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문제 정의
- 방풍에 대한 기존 연구는 항염, 항진통 등에 대한 검토가 대부분이며[36], 방풍이 혈중 지질 수준 및 골 형성에 미치는 영향에 대한 연구는거의 없는 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 난소를 절제하여갱년기 장애를 유도한 흰쥐에 방풍 추출물을 투여함으로써난소절제에 의한 estrogen 결핍으로 야기되는 지질 변화 수준및 혈소판 응집능, 골 중 collagen 함량 변화에 대한 방풍나물의 효과를 검토하고자 하였다.
- 또한, collagen의 대사에 관여하는 분해효소 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 발현을 조절하여 collagen의 분해를 억제하며[18], 에스트로겐이 결핍되면 골수내 미세 환경에서 사이토카인에 의한 조절기전의 장애로 인해비정상적으로 골 재형성과정이 촉진된다. 본 연구에서는 난소절제로 인하여 에스트로겐이 결핍되었을 때 collagen 생성 변화에 있어 방풍 추출물의 영향을 검토하였다(Table 7).
- 본 연구에서는 방풍 에탄올 추출물이 난소를 절제한 흰쥐의항 혈전능에 미치는 영향을 검토하였다(Table 5).
제안 방법
- 1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 zoletil과 rompun (Morning Korea Co.
- Japan)를 사용하였다. FUJI DRI-CHEM SLIDE 위에 분리한 혈청 10 μl를 점착하여 DRY CHEM (3600i, Fuji Co, Japan)을 사용하여 500 nm의 파장에서분석하였다.
- Korea)을 이용하여 마취 후 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 또한 대 조군 설정을 위하여 비 난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고, 양측의 난소를 노출하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을시행하여, 이들을 대조군으로 사용하였다.
- 본 연구에서는 인위적으로 갱년기를 유도한 실험동물에게 방풍 에탄올 추출물을 투여하여 혈청 내 총 콜레스테롤, 중성지방, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 함량 변화를 검토하였다(Table 4).
- 세척된 방풍은 건조 후 분쇄하여 실험에 사용하였다. 분말시료에 각각 10배량(w/v)의 80% ethanol을 첨가한 후, 80℃에서 4시간 동안 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 200 mm의 여과지(Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuum evaporator (R-200, Buchi, Switzerland)로 농축하여 동결건조장치(FD8518, Ilshin Biobase, Korea)로 동결건조 후 추출물을 얻었다.
- complete block design)에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 zoletil과 rompun (Morning Korea Co. Korea)을 이용하여 마취 후 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 또한 대 조군 설정을 위하여 비 난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고, 양측의 난소를 노출하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을시행하여, 이들을 대조군으로 사용하였다.
- 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였으며, 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50-55%를 유지시켰고, 실험시료는 증류수로 용해하여 대조군은 동일용량의 증류수를 투여하였으며, 실험기간 동안 식이와 물은 제한 없이 섭취하게하였다. 동물실험은 신라대학교 동물실험윤리 위원회의 승인 (SUACUC-2014-008)하의 관리지침에 따라 수행하였다.
- 중성지방, 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 분석은 자동 측정용 slide kit (FUJI FILM, Japan)를 이용하여 Dry Chemistry Analyzer 3500i (FUJI, Japan)를 사용하여 측정하였다.
- sham-operation을 실시하였다. 즉 실험동물은 비난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 방풍 추출물 50 ㎎/㎏/day 투여군(OVX-LE50) 및난소절제 후 방풍 추출물 200 ㎎/㎏/day 투여군 (OVX- LE200)의 각 6마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구투여하며 6주간 사육하였다(Table 1).
- 체중이 200-250 g인 9주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐 24 마리를 (주)오리엔트바이오에서 분양받아 1주일간 적응시킨후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을나누어 난소절제 수술(ovariectomy)을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 즉 실험동물은 비난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 방풍 추출물 50 ㎎/㎏/day 투여군(OVX-LE50) 및난소절제 후 방풍 추출물 200 ㎎/㎏/day 투여군 (OVX- LE200)의 각 6마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구투여하며 6주간 사육하였다(Table 1).
