[논문]2배체 대장균의 제조와 그 특성

정혜임; 임동빈

doi:10.7845/kjm.2016.6070

2배체 대장균의 제조와 그 특성
Construction and characterization of heterozygous diploid Escherichia coli 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.52 no.4, 2016년, pp.406 - 414

정혜임 (숭실대학교 의생명시스템학부) , 임동빈 (숭실대학교 의생명시스템학부)

초록
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대장균에서 6개의 Leu 코돈중 가장 흔한 코돈은 CUG이다. 이 코돈을 인식하는 tRNA는 4개의 유전자에 의해 합성되는데, leuPQV와 leuT 2개의 locus로 나누어져 있다. 이 CUG를 인식하는 모든 tRNA가 결핍된 균주를 만들기 위해, 우선 leuPQV가 삭제된 균주(${\Delta}leuPQV$)와, leuT의 anticodon CAG를 GAG로 돌연변이시킨 균주[$Km^R$, $leuT^*$(GAG)]를 각각 만들었다. 이 두 돌연변이 유전자를 모으기 위해 ${\Delta}leuPQV$ 균주를 recipient로, $leuT^*$(GAG) 균주를 donor로하는 transduction을 수행한 결과, 콜로니 크기가 큰 것과 작은 것 두 종류의 transductant를 얻었다. PCR 후 염기서열 분석 결과 큰 콜로니는 예측한 recombinant로 판명됐으나, 작은 콜로니는 donor와 recipient 염색체 간의 상호교환재조합(reciprocal recombination)으로는 설명이 되지 않는, 돌연변이 유전자[$leuT^*$(GAG)]와 야생형 유전자(leuT(CAG)]를 모두 가진 균주로 밝혀졌다. 이 heterozygous diploid는 광학현미경으로 관찰시 세포의 형태와 크기에서 특이점이 발견되지 않았으나, 영양배지에서 야생형에 비해 생장이 한참 느리면서, 선형생장곡선(linear growth curve)이라는 예측하지 못한 생장특성을 보였다. 이 2배체 균주는 선택배지에서는 항상 작은 균일한 콜로니를 형성하였으나, 배지에 선택항생제 없을 경우, $leuT^*$(GAG) 유전자형 세포와 leuT(CAG) 유전자형 세포로 분리가 일어났다. 우리의 결과를 종합해볼 때, 이 2배체 균주는, $leuT^*$(GAG)와 leuT(CAG) 부분만 2배체로 갖는 부분이배체(merodiploid)라기 보다는, $leuT^*$(GAG)와 leuT(CAG)가 서로 다른 염색체에 있는 완전이배체라는 모델을 지지했다. 우리는 이러한 2배체가 어떻게 생성되었으며, 어떻게 분리되는지, 또 이 균주는 왜 선형생장곡선을 보이는지 등에 대한 모델을 토론하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Among 6 leu codons, CUG is the most frequently used codon in E. coli. It is recognized by leu-tRNA(CAG) encoded by four genes scattered on two chromosomal loci (leuT and leuPQV ). In the process of constructing a strain with no functional leu-tRNA (CAG) gene on chromosome, we made two mutant strains separately, one on leuPQV locus (${\Delta}leuPQV$), and the other on leuT locus [$leuT^*$(GAG)], where the anticodon of leuT was changed from CAG to GAG, thereby altering its recognition codon from CUG to CUC. We attempted to combine these two mutations by transduction using $leuT^*$(GAG) strain as a donor and ${\Delta}leuPQV$ strain as a recipient. Large and small colonies appeared from this transduction. From PCR and DNA sequencing, large colony was confirmed to be the reciprocal recombinant as expected, but the small colonies contained both mutant $leuT^*$(GAG) and wild type leuT (CAG) genes in the cell. This heterozygous diploid strain did not show any unusual morphology under microscopic observation, but, interestingly, it showed a linear growth curve in rich medium with much slower growth rate than wild type cell. It always formed homogenous small colonies in the selection medium, but, when there was no selection, it readily segregated into $leuT^*$(GAG) and leuT (CAG). From these observations, we suggested that the strain with both $leuT^*$(GAG) and leuT (CAG) genes was not a partial diploid (merodiploid), but a full diploid cell having two different chromosomes. We proposed a model explaining how such a heterozygous diploid cell was formed and how and why its growth showed a linear growth curve.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

