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문제 정의
- 따라서 지금까지의 연구를 보완하여 변화하는 모유량을 보다 객관적으로 측정할 수 있는 추가 지표 선정의 필요성을 인식하였다. 또한 모유수유에 도움이 되는 많은 한약처방 중에서 임상적으로 산후에 다용하는 補虛湯을 기본으로 하여 모유수유에 도움이 되는 약재를 가미한 補虛湯加減에 대해 연구하고자 하였다.
- 이에 저자는 補虛湯에서 人蔘 대신 補腎益精 養血潤燥하는 海蔘을 加하고, 通氣下乳하여 임상에서 모유촉진 목적으로 다용되는 木通, 通草, 王不留行을 가미한 補虛湯加減을 분만 전후의 생쥐에게 복용시킨 후, 새끼생쥐의 무게와 수유량 측정, 유선조직 관찰 및 유선조직에서 유즙분비와 관련된 AQP11-4) 등을 관찰하여 補虛湯加減의 유즙분비촉진 작용에 대하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 補虛湯에서 人蔘을 去하고 海蔘, 木通, 通草, 王不留行을 加味한 補虛湯加減을 복용시킨 후 유즙분비와 유즙분비 관련인자에 미치는 영향을 알아보기 위하여 분만 전후의 생쥐에 각각 용량과 기간을 달리하여 補虛湯加減을 투여한 후, 새끼생쥐의 체중, 수유량 및 prolactin 호르몬 농도 측정, 유선의 조직학적 관찰, 면역조직화학적 염색, 유선조직의 단백질 분리 및 western blotting 검사를 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 분만 후 3일째부터 오전에 6마리의 새끼생쥐의 체중을 2주간 매일 측정하여 각 군 간에 비교하였다.
- 수유량의 측정은 Liu 등14)의 방법을 변형하여 수유 전후 새끼생쥐의 무게를 측정하여 수유량으로 계산하였다. 분만 후 3일째부터 12일간 오전 9시경 어미생쥐를 새끼생쥐로부터 3시간 분리시켜 새끼생쥐를 굶긴 후에 수유 전 체중을 측정하였다.
- 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험 개시 전에 교미를 시킨 후 에 임신된 암컷(출산 날짜가 유사한 것)을 총 4군으로 나누어 분만하기 10일 전에 각각의 cage에 1마리씩 격리하여 적응시킨 후 한 군당 6마리씩 배정하여 사용하였다. 정상적인 분만과 수유를 하는 어미와 새끼들만을 실험에 사용하였으며, 대조군과 비교하기 위하여 임신을 하지 않은 SKH-1 생쥐를 virgin군으로 사용하였다.
- 실험 종료 후 생쥐를 희생시켜 유선조직의 AQP1, AQP3, AQP5에 대한 면역 조직화학염색법을 시행하여 관찰하였다.
- 연조엑스는 실험군에 따라 분만 1주일 전 혹은 분만 후부터 1일 2회 오전과 오후에 2주 또는 3주간 구강투여 하였다. BHT는 ≪東醫寶鑑≫11)에 수재된 補虛湯을 기본으로 人蔘대신 補腎益精 養血潤燥하는 海蔘을 加하고, 通氣下乳의 효과가 있는 木通, 通草, 王不留行을 가미한 처방으로 처방구성약물과 1첩 분량은 다음과 같다(Table 1).
- 출산 후 1일째부터 2주간 증류수를 투여한 군을 대조군(control group, 이하 LH2O)으로 설정하고, 실험군은 출산 후 1일째부터 2주간 BHT 400 mg/day을 투여한 군(lactating+400G group, 이하 L400G), 출산 후 1일째부터 2주간 BHT 600 mg/day 을 투여한 군(lactating+600G group, 이하 L600G), 출산 1주 전부터 출산 후 2주째까지 3주간 1일에 400 mg/day을 투여한 군(400G+lactating+400G group, 이하 400G-L400G) 으로 나누었으며, 각 군마다 새끼를 잘 키우는 생쥐를 6마리씩 무작위 배분하여 본 실험에 사용하였다. 분만 직후에는 어미생쥐 1마리당 새끼생쥐 6마리만 남겨두고 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 실험 개시 전에 교미를 시킨 후 에 임신된 암컷(출산 날짜가 유사한 것)을 총 4군으로 나누어 분만하기 10일 전에 각각의 cage에 1마리씩 격리하여 적응시킨 후 한 군당 6마리씩 배정하여 사용하였다. 정상적인 분만과 수유를 하는 어미와 새끼들만을 실험에 사용하였으며, 대조군과 비교하기 위하여 임신을 하지 않은 SKH-1 생쥐를 virgin군으로 사용하였다. 동물실험은 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인(WS2015-002)을 받아 실시하였다.