- 혈액은 실험동물을 해부 전 24시간 절식시킨 후 zoletil과 rompun 마취하에 개복한 후 복대동맥에서 채취하여 헤파린으로 처리된 튜브를 사용하고, 혈액응고 실험을 위해 3.2% so- dium citrate를 1:9의 비율로 혼합하여 분석에 사용하였다. 또한 혈액의 생화학적 분석을 위해 상온에서 30분간 방치 한 후, 3, 000 rpm에서 10분간 원심 분리에 의해 혈청을 분리하여 사용하였다.
대상 데이터
- 4월 여수에서 채취된 것을 구입하여 흐르는 물에 4~5회 세척하여 불순물을 제거하였다. 세척된 방풍은 건조 후 분쇄하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과 얻어진 자료를 SPSS (statistical package for social science, version 17.0) 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Duncan's multiple range test에 의해 p<0.
- 0) 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Duncan's multiple range test에 의해 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 희석하여 시료용액으로 하였다. 결합조직의 collagen 함량은 Woessner법[37]을 이용하여 분석하였다. Hydroxyproline 의 정량분석을 위해 조제한 시료를 다시 증류수로 일정량 희석한 후 실험에 사용하였다.
- 방풍의 항 혈소판 응집효과는 Whole blood lumi-aggreg- ometer (Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 optical 방법으로 혈소판 응집을 측정하였다. 응집 유도제로 collagen을 사용하였으며, micro-magnetic bar를 넣은 cuvette에는 미리 37 ℃에서 incubation시킨 PRP 50 μl와 suspending buffer, 10 mM CaCl2를 넣고 다시 incubation한 후 collagen 2.
성능/효과
- Am- plitude (%)는 각 실험동물의 혈액에서 정제된 혈소판만을 분리하여 응집을 유도하였을 때 일어나는 최대 응집 정도를 나타내는 것으로 난소절제를 하지 않은 SHAM군에 비해 난소절제를 한 OVX-CON군은 응집이 촉진되었고, OVX-CON군에비해 방풍 에탄올 추출물 투여군에서 유의적으로 감소하는경향이 나타났다. Slop (Ω/min)은 응집 유도물질인 콜라겐을넣은 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 말하며 이때응집의 진행과 함께 혈소판이 platinum electrodes에 부착됨으로써 발생하는 전기저항(impedance: Ω)의 크기를 혈소판응집치로 나타낸다.
- 나타났다. 골 조직에서 또한 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군과 비교해 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다. 한편, 난소를 절제한 후 방풍 추출물을 50 ㎎/㎏/day 투여한 OVX-LS50군에서는 대조군에 비해 collagen 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 ㎎/㎏/ day 투여한 OVX-LS200군의 경우 유의적으로 증가하였다.
- 난소절제 시(OVX-CON군) 에스트로겐 결핍으로 골 교체가 증가되어 비 난소절제(SHAM)군에 비해 혈청 중의 ALP 활성이 증가되었으나 유의성 있는 결과는나타나지 않았다. 한편, 방풍 에탄올 추출물 투여군에서는 난소절제로 인하여 그 활성이 증가된 OVX-CON군에 비해 활성이 감소하는 경향을 나타내었으며, 200 ㎎/㎏/day 투여군의경우 SHAM군보다 활성이 감소하여 난소절제로 인한 골 손실정도를 완화시켜준 것으로 추측된다.