leuQPV가 삭제된 균주와 leuT 대응코돈 CAG가 GAG로 치환된 균주를 합쳐서 tRNA^leu(CAG) 공급이 모두 차단된 균주를 제조하고자 하였다. 이를 위해 CAG 대응코돈에 점 돌연변이가 일어난 SSU305K 균주(Km 저항성)를 공여자(donor)로, leuQPV가 제거된 SSU503를 수혜자(recipient)로 사용하여 P1 transduction을 시도하였다.
이러한 연구의 일환으로 P1 transduction을 하였는데, 이 때 서로 다른 2개의 염색체를 보유한 2배체(heterozygous diploid) 대장균 균주를 발견하였다. 우리는 본 논문을 통해 이러한 2배체 균주의 제조 과정과 생리적 특징을 보고하고자 한다.
우리의 결과를 종합해볼때, 이 2배체 균주는, leuT*(GAG)와 leuT(CAG) 부분만 2배체로 갖는 부분이배체(merodiploid)라기 보다는, leuT*(GAG)와 leuT(CAG)가 서로 다른 염색체에 있는 완전이배체라는 모델을 지지했다. 우리는 이러한 2배체가 어떻게 생성되었으며, 어떻게 분리되는지, 또 이 균주는 왜 선형생장곡선을 보이는지 등에 대한 모델을 토론하였다.
어쩌면 두 생명체 사이에서의 접힘동력학의 차이가 대장균을 이용한 인간 단백질 생산시 종종 부닥치는 접힘문제의 한 원인이 될 수도 있을 것이다. 이러한 관점에서 우리는 단백질 합성에 관여하는 tRNA의 양을 최소로 제한할 경우, 단백질 합성과 접힘에 어떤 변화가 일어나며, 이런 변화가 대장균의 생리 및 생장에 어떤 영향을 끼치는지 알아보는 연구를 진행하고 있다.

