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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 2년간의 정기적 모니터링을 통해, 가지검은마름병의 발생온도 및 시기 규명과 병징이 나타나는 이병조직으로부터 건전조직 내 병원세균의 존재를 확인하여 이병주의 무조건적인 제거가 아닌 병원세균 검출 부위만을 제거하는 효율적 가지치기 방법을 통한 관리 방안을 마련하기 위하여 수행되었다.
제안 방법
- 2013년 이후 조사기간(2014–2015년) 동안 4월부터 10월까지 수집된 모든 시료로부터 가지검은마름병원세균을 분리하고 colony-PCR 방법으로 병원세균을 검출하였다.
- Colony-PCR 조건은 멸균수 36.5 μl에 단일 균총을 이쑤시개를 이용하여 소량 현탁하고 100oC에서 3분간 가열한 후, 10× buffer (1 M KCl, 1 M Tris-HCl, pH 8.0, 1 M MgCl 2 ) 5 μl, 30% DMSO 5 μl, 20 mM dNTP 0.5 μl, 각 10 μM forward 및 reverse 프라이머 1 μl, Taq polymerase (handmade type) 1 μl를 첨가하여 총 50 μl 부피에서 수행되었다.
- 반응시간은 95oC 2분 후, 94oC 15초, 각 프라이머 종류별 annealing conditions (Table 1), 68oC 1분 30초 조건으로 총 35회 반응하였으며, 최종 68oC 10분으로 extension을 완성하였다. Coloy-PCR 산물의 확인은 1% agarose gel 전기영동을 수행하여 ethidium bromide (1 mg/ml)에 염색시킨 후 UV transilluminator에서 각 특이 프라이머 종류별 예상 크기의 밴드생성 유무를 확인하였다. 각 프라이머 종류별 특이 밴드 검출 생성 여부는 1995년 춘천에서 분리된 WT3 균주(Shrestha 등, 2003) 및 1996년 분리균주인 Ep1 (Kim 등, 1999)을 대조균주로 활용 하였으며, 화상병원균주는 type strain인 ATCC15580을 사용하여 비교 분석하였다.
- 가지검은마름병의 발생과 온도와의 관계를 분석하기 위해 시료수집 장소에 Humidity/Temp.data recorder (MHT-381SD; Lutron Electronic Enterprise Co., Taipei, Taiwan)를 설치하여 10분 간격으로 온도를 측정하였다. 일일 평균온도=[(일 최고기온+일 최저기온)/2]로 산정 하여 일 평균온도에 따른 가지검은마름병 발생상황을 분석하였다.
- 각 수집된 꽃, 가지, 잎 그리고 과실은 멸균된 면도칼을 이용하여 직경 3mm로 잘라 70% 에탄올에서 5분, 멸균수 각 5분 3회 세척하여 건조 후, 각 조직을 멸균수에서 마쇄한 후, 10배 희석법으로 10–3까지 희석하여 mannitol glutamate yeast extract (MGY;D-mannitol 10 g, L-glutamic acid 2 g, KH2PO4 0.5 g, NaCl 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, yeast extract 1 g, agar 15 g/l, pH 7.0) 배지에 도말하여 28oC에서 24시간 배양하였다.
- Coloy-PCR 산물의 확인은 1% agarose gel 전기영동을 수행하여 ethidium bromide (1 mg/ml)에 염색시킨 후 UV transilluminator에서 각 특이 프라이머 종류별 예상 크기의 밴드생성 유무를 확인하였다. 각 프라이머 종류별 특이 밴드 검출 생성 여부는 1995년 춘천에서 분리된 WT3 균주(Shrestha 등, 2003) 및 1996년 분리균주인 Ep1 (Kim 등, 1999)을 대조균주로 활용 하였으며, 화상병원균주는 type strain인 ATCC15580을 사용하여 비교 분석하였다.
- 2A). 그러나 20 cm 이상의 건전조직 내에서의 검출은 이루어지지 않아, 6월 19일과 7월 1일 시료를 이용하여 경계면으로부터 20 cm 이상의 거리에서도 병원세균의 존재유무를 검정하였다. 먼저 6월 19일 시료에서는 경계면으로부터 최장 81 cm까지 검정 하였는데, 이병조직과 건전조직 경계면으로부터 13 cm 건전조직 내에서는 6월 5일 시료와 마찬가지로 병원세균이 검출되었으며, 20 cm 이상의 간격인 26 cm, 55 cm 및 81 cm 간격의 조직에서는 가지검은마름병원세균이 검출되지 않았다(Fig.