- Slop (Ω/min)은 응집 유도물질인 콜라겐을넣은 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 말하며 이때응집의 진행과 함께 혈소판이 platinum electrodes에 부착됨으로써 발생하는 전기저항(impedance: Ω)의 크기를 혈소판응집치로 나타낸다. 난소절제로 인해 OVX-CON군이 비 난소절제군인 SHAM군과 비교하여 Slop가 증가하였지만 방풍 에탄올 추출물 투여군에서 OVX-CON군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타냈다. 이것은 방풍 에탄올 추출물의 투여가 혈전이나 thrombus의 생성을 막아 혈소판 응집을 억제하는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서도 난소 절제군인 OVX-CON군과 비 난소 절제군(SHAM)을 비교하였을 때 난소절제에 의한 체중 증가 현상이 나타났다. 또한, 난소절제 후 방풍 에탄올 추출물을 투여한 모든 군에서 SHAM 과 비교해 높은 체중 증가를 나타내었다. 이는 SHAM군에 비해 난소절제 군의 사료섭취량 증가로 인해 체중 증가를 초래한 것으로 추측된다.
- 혈중 HDL-콜레스테롤 농도의 증가는 혈관내피세포의 기능장애를 방지하며, 세포내의 접착물질(adhe- sion molecule)로 인한 세포의 증식을 감소시킨다고 보고되어있다[8, 40]. 또한, 혈청 중의 중성 지질 함량 또한 난소절제에의해 증가하였고, 방풍 에탄올 추출물 투여군에서 OVX-CON 에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 방풍 에탄올 추출물이 에스트로겐 유사활성을 나타내어 혈 중 지질함량을 개선하는 것으로 사료되며, 심혈관 질환의 위험률을 저하시킬 수 있는 소재 개발로의 가능성이 기대된다.
- 그러나 각 군의 자궁 무게에서는 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군과 비교하여유의적으로 낮은 자궁무게를 나타내었으며, 이는 난소 절제로 인한 자궁의 퇴화로 인한 것으로 추측된다. 방풍 에탄올 추출물 투여군은 OVX-CON군과 비교하여 자궁 무게가 증가하는 결과가 나타났으나, SHAM군의 수준에는 미치지 못하여 방풍 추출물이 자궁무게의 회복에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 한편, Gale와 Sclafanie 난소절제는 식이 섭취량과식이효율을 증가시켜 과식증(hyperphagia)과 비만을 야기한다고 보고하였으며[11], 이[20]등은 난소를 절제한 실험동물의체중과 체지방 무게의 증가를 보고하였다. 본 연구에서도 난소 절제군인 OVX-CON군과 비 난소 절제군(SHAM)을 비교하였을 때 난소절제에 의한 체중 증가 현상이 나타났다. 또한, 난소절제 후 방풍 에탄올 추출물을 투여한 모든 군에서 SHAM 과 비교해 높은 체중 증가를 나타내었다.
- 연골의경우 비 난소절제군인 SHAM군에 비해 난소절제군인 OVX- CON군의 collagen 함량이 감소하였으나, 방풍 에탄올 추출물을 투여함으로써 OVX-LS200 군에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 골 조직에서 또한 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군과 비교해 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다.
- 골 조직에서 또한 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군과 비교해 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다. 한편, 난소를 절제한 후 방풍 추출물을 50 ㎎/㎏/day 투여한 OVX-LS50군에서는 대조군에 비해 collagen 함량이 증가하는 경향이 나타났으며, 200 ㎎/㎏/ day 투여한 OVX-LS200군의 경우 유의적으로 증가하였다. 따라서 골 조직의 collagen 합성에는 추출물의 양을 50보다 200 ㎎/㎏/day 정도는 투여해야 할 것으로 추측된다.
- 않았다. 한편, 방풍 에탄올 추출물 투여군에서는 난소절제로 인하여 그 활성이 증가된 OVX-CON군에 비해 활성이 감소하는 경향을 나타내었으며, 200 ㎎/㎏/day 투여군의경우 SHAM군보다 활성이 감소하여 난소절제로 인한 골 손실정도를 완화시켜준 것으로 추측된다.