제안 방법

05를 시작(0시간)으로 1시간 이후부터 20분 간격으로 13시간까지 OD₆₀₀의 값을 측정하여 기록하였다. 2배체 균주의 세포 모양 및 크기 관찰을 위하여 그람 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
5. Growth curves of parent SSU500K and diploid SSU308K, and their microscopic observations. For microscopic observations, samples were taken at 5 h after inoculation.
이렇게 제작된 PCR 조각을 SSU500K strain에 형질 전환시키면 phage λ Red recombinase에 의해 recombination을 시도했다(Datsenko and Wanner, 2000). Km 저항성을 띈 균주를 선별한 후 Km^R 유전자는 Km^R 유전자의 양 끝에 존재하는 FRT 서열을 인식할 수있는 FLP recombinase를 통해 제거하였다. 이렇게 제조된 균주는 Fig.
이 조각을 제한효소 Not 자리를 이용하여 leuT*(GUG) 조각과 yifK-Km 조각을 연결하여 yifKKm-argX-hisR-leuT*-proM를 만든 후, lambda Red system을 이용하여 이 조각을 chromosome에 삽입하였다. Km 접시에 나온 콜로니를 PCR한 후 DNA sequencing하여 leuT*(GAG)여부를 확인하였다.
유전자 변형 실험에 사용한 올리고 서열은 Table 2에 제시하였다. LeuQPV의 삭제는 올리고 LeuPQVDelFor와 LeuPQVDelRev를 primer로, pKD4를 template로 사용하여 PCR한 후 이 PCR 조각을 E. coli BW25113 (pKD46)에 transformation하여 Km 저항성 콜로니를 얻은 후 PCR 후 sequencing으로 확인하였다. leuT*(GUG) 균주의 제조는 먼저 leuT의 anticodon CUG를 GUG로 바꾸었다.
2~3방울의 클로로포름 첨가하여 잘 섞은 후, 5,000 rpm로 5분간 원심분리하여 상등액을 모아 phage lysate를 만들었다. Recipient 균주를 5 mM CaCl₂와 0.2% 포도당이 첨가된 LB 액체배지에 OD₆₀₀이 0.8~1.0 될 때까지 진탕배양한 후, 5,000 rpm에서 5분 원심분리하여 세포를 모았다. 이 세포를 5 mM CaCl₂와 100 mM MgSO₄ 첨가된, 배양액 부피의 1/4 정도의 LB 액체배지에 녹 였다.
SSU308K 균주의 유전형을 알기 위해 LeuQPV와 leuT 유전자 부위를 증폭한 후 DNA 서열 분석을 하였다. Figure 4A는 leuQPV 부위, 4B는 leuT 부위를 분석한 결과이다.
1 위). 다음에 yifK와 argX 유전자 사이에 Km^R DNA를 넣어 yifK- Km-argX를 만든 후, 이 둘을 연결하여 yifK-Km-argX-hisRleuT*(GAG)-proM DNA 조각을 제조하였다(Fig. 1 아래). 이 조각을 Red recombinase를 이용하여 BW25113 균주의 염색체에 삽입하였다.
다음으로 LeuT 대응코돈 CAG의 치환 여부를 확인하기 위해 leuT 부위를 증폭하였다(Fig. 4B). ArgX-hisR-leuT-proM locus가 야생형인 모균주 SSU500와 받는균주 SSU503 경우둘 다 약1.
LeuT 유전자는 다른 필수 tRNA 유전자(argX, hisR, proM)들과 근접해 있고, 각 tRNA 유전자의 크기는 100 bp 정도로 길이가 매우 짧기 때문에 LeuT 유전자만의 삭제는 간단하지 않았다. 따라서 leuT의 삭제보다는 이 유전자의 대응코돈 CAG 서열 만을 GAG로 변형시키기로 하였다. 우선 대응코돈 CAG 서열 부분을 GAG로 변형된 점돌연변이 primer를 제작한 후 이를 사용하여 leuT 대응코돈 CAG가 GAG로 치환된 argXhisR-leuT*(GAG)-proM유전자 조각을 제조하였다(Fig.
(CAG)] 유전자는 4개가 있는데, 염색체 상에 leuQPV 부위와 leuT 부위 등 두 자리에 위치한다. 우리 실험은 우선 이 두 부위가 각각 삭제된 균주를 만든 후 이 두 균주의 염색체를 합치는 방식으로 진행하였다.
