[논문]제주도에 서식하는 목본 식물의 잎에서 분리한 미기록 내생균

이봉형; 김동여; 박혁; 어주경; 이향범; 엄안흠

doi:10.4489/kjm.2016.44.4.252

제주도에 서식하는 목본 식물의 잎에서 분리한 미기록 내생균
Identification of Unrecorded Endophytic Fungi Isolated from Leaves of Woody Plants in Jejudo, Korea 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.44 no.4, 2016년, pp.252 - 258

이봉형 (한국교원대학교 생물교육과) , 김동여 (한국교원대학교 생물교육과) , 박혁 (한국교원대학교 생물교육과) , 어주경 (국립생태원 생태연구본부 생태기반연구실) , 이향범 (전남대학교 응용생명공학부) , 엄안흠 (한국교원대학교 생물교육과)

초록
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본 연구는 제주도 사려니숲과 동백동산에서 편백나무(Chamaecyparis obtusa), 삼나무(Cryptomeria japonica), 비자나무(Torreya nucifera), 꽝꽝나무(Ilex crenata), 동백나무(Camellia japonica) 등 5종의 목본 식물의 잎에서 내생균을 분리하고, 형태 및 분자생물학적 특징 통해 동정하였다. 이를 위해 primer인 ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal transcribed spacer (ITS) rDNA영역과 primer LR0R과 LR16을 이용하여 large subunit rDNA 영역을 그리고 primer Bt2a과 Bt2b를 이용하여 ${\beta}$-tubulin 영역의 염기서열을 동시에 분석하였다. 그 결과 Mycosphaerella aleuritidis, Neofusicoccum eucalyptorum, Neofusicoccum parvum, Phyllosticta citrichinensis, Phyllosticta cryptomeriae, Phomopsis cotoneastri, Sphaerulina rhododendricola, Guignardia mangiferae, Lophodermium jiangnanense, Lophodermium minus 등 10종의 미기록 내생균을 동정하였고, 이를 보고하고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, endophytic fungi were isolated from the leaves of five species of woody plants in Jeju, Korea, namely Chamaecyparis obtusa, Cryptomeria japonica, Torreya nucifera, Ilex crenata, and Camellia japonica. The isolated fungal endophytes were identified based on their morphological and molecular characteristics including a sequence analysis of the internal transcribed spacer and 26S regions of rDNA and ${\beta}$-tubulin genes. Ten species of fungal endophytes have not been previously reported in Korea, namely Mycosphaerella aleuritidis, Neofusicoccum eucalyptorum, Neofusicoccum parvum, Phyllosticta citrichinensis, Phyllosticta cryptomeriae, Phomopsis cotoneastri, Sphaerulina rhododendricola, Guignardia mangiferae, Lophodermium jiangnanense, and Lophodermium minus.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 생물 다양성을 확보하기 위한 생물자원으로서 식물에 공생하는 내생균을 발굴하는 것은 시급한 실정이다. 이에 본 연구에서는 제주도에 서식하는 목본식물에서 다양한 내생균을 분리하여 형태적 · 분자적 동정을 통해 확인된 10종의 미기록 내생균을 보고하고자 한다.

제안 방법

순수 분리된 균주는 25^oC 암소에서 7일간 배양하며, 균총의 생장속도, 색, 모양, 고도 등의 형태학적 특징을 관찰하였으며, 이후 슬라이드 배양법을 통해 균사와 포자를 관찰하였다. 분자생물학적 동정을 위하여 DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 균주의 Genomic DNA를 추출하였으며, 이를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. Primer ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal transcribed spacer (ITS) 영역[9]을, primer LR0R과 LR16을 이용하여 ribosomal DNA의 large subunit (LSU) 영역[10]을, 그리고 primer Bt2a과 Bt2b를 이용하여 β-tublin 영역[11]을 증폭하였다.

대상 데이터

제주도 사려니숲(N 33° 25' 23", E 126° 37' 36")에서 편백나무(Chamaecyparis obtuse (Siebold et Zucc.) Endl.), 삼나무(Cryptomeria japonica D. Don), 비자나무(Torreya nucifera Siebold et Zucc.), 꽝꽝나무(Ilex crenata Thunb.)를, 동백동산(N 33° 30' 52", E 126° 43' 07")에서 동백나무(Camellia japonica L.)의 잎을 채집하였다. 병증이 없는 잎을 무작위적으로 선별하여 24시간 내에 Richardson 등[8]의 방법을 이용하여 균을 분리하였다.

이론/모형

5% agarose gel에서 20분간 전기영동하였으며, 예상되는 크기의 band를 추출하여 정제한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). 분석된 염기서열은 NCBI상에서 BLAST를 이용하여 유사도를 확인한 후 각 종들 간의 계통관계 분석을 위해 MEGA6 [12]를 이용하여 neighbor-joining 방법으로 계통수를 완성하였다(Figs. 1~3).

