 Burdick & Jackson 제품을 사용하였으며, HR와 CH3CN는 혼합하지 않고 이동상으로 사용하였다. 그리고 HPLC 분석에 사용된 표준품은 시중에서 판매하는 Sigma-Aldrich (St.
HQ와 CH3CN, CH3OH 모두 SK Chemical의 Burdick & Jackson 제품을 사용하였으며, HR와 CH3CN는 혼합하지 않고 이동상으로 사용하였다. 그리고 HPLC 분석에 사용된 표준품은 시중에서 판매하는 Sigma-Aldrich (St. Louis USA)와 EXTRASYNTHESE (France)의 제품을 사용하였다.
본 실험에서 사용한 고속 액체크로마토그래피 (HPLC)는 Perkin elmer series 200 Pump, Peltier column oven, UV/ VIS Detector, Wcuum Degasser, 그리고 Series 600 LINK 를 연결하여 사용하였으며, Series 200 Autosampler로 시료를 주입하였다. HPLC의 Columiie ZORBAX Eclipse XDB- C18 (4.
실험에 사용한 사포닌의 표준품은 Sigma와 EXTRASY NTHESE에서 생산된 ginsenoside (Rbi, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rgi, Rg2, Rg3, Rhb Rh2) 총 12종으로 이들 표준품을 각 5mg씩 Balanced. 정밀하게 정량하여, 메탄올 1 ml에용해시켜 표준용액을 조제하였다.
실험에 이용된 모든 시약은 HPLC Grade 용매를 사용하였다. HQ와 CH3CN, CH3OH 모두 SK Chemical의 Burdick & Jackson 제품을 사용하였으며, HR와 CH3CN는 혼합하지 않고 이동상으로 사용하였다.
성능/효과
12종의 모든 사포닌 표준품에서 농도와 피크면적간에는 모두고도로 유의성이 인정되는 1차회귀식으로 나타났고 Rh2가 가장 넓은 면적을 차지하고 있었으며 Rd가 가장 좁게 나타나는 경향을 보였다. 12종의 사포닌 표준품은 농도가 증가함에 따라 피크의 면적도 증가하는 경향을 보였는데, 그 크기는 Rh2, Rg2, Rhb Rg3, Rf, Rb2, Re, Rb3, Rgb Rc, Rbi 및 Rd 의 순이었다.
경향을 보였다. 12종의 사포닌 표준품은 농도가 증가함에 따라 피크의 면적도 증가하는 경향을 보였는데, 그 크기는 Rh2, Rg2, Rhb Rg3, Rf, Rb2, Re, Rb3, Rgb Rc, Rbi 및 Rd 의 순이었다.
Rg2, . Rc, Rb2, 10은 아주 비슷한 RT를 가지고 있어서 Peak의 겹침이 심하였으나, 극성이 약한 CRCN의 비율을 천천히 높이게 하여 이들의 분리에 성공하였으며, 안정적인 Peak area를 얻을 수 있었다. 또한 Rh?의 Peak 검출이 어려워 Step 3, 4에서는 그전 단계보다 CH3CN 의 비율을 대폭적으로 크게 하였던 바, Rh?를 찾을 수 있었다.
인삼 ginsenoside의 분석은 많이 시도되어 왔으나 주요 사포닌 및 미량 사포닌의 분석법이 정립되지 않고 있는 실정인바, 본 연구에서는 이동상 용매의 기울기 용리를 다양하게 변 5K 주어 Rbi, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf; Rg, , Rg2, Rg3, Rhb Rh2의 총 12종의 사포닌을 양호하게 분리하는데 성공하였다. 이동상의 흐름 속도는 1.00ml/min이고 column 온도는 35 ℃, UV detector의 파장은 203 nm로 모두 일정하게 한 결과였으며, 최적의 분석조건은 H2O와 CHKN의 용매 조성이 82/ 18, 70/30, 55/45, 50/50로 각각의 ginsenosides의 안정적인 Area 값을 얻을 수 있었고 재현성을 시도해본 결과, 반복 간편 차가 적어 재현성이 매우 양호한 것으로 나타났다.
이상의 12종의 사포닌 피크의 최적화 분리는 f조건으로가 초기에는H2O과 CRCN의 비율이 82/18에서 점차 50/50 비율의 용매 조건이 되도록 용리시키면서 크로마토그램을 얻었고 이때 Rg과 Re는 RT가 거의 일치하여 80/20 (H2O/CH3CN) 의 조건에서도 분리되지 않아서 82/18에서만 비로소 완전하게 분리가 되었다. Rbi, Rh.
같다. 인삼 ginsenoside의 분석은 많이 시도되어 왔으나 주요 사포닌 및 미량 사포닌의 분석법이 정립되지 않고 있는 실정인바, 본 연구에서는 이동상 용매의 기울기 용리를 다양하게 변 5K 주어 Rbi, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf; Rg, , Rg2, Rg3, Rhb Rh2의 총 12종의 사포닌을 양호하게 분리하는데 성공하였다. 이동상의 흐름 속도는 1.
4에 나타난 바와 같다. 표에서 보는 바와 같이 5회 분석해 본 결과, 반복간의 표준편차가 0.01 이하로 매우 차이가 적은 것으로 나타났으며 사포닌 총량에서도 표준편차가 적어 재현성이 매우 양호한 것으로 나타나, 12종의 gisenoside 분석 시 가장 적합한 분석방법이라고 사료된다.
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