따라서 leuT의 삭제보다는 이 유전자의 대응코돈 CAG 서열 만을 GAG로 변형시키기로 하였다. 우선 대응코돈 CAG 서열 부분을 GAG로 변형된 점돌연변이 primer를 제작한 후 이를 사용하여 leuT 대응코돈 CAG가 GAG로 치환된 argXhisR-leuT*(GAG)-proM유전자 조각을 제조하였다(Fig. 1 위). 다음에 yifK와 argX 유전자 사이에 Km^R DNA를 넣어 yifK- Km-argX를 만든 후, 이 둘을 연결하여 yifK-Km-argX-hisRleuT*(GAG)-proM DNA 조각을 제조하였다(Fig.
leuT*(GUG) 균주는 세 과정으로 제조하였다. 우선 올리고 LeuTGAG1202와 argXIntRev를 사용하여 PCR하고, 다음에 LeuTGAG1203과 argXUP1202로 PCR한 후, 이 둘을 올리고 argXUP1202와 argXIntRev로 PCR하여 두 조각을 연결하였다. 이렇게 하면 leuT의 CUG가 GUG로 바뀐 DNA 조각을 얻을 수 있다.
이 CUG를 인식하는 tRNA가 결핍된 균주를 만들기 위해, 우선 leuPQV가 삭제된 균주(ΔleuPQV)와, leuT의 anticodon이 돌연변이 된 균주[KmR, leuT*(GAG)]를 각각 만들었다.
이 CUG를 인식하는 모든 tRNA가 결핍된 균주를 만들기 위해, 우선 leuPQV가 삭제된 균주(ΔleuPQV)와, leuT의 anticodon CAG를 GAG로 돌연변이시킨 균주[KmR, leuT*(GAG)]를 각각 만들었다.
PCR 조각의 크기 및 이 DNA 조각의 서열분석으로 SSU308K 균주의 leuT 부위가 2배체임을 확인할 수 있었으나, 이 부위 만을 중복으로 가지고 있는 부분적 2배체인지, 아니면 염색체 전체가 중복돼 있는 2배체인지는 알 수 없다. 이 균주의 특성을 알아보기 위해 생장 곡선을 그리고, 현미경 관찰도 수행하였다(Fig. 5).
이 두 돌연변이 유전자를 모으기 위해 ΔleuPQV균주를 recipient로, leuT*(GAG) 균주를 donor로 하는 transduction을 수행하였는데, 이 실험 중에 돌연변이 유전자[leuT*(GAG)]와 야생형 유전자[leuT(CAG)]를 모두 가진 diploid 균주를 얻었다.
이 세포를 100 mM NaCitrate이 들어있는 100 μl LB에 녹인 후 20 μg/ml의 Km이 들어있는 배지에 깔아 37℃에서 14시간 배양한 후 관찰하였다.
염색체상의 유전자를 제거한(knock-out) 균주는 Datsenko와 Wanner(2000)의 방법을 이용하였다. 이때 선별 표지로 사용한 Km 저항성 유전자는 필요에 따라 Km^R 유전자 양 옆에 존재하는 FRT 인식 염기 서열(FLP recognition target)과 FLP recombinase를 이용하여 제거하였다. 플라스미드 pSC101 origin을 가지며 chloramphenicol (이하 Cm) 저항성 유전자를 갖는 pSU106 플라스미드 선별을 위해 배양온도 30℃에서 25 μg/ml의 Cm을 사용하였다.
우리는 이 CUG를 인식하는 leucine tRNA [tRNA^leu(CAG)] 유전자 하나를 plasmid에 삽입한 후, 염색체상에 있는 모든 tRNA^leu(CAG)를 삭제한 균주를 만들고, tRNA^leu(CAG)의 양을 조절하면서 단백질 합성을 관찰하는 연구를 진행하고 있다. 이러한 연구의 일환으로 P1 transduction을 하였는데, 이 때 서로 다른 2개의 염색체를 보유한 2배체(heterozygous diploid) 대장균 균주를 발견하였다. 우리는 본 논문을 통해 이러한 2배체 균주의 제조 과정과 생리적 특징을 보고하고자 한다.
(CAG) 공급이 모두 차단된 균주를 제조하고자 하였다. 이를 위해 CAG 대응코돈에 점 돌연변이가 일어난 SSU305K 균주(Km 저항성)를 공여자(donor)로, leuQPV가 제거된 SSU503를 수혜자(recipient)로 사용하여 P1 transduction을 시도하였다. 수혜자 균주에는 가외적 tRNA^leu(CAG) 공급할 수 있는 pSU106 (CmR) 플라스미드를 포함하고 있어 재조합체가 tRNA^leu(CAG)가 없어 죽는 것을 방지하였다.
이배체 균주의 생장곡선을 그리기 위하여 25 μg/ml의 Km이 첨가된 배양 접시에서 자란 단일 콜로니를 선택하였다.
3A). 크거나 작은 콜로니들이 실제로 Km 저항성을 갖고 있는지를 확인하고자, 소 콜로니와 대 콜로니를 항생제(Km)를 포함한 고체배지와 항생제를 포함하지 않은 고체배지에 배양해 보았다. 그 결과 소 콜로니(SSU308K로 명명)와 대 콜로니(SSU309K) 모두 Km 접시에서 잘 자랐으나, 작은 콜로니는 항상 작은 콜로니를 큰 콜로니는 항상 큰 콜로니를 형성하여 표현형이 안정적으로 유지됨을 확인하였다(Fig.