- 이는 SHAM군에 비해 난소절제 군의 사료섭취량 증가로 인해 체중 증가를 초래한 것으로 추측된다. 한편, 식이효율에 있어서는 OVX-CON군은 SHAM군에 비해 유의적으로 높은 결과를 나타내었으나, 난소 절제 후 방풍 에탄올 추출물을 투여한 군에서는 SHAM 군의 수준에는 미치지 못하나 OVX-CON군에 비해 식이효율이 감소한 것으로 나타났다.
- Starzec와 Berger 등은 난소절제가 혈장 콜레스테롤을 증가시켰다고 보고하였고, 난소절제에 의한 에스트로겐 수준저하는 lipoprotein li- pase (LPL)과 lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT)를활성화시켜 LDL-콜레스테롤 합성을 증가시킴으로써 고콜레스테롤혈증을 일으킨다고 하였다[31]. 한편, 혈청 중의 HDL- 콜레스테롤의 농도는 방풍 에탄올 추출물 50 ㎎/㎏/day 투여군에서는 OVX-CON군보다 유의적으로 증가하는 것으로나타난 반면 SHAM군 수준에는 미치지 못하였으나, 200 mg/ kg/day 투여군에서는 SHAM군 수준의 HDL-콜레스테롤 함량을 나타내었다. 혈중 HDL-콜레스테롤 농도의 증가는 혈관내피세포의 기능장애를 방지하며, 세포내의 접착물질(adhe- sion molecule)로 인한 세포의 증식을 감소시킨다고 보고되어있다[8, 40].
- 것으로 나타났다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량 또한난소절제로 인해 증가하였으나, 방풍 에탄올 추출물 투여로 SHAM 수준으로 감소하는 결과가 나타났다. Starzec와 Berger 등은 난소절제가 혈장 콜레스테롤을 증가시켰다고 보고하였고, 난소절제에 의한 에스트로겐 수준저하는 lipoprotein li- pase (LPL)과 lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT)를활성화시켜 LDL-콜레스테롤 합성을 증가시킴으로써 고콜레스테롤혈증을 일으킨다고 하였다[31].
- 혈청 내 총 콜레스테롤의 경우 난소절제군인 OVX-CON이 비 난소절제 대조군인 SHAM군에 비해 증가하였으며, 난소 절제 후 방풍 에탄올 추출물에 의해 유의적으로감소하는 것으로 나타났다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량 또한난소절제로 인해 증가하였으나, 방풍 에탄올 추출물 투여로 SHAM 수준으로 감소하는 결과가 나타났다.
후속연구
- 방풍 에탄올 추출물 투여한 경우, 200 ㎎/㎏/day 투여군인 OVX-LS200 군의 경우 OVX-CON군에 비해 lag time이 연장되어 혈소판 응집이 지연되는 결과가 나타났다. 따라서 방풍 에탄올 추출물이 난소절제로 인한 혈소판 응집 억제 효과를 나타내었으며, 이러한 결과로 미루어 방풍 에탄올 추출물이 혈소판 응집 저해 효과가 있을 것으로 기대된다.
- 또한, 혈청 중의 중성 지질 함량 또한 난소절제에의해 증가하였고, 방풍 에탄올 추출물 투여군에서 OVX-CON 에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 방풍 에탄올 추출물이 에스트로겐 유사활성을 나타내어 혈 중 지질함량을 개선하는 것으로 사료되며, 심혈관 질환의 위험률을 저하시킬 수 있는 소재 개발로의 가능성이 기대된다.
- 따라서 골 조직의 collagen 합성에는 추출물의 양을 50보다 200 ㎎/㎏/day 정도는 투여해야 할 것으로 추측된다. 이상의 결과로부터 연골 및 골 조직에서 난소절제로 인하여 감소된 결합조직 중의 collagen 함량은 에스트로겐 부족으로 인한 골손실의 예방에 방풍 에탄올 추출물 투여가 유익한 효과를 가질 것으로 기대된다.
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