- 이때 성숙과실은 과실자루와 과실표면 및 내부로 나누어 분리하였다. 배양 24시간 후 형성되는 모든 균총들은 크기, 색 및 모양 등의 성상에 따라 동일 배지에 순수분리하여 가지검은마름병원 세균의 성상과 비교하였다.
- 병원세균의 분리는 수집된 시료를 ice box에 보관하여 실험실로 이동한 후, 24시간 이내에 수행하였다. 각 수집된 꽃, 가지, 잎 그리고 과실은 멸균된 면도칼을 이용하여 직경 3mm로 잘라 70% 에탄올에서 5분, 멸균수 각 5분 3회 세척하여 건조 후, 각 조직을 멸균수에서 마쇄한 후, 10배 희석법으로 10–3까지 희석하여 mannitol glutamate yeast extract (MGY;D-mannitol 10 g, L-glutamic acid 2 g, KH2PO4 0.
- 농림축산식품부 “가지검은마름병 발생경과 및 조치사항”에 따라 2013년 가지 검은마름병 발생이 최초 확진되고 이후 2015년까지 지속적으로 병 발생이 확진된 경기도 포천시 소재 사과나무 과수원에서 이병체를 수집하였다. 수집기간은 2014년과 2015년총 2년에 걸쳐 실시하였고 개화직전 단계인 4월부터 수확기인 10월까지였으며, 2014년은 7회(4월 29일, 6월 5일, 6월 19일, 7월 1일, 8월 5일, 8월 21일 및 10월 2일), 2015년은 13회 (4월 17일, 5월 1일, 5월 15일, 5월 29일, 6월 12일, 6월 26일, 7 월 10일, 7월 27일, 8월 7일, 8월 21일, 9월 4일, 9월 18일 및 10 월 2일) 수집하였다. 수집 시 4월과 5월은 사과나무에서 어떠한 유사 증상도 관찰할 수가 없어 건전 줄기 및 잎을 채취하였으며, 이후에는 전형적인 마름증상의 이병조직이 관찰되어 이를 중심으로 수집하였고, 9월 이후는 수확 및 출하시기로 성숙과실만을 대상으로 하였다.
- 수집된 시료로부터 가지검은마름병원세균의 신속한 검출을 위하여, genomic DNA 추출과정 없이 각 균총들로부터 직접 PCR 반응을 통한 검출로 수행되었다. 이에 성상이 다른 단일 균총들 중에서 가지검은마름병원세균과 가장 유사한 성상을 나타내는 균총들을 이용하여 colony-PCR용 프라이머를 선발하였다.
- 이에 건전조직 내 이병조직으로부터 거리에 따라 병원세균의 존재유무를 확인하였다. 이 시기에 수집된 줄 기는 모두 2년생 이상 줄기로 직경이 1 cm 이상이어서 병원균 분리를 위한 마쇄가 용이하지 않아, 멸균된 면도칼을 이용하여 잘게 분쇄 후 멸균수에 침지하여 10분간 정치하고 vortaxing한 후, 다른 조직으로부터의 분리과정과 동일하게 배양하여 생장하는 단일 균총을 순수분리하였다.
- 2014–2015년 동안 이병조직으로부터 가지검은 마름병원세균이 검출된 기간 내의 시료들 중에서, 2014년 6월 5일, 6월 19일 및 7월 1일, 그리고 2015년 6월 12일 수집된 이병줄기는 이병조직과 건전조직을 명확히 구분할 수있었다. 이에 건전조직 내 이병조직으로부터 거리에 따라 병원세균의 존재유무를 확인하였다. 이 시기에 수집된 줄 기는 모두 2년생 이상 줄기로 직경이 1 cm 이상이어서 병원균 분리를 위한 마쇄가 용이하지 않아, 멸균된 면도칼을 이용하여 잘게 분쇄 후 멸균수에 침지하여 10분간 정치하고 vortaxing한 후, 다른 조직으로부터의 분리과정과 동일하게 배양하여 생장하는 단일 균총을 순수분리하였다.