대상 데이터

Figure 4, lane 6에 사용된 SSU306K는 우리가 원래 제작하고자 했던 ΔleuQPV와 KmR-LeuT*(GAG) 유전자형을 갖는 균주로, PCR 대조군으로 사용하였다.
leuT*(GUG) 균주의 제조는 먼저 leuT의 anticodon CUG를 GUG로 바꾸었다. leuT*(GUG) 균주는 세 과정으로 제조하였다. 우선 올리고 LeuTGAG1202와 argXIntRev를 사용하여 PCR하고, 다음에 LeuTGAG1203과 argXUP1202로 PCR한 후, 이 둘을 올리고 argXUP1202와 argXIntRev로 PCR하여 두 조각을 연결하였다.
실험에 사용한 모 균주는 E. coli BW25113이며, 본 실험에서 변형시킨 파생 균주들은 Table 1에 제시되어 있다. 염색체상의 유전자를 제거한(knock-out) 균주는 Datsenko와 Wanner(2000)의 방법을 이용하였다.
플라스미드 pSC101 origin을 가지며 chloramphenicol (이하 Cm) 저항성 유전자를 갖는 pSU106 플라스미드 선별을 위해 배양온도 30℃에서 25 μg/ml의 Cm을 사용하였다.

이론/모형

LeuQPV 부위는 Datsenko 등의 방식으로 제거하였다(Datsenko and Wanner, 2000). LeuQPV를 제거하기 위해 제작한 PCR 조각은 양 끝이 leuQ 또는 leuV 유전자와 약 50 bp homologous sequence를 가지고 있으며, PCR 조각 중심에는 pKD4 플라스미드에서 유래된 FRT (FLP recognition target) 서열로 둘러 쌓인 Km 저항성 유전자가 위치하고 있다.
coli BW25113이며, 본 실험에서 변형시킨 파생 균주들은 Table 1에 제시되어 있다. 염색체상의 유전자를 제거한(knock-out) 균주는 Datsenko와 Wanner(2000)의 방법을 이용하였다. 이때 선별 표지로 사용한 Km 저항성 유전자는 필요에 따라 Km^R 유전자 양 옆에 존재하는 FRT 인식 염기 서열(FLP recognition target)과 FLP recombinase를 이용하여 제거하였다.