성능/효과

이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 S. rhododendricola KF777187과 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는 S. rhododendricola KF779483과 99% 상동성을 보였다.
5D). 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 G. mangiferae EU273524와 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는 G. mangi- ferae KF955298과 98% 상동성을 보였다.
MEA에서 자란 균총의 중심부에는 흰색의 균사체가 형성된다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 L. jiangnanense GU138714와 99% 상동성을 보였다.
연한 노란색의 균총이 불규칙하게 형성되며, 공중균사가 발달해 있고, PDA 배지에서 배양한 균총은 생장속도가 느리다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 L. minor GU138719와 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는 L. minor HM140570과 98% 상동성을 보였다.
PDA에서 자란 균총의 표면부는 처음에 갈색을 띠고 있었으나, 시간이 지날수록 검은색으로 변하여, 많은 양의 삼출물이 나타났다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 M. aleuritidis KC281386과 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대한 염기서열을 분석한 결과 M. aleuritidis EU167594와 98% 상동성을 보였다.
흰색의 균사가 조밀하게 모여있는 것이 특징이며, 공중균사가 발달했고, 삼출물은 없다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 N. parvum EF638786과 99%상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는N. parvum KT 189496과 94% 상동성을 보였고, β-tublin 영역에 대해서는 N. parvum KR260807과 98% 상동성을 보였다.
Phyllosticta citrichinensis는 다른 Phyllosticta속의 균주보다 긴 장축을 가지고 있는 것이 특징이며[13], 본 연구에서도 12 μm 정도의 장축을 가진 포자가 많이 관찰되었다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 P. citrichinaensis JN791598과 98% 상동성을 보였다.
5B). 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 P. cotoneastri FJ889450과 99% 상동성을 보였으며, β-tublin 영역에 대해서는 P. cotoneastri KC763119와 99% 상동성을 보였다.
균총이 처음 형성될 때에는 연한 노란색을 띠고 있었으나, 시간이 지남에 따라 짙은 회색의 균사로 변하며, 균총이 불규칙한 형태를 띠고 있다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 P. cryptomeriae AB454271과 99% 상동성을 보였으며, β-tublin 영역에 대해서는 P. cryptomeriae AB704257과 92% 상동성을 보였다.
균총의 중심에는 균사가 밀집되어 있으며, 중심에서 가장자리로 갈수록 균사가 성기게 형성되어 있고, 공중균사가 발달해있다. 이 균주의 ITS 지역의 염기서열을 분석한 결과 N. eucalyptorum KC479188과 99% 상동성을 보였다.

후속연구

그러나 현재 우리나라에서는 숙주에 따른 내생균의 군집 구조와 특이성에 관한 연구가 부족한 실정이다[16, 17]. 따라서 내생균의 군집구조에 관한 연구뿐만 아니라, 생물자원으로서 내생균류의 종 다양성을 확보하기 위한 측면에서도 내생균의 분리 및 동정에 관한 지속적인 연구가 필요할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	내생균이 합성 가능한 생리활성물질은 무엇이 있는가?	그러나 거시적 관점에서의 식물 종에 대한 연구는 활발히 진행되고 있으나, 식물과 공진화 과정을 통해 공생관계를 형성해온 다양한 내생균류에 관한 연구는 거의 미미한 실정이다[5]. 내생균은 식물의 건강한 조직에 서식하고 있는 균류로, 일반적으로 조직 내에서 병증을 나타내지 않는 균류를 말하며[6], alkaloids, steroids, terpenoids, flavonoids 등과 같은 다양한 생리활성물질의 합성이 가능하다고 보고되고 있다[7]. 따라서, 생물 다양성을 확보하기 위한 생물자원으로서 식물에 공생하는 내생균을 발굴하는 것은 시급한 실정이다.
	내생균을 분리하고, 형태 및 분자생물학적 특징 통해 동정하기 위해 무엇을 분석하였는가?	본 연구는 제주도 사려니숲과 동백동산에서 편백나무 (Chamaecyparis obtusa), 삼나무(Cryptomeria japonica), 비자나무(Torreya nucifera), 꽝꽝나무(Ilex crenata), 동백나무 (Camellia japonica) 등 5종의 목본 식물의 잎에서 내생균을 분리하고, 형태 및 분자생물학적 특징 통해 동정하였다. 이를 위해 primer인 ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal transcribed spacer (ITS) rDNA영역과 primer LR0R과 LR16을 이용하여 large subunit rDNA 영역을 그리고 primer Bt2a 과 Bt2b를 이용하여 β-tublin 영역의 염기서열을 동시에 분석하였다. 그 결과 Mycosphaerella aleuritidis, Neofusicoccum eucalyptorum, Neofusicoccum parvum, Phyllosticta citrichinensis, Phyllosticta cryptomeriae, Phomopsis cotoneastri, Sphaerulina rhododendricola, Guignardia mangiferae, Lophodermium jiangnanense, Lophodermium minus 등 10종의 미기록 내생균을 동정하였고, 이를 보고하고자 한다.
	제주도는 식물지리학적으로 어떤 섬인가?	제주도는 전북식물구계(Haloartic floristic kingdom)에 속하며, 난대, 온대, 아고산대에 이르는 다양한 기후조건으로 인하여 풍부한 식물상을 가지고 있는 식물지리학적으로 매우 중요한 섬이다[1]. 제주도에 서식하는 식물 종의 분포 등에 관한 연구[2, 3]와 더불어 오늘날에는 기후변화로 인한 지구 온난화의 영향에 취약한 고산, 아고산 등의 일부 생태계에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다[4].

참고문헌 (17)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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