- 수집된 시료로부터 가지검은마름병원세균의 신속한 검출을 위하여, genomic DNA 추출과정 없이 각 균총들로부터 직접 PCR 반응을 통한 검출로 수행되었다. 이에 성상이 다른 단일 균총들 중에서 가지검은마름병원세균과 가장 유사한 성상을 나타내는 균총들을 이용하여 colony-PCR용 프라이머를 선발하였다. Colony-PCR용 프라이머 후보군들은 기존에 genomic DNA를 이용한 PCR 반응에서 가지검은마름병 특이 프라이머로 보고된 것과 본 연구에서 병원성 및 housekeeping 유전자를 활용하여 개발된 프라이머들을 대상으로 가지검은마름병 검출 특이 colony-PCR용 프라이머들을 선발하였다(Table 1) (Bereswill 등, 1995; Kim 등, 2001a, 2001b;Park 등, 2010; Shrestha 등, 2005b, 2007).
- 이들은 모두 enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) 부위 유래 특이 염기서열 지역에서 제작된 프라이머들로(Park 등, 2010; Shrestha 등, 2007), colony-PCR에서도 효율적으로 특이성을 나타냄을 알수 있었다. 이에 최종적으로 이후 실험에서는 EpSPF/EpSPR 프라이머 쌍을 이용하여 가지검은마름병원세균 검출을 수행하였다.
- , Taipei, Taiwan)를 설치하여 10분 간격으로 온도를 측정하였다. 일일 평균온도=[(일 최고기온+일 최저기온)/2]로 산정 하여 일 평균온도에 따른 가지검은마름병 발생상황을 분석하였다.
대상 데이터
- 이에 성상이 다른 단일 균총들 중에서 가지검은마름병원세균과 가장 유사한 성상을 나타내는 균총들을 이용하여 colony-PCR용 프라이머를 선발하였다. Colony-PCR용 프라이머 후보군들은 기존에 genomic DNA를 이용한 PCR 반응에서 가지검은마름병 특이 프라이머로 보고된 것과 본 연구에서 병원성 및 housekeeping 유전자를 활용하여 개발된 프라이머들을 대상으로 가지검은마름병 검출 특이 colony-PCR용 프라이머들을 선발하였다(Table 1) (Bereswill 등, 1995; Kim 등, 2001a, 2001b;Park 등, 2010; Shrestha 등, 2005b, 2007). 또한 가지검은마름병원세균의 균총 특성은 화상병원세균과도 매우 유사하기에, 이를 구별할 수 있는 화상병원균 특이 프라이머도 포함 시켰다(Table 1).
- Confirmation of expected size by colony-PCR assay with EpERF/EpERR (A) and EpSPF/EpSPR (B) primer sets. WT3 and Ep1, and ATCC15580 are representative strains for Erwinia pyrifoliae and Erwinia amylovora, respectively, tested in this study. M, marker of 1 kb ladder DNA.
- 농림축산식품부 “가지검은마름병 발생경과 및 조치사항”에 따라 2013년 가지 검은마름병 발생이 최초 확진되고 이후 2015년까지 지속적으로 병 발생이 확진된 경기도 포천시 소재 사과나무 과수원에서 이병체를 수집하였다.
- 수집기간은 2014년과 2015년총 2년에 걸쳐 실시하였고 개화직전 단계인 4월부터 수확기인 10월까지였으며, 2014년은 7회(4월 29일, 6월 5일, 6월 19일, 7월 1일, 8월 5일, 8월 21일 및 10월 2일), 2015년은 13회 (4월 17일, 5월 1일, 5월 15일, 5월 29일, 6월 12일, 6월 26일, 7 월 10일, 7월 27일, 8월 7일, 8월 21일, 9월 4일, 9월 18일 및 10 월 2일) 수집하였다. 수집 시 4월과 5월은 사과나무에서 어떠한 유사 증상도 관찰할 수가 없어 건전 줄기 및 잎을 채취하였으며, 이후에는 전형적인 마름증상의 이병조직이 관찰되어 이를 중심으로 수집하였고, 9월 이후는 수확 및 출하시기로 성숙과실만을 대상으로 하였다.
성능/효과
- 이에 본 연구에서 활용된 프라이머들은 기존 보고에서 모두 추출된 genomic DNA를 이용하여 특이성이 검증된 것들로, 세포만을 가지고 수행하는 colony-PCR에서의 활용성 여부를 검증해야만 할 필요가 있었다. 2종류(WT3 및 Ep1)의 가지검은마름병원세균에서는 특이 밴드를 생성한 반면, 화상병원세균에서는 나타나지 않는 프라이머들로는 CPS1/CPS2c, EP16A/EPIG2c, EpERF/EpERR, EpSPF/EpSPR, recAF/recAR, dspEF/dspER, 그리고 gyrAF/gyrAR로 나타났다(data not shown). recAF/recAR, dspEF/dspER 및 gyrAF/gyrAR 프라이머들은 비특이 대상 균주인 ATCC15580에서도 예상 크기의 밴드는 아니지만 다른 크기의 밴드를 생성하여 제외시켰으며, EP16A/EPIG2c 프라이머는 WT3 와 Ep1 균주에서의 특이 밴드 생성 강도의 차이가 있었고, CPS1/CPS2c는 특이 밴드의 크기가 1.