성능/효과

이 조각을 Red recombinase를 이용하여 BW25113 균주의 염색체에 삽입하였다. Km 저항성인 두 콜로니를 선택하여 PCR 후 sequencing을 통해 leuT의 CAG 대응코돈 서열이 GAG 서열로 치환되었는지를 알아 보았는데, 모두 leuT의 CAG가 GAG 로 치환된 Fig. 2의 세번째 구조를 가짐을 확인하였다. 이렇게 leuT의 anticodon CAG가 GAG로 변이되어 tRNA^leu(CAG)를 공급하지 못하는 균주를 SSU305K라 명명하였다.
이 두 돌연변이 유전자를 모으기 위해 ΔleuPQV 균주를 recipient로, leuT*(GAG) 균주를 donor로하는 transduction을 수행한 결과, 콜로니 크기가 큰 것과 작은 것 두 종류의 transductant를 얻었다. PCR 후 염기서열 분석 결과 큰 콜로니는 예측한 recombinant로 판명됐으나, 작은 콜로니는 donor와 recipient 염색체 간의 상호교환재조합(reciprocal recombination)으로는 설명이 되지 않는, 돌연변이 유전자[leuT*(GAG)]와 야생형 유전자(leuT(CAG)]를 모두 가진 균주로 밝혀졌다. 이 heterozygous diploid는 광학현미경으로 관찰시 세포의 형태와 크기에서 특이점이 발견되지 않았으나, 영양배지에서 야생형에 비해 생장이 한참 느리면서, 선형생장곡선(linear growth curve)이라는 예측하지 못한 생장특성을 보였다.
3B). 고체 LB 배지에서 형성된 크고 작은 균주를 각각 SSU308KL, SSU308KS로 명명하고, 이들을 Km 배지와 LB 배지에 재차 스트리킹 한 결과, SSU308KL 균주는 Km 배지에서는 자라지 못하고, LB 배지에서만 성장하였다. 반면, SSU308KS 균주는 Km 배지와 LB 배지에서 모두 자랐으나, Km 배지에서는 Fig.
크거나 작은 콜로니들이 실제로 Km 저항성을 갖고 있는지를 확인하고자, 소 콜로니와 대 콜로니를 항생제(Km)를 포함한 고체배지와 항생제를 포함하지 않은 고체배지에 배양해 보았다. 그 결과 소 콜로니(SSU308K로 명명)와 대 콜로니(SSU309K) 모두 Km 접시에서 잘 자랐으나, 작은 콜로니는 항상 작은 콜로니를 큰 콜로니는 항상 큰 콜로니를 형성하여 표현형이 안정적으로 유지됨을 확인하였다(Fig. 3B). 반면에 Km 들어있지 않은 배지에서는 재미있는 결과를 보여주었다.
우선 2배체 균주는 모균주에 비해 생장 속도가 현저하게 늦었다. 또한 모균주가 박테리아의 전형적 생장그래프를 따르는데 반해, 2배체 균주는 개체수가 기하급수적으로 늘어나는 대수기가 관찰되지 않고, 오랜 기간 선형적으로 흡광도가 증가하였다. 이러한 선형적 성장은 이분법에 의한 증식으로는 설명하기 힘든 성장 패턴이다.
이를 위해 CAG 대응코돈에 점 돌연변이가 일어난 SSU305K 균주(Km 저항성)를 공여자(donor)로, leuQPV가 제거된 SSU503를 수혜자(recipient)로 사용하여 P1 transduction을 시도하였다. 수혜자 균주에는 가외적 tRNA^leu(CAG) 공급할 수 있는 pSU106 (CmR) 플라스미드를 포함하고 있어 재조합체가 tRNA^leu(CAG)가 없어 죽는 것을 방지하였다.
이 2배체 균주는 선택배지에서는 항상 작은 균일한 콜로니를 형성하였으나, 배지에 선택항생제 없을 경우, leuT*(GAG) 유전자형 세포와 leuT(CAG) 유전자형 세포로 분리가 일어났다. 우리의 결과를 종합해볼때, 이 2배체 균주는, leuT*(GAG)와 leuT(CAG) 부분만 2배체로 갖는 부분이배체(merodiploid)라기 보다는, leuT*(GAG)와 leuT(CAG)가 서로 다른 염색체에 있는 완전이배체라는 모델을 지지했다. 우리는 이러한 2배체가 어떻게 생성되었으며, 어떻게 분리되는지, 또 이 균주는 왜 선형생장곡선을 보이는지 등에 대한 모델을 토론하였다.
PCR 후 염기서열 분석 결과 큰 콜로니는 예측한 recombinant로 판명됐으나, 작은 콜로니는 donor와 recipient 염색체 간의 상호교환재조합(reciprocal recombination)으로는 설명이 되지 않는, 돌연변이 유전자[leuT*(GAG)]와 야생형 유전자(leuT(CAG)]를 모두 가진 균주로 밝혀졌다. 이 heterozygous diploid는 광학현미경으로 관찰시 세포의 형태와 크기에서 특이점이 발견되지 않았으나, 영양배지에서 야생형에 비해 생장이 한참 느리면서, 선형생장곡선(linear growth curve)이라는 예측하지 못한 생장특성을 보였다. 이 2배체 균주는 선택배지에서는 항상 작은 균일한 콜로니를 형성하였으나, 배지에 선택항생제 없을 경우, leuT*(GAG) 유전자형 세포와 leuT(CAG) 유전자형 세포로 분리가 일어났다.
이 두 돌연변이 유전자를 모으기 위해 ΔleuPQV 균주를 recipient로, leuT*(GAG) 균주를 donor로하는 transduction을 수행한 결과, 콜로니 크기가 큰 것과 작은 것 두 종류의 transductant를 얻었다.
또한 Zelle 등은 대장균이 방사성 쪼임에 대한 저항성(radiation-resistance) 정도를 비교하여, 대장균이 조건에 따라 polyploid를 형성하며, polyploid는 보통 대장균에 비해 세포 크기가 훨씬크다고 보고하였다(Zelle and Ogg, 1957). 이러한 육칠십년 전의 연구는 다배체 존재를 DNA 혹은 RNA의 상대적인 양, 방사성에 대한 저항성 등으로 부터 시료내의 대장균이 2배체 혹은 다배체일 것이라 유추한 결론이었다. 따라서 이들의 결과와 본 실험의 결과를 직접 비교하기는 힘들지만, 세균도 다배체를 형성할 수 있다는 가능성은 오래 전부터 제기돼 왔음을 알 수 있다.
Km 저항성을 띈 균주를 선별한 후 Km^R 유전자는 Km^R 유전자의 양 끝에 존재하는 FRT 서열을 인식할 수있는 FLP recombinase를 통해 제거하였다. 이렇게 제조된 균주는 Fig. 2의 두 번째 구조와 같이 leuQPV가 모두 제거된 구조임을 PCR과 DNA 서열 분석을 통해 확인하고(Fig. 5A: lane 3), 이를 SSU503이라 명명하였다.
3B처럼작은 콜로니를, LB 배지에서는 또 다시 크고 작은 콜로니를 형성하였다. 즉 SSU308KS는 모균주 SSU308K와 같은 표현형을 보였으나, SSU308KL은 Km 저항성을 잃은 것이었다.
3B: lane 4). 증폭된 2조각을 각각 분리 정제한 후, DNA 서열 분석을 해보니, 3 kb 조각은 Km-argX-hisR-leuT*(GAG)-proM였고, 1.5 kb 조각은 야생형 그대로 argX-hisR-leuT(CAG)-proM임을 알게 되었다. 이는 SSU308K 균주가 leuT 부위를 두 개[야생형 leuT와 Km^R -LeuT*(GAG) 형] 모두 가지고 있는 2배체임을 보여준다.