- 실험동물은 25 g 내외의 SKH-1 생쥐를 자체 번식하여 20±2℃, 습도 55±5% 조건하에서 적응시킨 후에 사용하였다. 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험 개시 전에 교미를 시킨 후 에 임신된 암컷(출산 날짜가 유사한 것)을 총 4군으로 나누어 분만하기 10일 전에 각각의 cage에 1마리씩 격리하여 적응시킨 후 한 군당 6마리씩 배정하여 사용하였다. 정상적인 분만과 수유를 하는 어미와 새끼들만을 실험에 사용하였으며, 대조군과 비교하기 위하여 임신을 하지 않은 SKH-1 생쥐를 virgin군으로 사용하였다. 동물실험은 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인(WS2015-002)을 받아 실시하였다.
이론/모형
- 실험 종료 후 희생시킨 생쥐의 유선조직을 단백질 정량하여 AQP1, AQP3, AQP5에 대한 western blot을 시행하였다.
- 혈청 내 prolactin 농도는 prolactin mouse ELISA kit(abcam, ab100736, UK)를 구입하여 Bassey 등16)의 방법에 의하여 측정하였다
성능/효과
- 실험동물은 25 g 내외의 SKH-1 생쥐를 자체 번식하여 20±2℃, 습도 55±5% 조건하에서 적응시킨 후에 사용하였다. 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
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- 유선조직의 AQP에 대한 면역조직화학적 염색 소견에서 AQP1, AQP3, AQP5는 대조군에 비해 모든 실험군에서 강한 면역 반응을 나타내었다. AQP1은 유선포의 사이질조직과 도관주위 조직에 위치한 모세혈관과 세정맥 등에서 관찰되었고, AQP3와 AQP5는 유선포세포와 사이질조직에서 강한 면역반응을 나타내었다.
- 7. Western blot 소견에서 AQP1의 발현은 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로, AQP3의 발현은 L600G, 400G-L400G 및 L400G군 순서대로, AQP5의 발현은 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로 증가하는 경향을 나타내었다.
- 4. 광학현미경적 관찰 소견에서 모든 실험군의 유선조직은 대조군에 비하여 발달하였고, 발달 정도는 L600G, L400G 및 400G-L400G군 순서대로 발달하였다.
- 첫째, 새끼생쥐의 체중 변화는 모유량을 직접적으로 측정하는 것이 아니며, 또한 새끼생쥐의 체중이 매우 적게 나가기 때문에 상대적으로 오류나 변수가 있을 확률이 크다. 둘째, 호르몬의 농도가 반드시 모유량과 비례하지는 않는다는 점이다. 모유생산의 개시는 내분비적으로 prolactin과 cortisol 등의 호르몬에 의해서 조절되지만, 결국 긴 기간 동안의 모유생산은 자가분비조절체계로 이행되어 유지되기 때문이다25).
- 이번 실험결과 새끼생쥐의 체중변화는 L600G군에서 가장 많은 증가를 보였고, 대조군에 비하여 모든 실험군의 무게가 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 관찰기간 동안의 일일 수유량은 실험군이 대조군에 비하여 더 많이 증가하는 경향이 있었고, 총수유량의 평균값에서도 대조군인 LH2O군에 비하여 모든 실험군이 더 높은 경향을 보였으나, 일일 수유량과 총수유량 모두 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다.
- 2. 수유기간 내 총수유량은 L600G군이 가장 많았으며, L400G, 400G-L400G, LH2O군 순서로 총수유량이 많았던 것으로 나타났다. 일일 수유량 비교에서 대조군에 비하여 실험군들의 수유량이 더 많은 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다.
- 실험 종료 후 생쥐를 희생시켜 유선조직 내 prolactin receptor에 대한 면역조직화 학염색법을 시행하여 관찰한 결과 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 일부 유선포세포, 유선포 사이질세포와 사이질조직 및 혈관 등에 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 7, 8).
- 실험 종료 후 생쥐를 희생시켜 유선조직의 광학현미경 구조를 H&E 염색하여 관찰한 결과 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 유선포세포 및 사이질조직이 발달한 것을 관찰할 수 있었다
- 유선조직의 AQP에 대한 면역조직화학적 염색 소견에서 AQP1, AQP3, AQP5는 대조군에 비해 모든 실험군에서 강한 면역 반응을 나타내었다. 이는 補虛湯加減이 유선조직 AQP1, AQP3, AQP5의 발현을 촉진시킬 수 있음을 시사한다
- 5. 유선조직의 prolactin receptor에 대한 면역조직화학 염색반응에서는 대조군에 비하여 모든 실험군의 유선조직 내 유선포세포, 유선포 사이질세포와 사이질조직 및 혈관 등에 강한 면역반응이 나타나는 것을 볼 수 있었다.