- 2 kb로 다소 큰 문제 점이 있었다(data not shown). 가장 효율적인 colony-PCR용가지검은마름병 특이 프라이머는 EpERF/EpERR과 EpSPF/ EpSPR의 2종류였다(Fig. 1). 이들은 모두 enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) 부위 유래 특이 염기서열 지역에서 제작된 프라이머들로(Park 등, 2010; Shrestha 등, 2007), colony-PCR에서도 효율적으로 특이성을 나타냄을 알수 있었다.
- 결론적으로 가지검은마름병원세균은 육안으로 병징이 관찰되는 이병조직(잎, 유과 및 줄기) 내에서 검출되었으며, 이병조직과 건전조직 경계면으로부터 건전조직 내 20 cm 이상의 간격에서는 검출되지 않았다. 따라서 사과나무 생육 초중기에 해당하는 5월 말부터 7월 초순 시기에 가지검은마름병이 발생할 경우 이병조직과 건전조직 경계면으로 부터 건전조직 20 cm 이상의 간격을 두고 가지치기를 한다면 효율적으로 병의 확산을 억제할 수 있다고 판단되었다.
- 이는 사과 및 배 화상병(fire blight)의 병징과 매우 유사하여, 당시에는 국내에서 화상병이 발생한 것으로 오인되어 많은 논란을 야기시켰던 대표적 세균성 과수병해이다. 그러나 병원 세균의 배양적, 혈청학적 및 유전학적 특성을 분석한 결과, 화상병의 병원세균인 Erwinia amylovora와는 특성이 완연히 다른 병원세균으로 확인되었으며(Rhim 등, 1999), 1999년Kim 등(1999)에 의해 새로운 신종인 Erwinia pyrifoliae로 명명 되어 국내에서 발생하는 사과 및 배 가지검은마름병의 원인세균으로 공시되었다.
- 따라서 가지검은마름병의 발생 시 이병체로부터 건전조직 줄기로 20 cm 이상에서 가지치기의 경종적 관리방법은, 2015년 농촌진흥청 과수 가지검은마름병 예찰방제사업 지침에 따라 사과는 이병주가 10% 이상일 경우 폐원하고 10% 이하일 때는 이병주 및 인접 8주를 제거해야만 하는 손실을 줄이면서 동시에 효율적으로 가지검은마름병을 관리할 수있는 방안으로 제안하는 바이다.
- 한편 7월 중순 이후 병징이 관찰된 줄기와 잎이 제거되지 않고 그대로 보존되어 있는 이병 사과나무에서 이병체를 수집하여 검출한 결과, 2014년과 2015년 모두 병원세균의 존재는 분리 및 colony-PCR 모두에서 확인할 수 없었다. 따라서 가지검은마름병의 최적 발생 평균온도는 25oC 내외로 생각되어 Shrestha 등(2005a)이 보고한 내용과 유사하였으며, 이후 일 평균온도가 30oC 이상 유지될 경우에는 가지검은마름병원세균은 온도적응 능력이 감소하고, 이는 밀도감소의 원인이 되는 것으로 판단되 었다. 이러한 고온조건에서의 병원세균의 생존전략 및 월동과 하동을 위한 이동전략 그리고 장소에 대해서는 향후더 심도 깊은 연구가 이루어져야만 한다고 생각된다.
- 결론적으로 가지검은마름병원세균은 육안으로 병징이 관찰되는 이병조직(잎, 유과 및 줄기) 내에서 검출되었으며, 이병조직과 건전조직 경계면으로부터 건전조직 내 20 cm 이상의 간격에서는 검출되지 않았다. 따라서 사과나무 생육 초중기에 해당하는 5월 말부터 7월 초순 시기에 가지검은마름병이 발생할 경우 이병조직과 건전조직 경계면으로 부터 건전조직 20 cm 이상의 간격을 두고 가지치기를 한다면 효율적으로 병의 확산을 억제할 수 있다고 판단되었다. 이는 가지검은마름병과 유사한 병징을 나타내는 화상병의 확산 방지 및 병원세균의 밀도를 감소시키기 위해 전략으로, 이병가지로부터 건전조직 내 20–30 cm 이상을 제거할 경우 매우 효율적으로 관리할 수 있다는 보고와 유사한 결과이다(Johnson, 2000; Sundin, 2014; Wilcox, 1994).