후속연구

왜 diploid cell [II]에서 이러한 recombination이 관찰 되지 않는지는 향후 더 연구해볼 필요가 있다. 또한 2배체세포의 두 염색체가 분리되지 않고 복제하는 이유와 기작, 세균에서 서로 다른 염색체의 segregation 등도 향후 밝혀야 할 과제이다.
그런데 이상하게도 transduction에서는 recombinant 세포 [III]를 쉽게 얻을 수 있었으나, 세포 [II]를 길러서는 세포 [III]을 얻을 수 없었다. 왜 diploid cell [II]에서 이러한 recombination이 관찰 되지 않는지는 향후 더 연구해볼 필요가 있다. 또한 2배체세포의 두 염색체가 분리되지 않고 복제하는 이유와 기작, 세균에서 서로 다른 염색체의 segregation 등도 향후 밝혀야 할 과제이다.
이 SSU306K는 염색체 상의 leu-tRNA(CAG) 유전자가 모두 없어진 균주로, 플라스미드 pSU106에 있는 arabinose promoter에 의하여 조절 받는 leuPV에 의하여 leu-tRNA(CAG)가 공급받는다. 이 균주를 이용한, tRNA 제한 공급하에서의 단백질 합성 특성에 대해서는 독립된 논문으로 발표할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	숨은돌연변이에 의한 유전자 변이에서 기능을 잃은 단백질 생성까지 어떤 과정을 통해 진행되는가?	그러나 최근에 이런 숨은돌연변이(silent mutation)에 의해 일어나는 유전질환들이 발견되었고, 이에 따라 아미노산의 서열을 변화시키지 않는 유전자 변이도 단백질의 기능을 잃게 만들 수도 있음을 알게 되었다(Zuben and Kimchi-Sarfaty, 2011). 예를 들어 어떤 코돈이 다른 동의코돈으로 바뀌게 되면 원래의 코돈과 돌연변이 코돈에 대응하는 tRNA의 세포 내 농도가 각기 다르기 때문에 mRNA의 번역속도가 달라지게 된다. 이에 따라 단백질 접힘동력학(folding kinetics)에 변화가 일어나게 되고, 단백질의 접힘(folding)이 잘못 일어나 기능을 잃은 단백질이 생성될 수 있는 것이다(Shabalina et al., 2013).
	CUG를 인식하는 tRNA는 몇개의 유전자에 의해 합성되며 무엇으로 나누어져 있는가?	대장균에서 6개의 Leu 코돈중 가장 흔한 코돈은 CUG이다. 이 코돈을 인식하는 tRNA는 4개의 유전자에 의해 합성되는데, leuPQV와 leuT 2개의 locus로 나누어져 있다. 이 CUG를 인식하는 모든 tRNA가 결핍된 균주를 만들기 위해, 우선 leuPQV가 삭제된 균주(${\Delta}leuPQV$)와, leuT의 anticodon CAG를 GAG로 돌연변이시킨 균주[$Km^R$, $leuT^*$(GAG)]를 각각 만들었다.
	인간 유전자를 대장균이 번역할 경우 문제가 발생할 수 있는 이유는 무엇인가?	번역속도와 단백질 접힘이 함께진화(co-evolution)하여 각각의 생명체에 최적화돼 있다면, 한 생명체의 유전자를 다른 생명체에서 번역할 경우, 단백질의 접힘이 잘못 일어날 수도 있을 것이다. 예를 들어 대장균 리보좀의 mRNA 번역속도는 인간의 그것에 비해 10배 정도 빠르며, 각종 tRNA의 상대적 농도에서도 두 생명체 사이에 차이를 보이기 때문에, 인간 유전자를 대장균이 번역할 경우 단백질의 합성 속도와 접힘동력학(folding kinetics)의 차이로 인해 문제가 발생할 수 있다(Quax et al., 2015).

참고문헌 (11)

Breuert, S., Allers, T., Spohn, G., and Soppa, J. 2006. Regulated polyploidy in halophilic archaea. PLoS One http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0000092.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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