- 이번 실험결과 새끼생쥐의 체중변화는 L600G군에서 가장 많은 증가를 보였고, 대조군에 비하여 모든 실험군의 무게가 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 관찰기간 동안의 일일 수유량은 실험군이 대조군에 비하여 더 많이 증가하는 경향이 있었고, 총수유량의 평균값에서도 대조군인 LH2O군에 비하여 모든 실험군이 더 높은 경향을 보였으나, 일일 수유량과 총수유량 모두 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과를 토대로 補虛湯加減 투여는 출산 후 생쥐의 prolactin 농도를 증가시키고, 유선조직에서 prolactin receptor 및 AQP의 발현을 증가시켜 유선조직을 발달시킴으로써 모유분비를 증가시키는 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 실험결과 補虛湯加減은 출산 후 생쥐의 모유량을 증가시키고, prolactin의 혈중 내 농도를 높이며, 유선조직을 발달시키고, AQP의 발현을 증가시키는 경향이 있어서 유즙분비를 촉진함을 알수 있었다. 하지만 AQP에 대해서는 補虛湯加減의 투여량에 따른 효과가 일관성을 보이지 않아 추후에 한약 복용과 AQP의 연관성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 수유기간 내 총수유량은 L600G군이 가장 많았으며, L400G, 400G-L400G, LH2O군 순서로 총수유량이 많았던 것으로 나타났다. 일일 수유량 비교에서 대조군에 비하여 실험군들의 수유량이 더 많은 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다.
- 그러나 이러한 방법들은 다음과 같은 한계점을 가지고 있다. 첫째, 새끼생쥐의 체중 변화는 모유량을 직접적으로 측정하는 것이 아니며, 또한 새끼생쥐의 체중이 매우 적게 나가기 때문에 상대적으로 오류나 변수가 있을 확률이 크다. 둘째, 호르몬의 농도가 반드시 모유량과 비례하지는 않는다는 점이다.
후속연구
- 五苓散이 AQP를 조절하여 인체의 수분 평형을 조절하듯, 補虛湯加減이 모유생산을 촉진하는 기전은 단순한 수분의 체외배출이 아니라 AQP의 발현과 연관되어 있을 것으로 사료된다. 그러나 補虛湯加減의 구성약물 중에서 어느 약물이 이러한 효과와 관련이 클 것인지에 대해서는 향후에 개별약물에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 즉, 임신 중 생쥐에게 강제로 장기간 약물을 공급하게 된 것에 대한 스트레스 요인으로 모유촉진효과를 나타내지 못했을 가능성 외에 한약복용의 시점에 따른 모유분비의 기전의 영향에 대한 가능성을 제시해 볼 수 있다. 그러므로 이러한 결과는 사람이 복용하였을 때 나타나는 효과와는 다소 차이가 있을 것으로 생각되며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 모유촉진 효과를 입증하는 다양한 방법의 연구들이 이루어지고 있음에도 불구하고 동물실험으로 이루어질 수밖에 없는 한계와 더불어 정량적 지표를 찾기 어려운 점이 있다. 기존지표의 한계와 더불어 최근에서야 연구되어지고 있는 AQP지표 또한 다양한 연구설계를 통한 해석이 필요할 것으로 보인다.
- 모유생산의 개시는 내분비적으로 prolactin과 cortisol 등의 호르몬에 의해서 조절되지만, 결국 긴 기간 동안의 모유생산은 자가분비조절체계로 이행되어 유지되기 때문이다25). 셋째, 유선조직의 관찰은 조직학적으로 부분적인 세포를 관찰하여 육안적인 구별에 의지해야하므로 한계가 있을 수밖에 없다. 따라서 지금까지의 연구를 보완하여 변화하는 모유량을 보다 객관적으로 측정할 수 있는 추가 지표 선정의 필요성을 인식하였다.
- 이상의 실험결과 補虛湯加減은 출산 후 생쥐의 모유량을 증가시키고, prolactin의 혈중 내 농도를 높이며, 유선조직을 발달시키고, AQP의 발현을 증가시키는 경향이 있어서 유즙분비를 촉진함을 알수 있었다. 하지만 AQP에 대해서는 補虛湯加減의 투여량에 따른 효과가 일관성을 보이지 않아 추후에 한약 복용과 AQP의 연관성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 산후 大補氣血의 대표 처방인 補虛湯에 通氣下乳의 효과를 더한 補虛湯加減은 여러 지표 결과 상 유선조직을 발달 시키고 모유분비를 촉진함을 알 수 있었다. 향후 補虛湯加減의 개별약재에 대한 기전연구와 산모를 대상으로 한 임상연구가 이루어진다면 산후 유즙부족에 더 많은 임상적 가치와 활용도를 가질 것으로 판단된다.
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