- 병징을 육안으로 관찰할 수 있는 이병조직과 건전조직 간의 병원세균의 존재유무를 관찰한 결과, 2014년 6월 15일 시료에서는 모든 이병조직 내의 가지검은마름병원세균과 유사한 성상을 나타내는 균총들은 573 bp의 가지검은마름병원세균 특이 밴드를 생성하였다. 또한 이병조직과 건전조직 경계면으로 부터 10 cm 및 20 cm 거리의 건전조직 내에서 분리된 가지 검은마름병 유사 균총들 모두 특이 밴드를 나타내어, 이병조직으로부터 건전조직 내 20 cm까지 가지검은마름병원 세균이 존재할 수 있음이 증명되었다(Fig. 2A). 그러나 20 cm 이상의 건전조직 내에서의 검출은 이루어지지 않아, 6월 19일과 7월 1일 시료를 이용하여 경계면으로부터 20 cm 이상의 거리에서도 병원세균의 존재유무를 검정하였다.
- 2015년은 5월 말(5월 29일) 부터 6월 중순(6월 12일)에만 병원세균이 검출되었으며, 온도범위는 25oC–30oC였다. 한편 7월 중순 이후 병징이 관찰된 줄기와 잎이 제거되지 않고 그대로 보존되어 있는 이병 사과나무에서 이병체를 수집하여 검출한 결과, 2014년과 2015년 모두 병원세균의 존재는 분리 및 colony-PCR 모두에서 확인할 수 없었다. 따라서 가지검은마름병의 최적 발생 평균온도는 25oC 내외로 생각되어 Shrestha 등(2005a)이 보고한 내용과 유사하였으며, 이후 일 평균온도가 30oC 이상 유지될 경우에는 가지검은마름병원세균은 온도적응 능력이 감소하고, 이는 밀도감소의 원인이 되는 것으로 판단되 었다.
후속연구
- 이병조직과 건전조직 내의 가지검은마름병원세균의 검출은 순수 세균 DNA 추출과정 없이 수행될 경우, 시간절약과 비용절감 면에서 큰 이익을 얻을 수 있는 절차이다. 그러나 반드시 동반되어야 할 조건은 순수 DNA를 활용하는 것이 아니므로 colony-PCR에서도 이들 프라이머의 특이적 검출능력이 확보되어야만 한다. 이에 본 연구에서 활용된 프라이머들은 기존 보고에서 모두 추출된 genomic DNA를 이용하여 특이성이 검증된 것들로, 세포만을 가지고 수행하는 colony-PCR에서의 활용성 여부를 검증해야만 할 필요가 있었다.
- 따라서 가지검은마름병의 최적 발생 평균온도는 25oC 내외로 생각되어 Shrestha 등(2005a)이 보고한 내용과 유사하였으며, 이후 일 평균온도가 30oC 이상 유지될 경우에는 가지검은마름병원세균은 온도적응 능력이 감소하고, 이는 밀도감소의 원인이 되는 것으로 판단되 었다. 이러한 고온조건에서의 병원세균의 생존전략 및 월동과 하동을 위한 이동전략 그리고 장소에 대해서는 향후더 심도 깊은 연구가 이루어져야만 한다고 생각된다.
- 그러나 반드시 동반되어야 할 조건은 순수 DNA를 활용하는 것이 아니므로 colony-PCR에서도 이들 프라이머의 특이적 검출능력이 확보되어야만 한다. 이에 본 연구에서 활용된 프라이머들은 기존 보고에서 모두 추출된 genomic DNA를 이용하여 특이성이 검증된 것들로, 세포만을 가지고 수행하는 colony-PCR에서의 활용성 여부를 검증해야만 할 필요가 있었다. 2종류(WT3 및 Ep1)의 가지검은마름병원세균에서는 특이 밴드를 생성한 반면, 화상병원세균에서는 나타나지 않는 프라이머들로는 CPS1/CPS2c, EP16A/EPIG2c, EpERF/EpERR, EpSPF/EpSPR, recAF/recAR, dspEF/dspER, 그리고 gyrAF/gyrAR로 나타났다(data not shown).
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