선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 사용된 기질인 bi-antennery 구조에 효과적으로 β1, 4-N-acetylglucosamine이 부과되는지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 실험 결과, PK-Con의 반응성은 35.
- 유선에서 이 효소의 추가적인 발현은 EPO와같은 치료용 당단백질이 더 많은 시알산을 함유할 것으로 생각된다. 하지만 돼지에서는 MGAT4A의 서열이나 기능이 명확히 알려져 있지 않기 때문에 본 연구에서 돼지로부터 MGAT4A를 동정하고 그 기능을 분석하고자 하였다.
제안 방법
- 5’-RACE에는 5’-anchor primer: 5’-CTCTTTCTC GAGGTTGGCT ACAACACC-3’와 GeneRacer 5’primer, 3’-RACE에는 3’-anchor primer: 5’-TGAAGGTCTACCAAGG ACATACACTGG-3’와 GeneRacer 3’primer를 각각 사용하여 수행하였다. 증폭된 RACE PCR산물은 agarose gel (Takara, Japan)에 전기영동 후, gel extraction kit (Qiagen, Germany) 로정제하여 TOPO-TA cloning kit (Invitrogen, USA)을 사용하여 cloning하였다.
- 5’-과 3’-RACE는 GeneRacer Kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 제시된 실험방법대로 실험을 수행하였으며 주형으로 사용한 total RNA는 돼지 liver에서 분리한 total RNA를 사용하여 수행하였다. 5’-RACE에는 5’-anchor primer: 5’-CTCTTTCTC GAGGTTGGCT ACAACACC-3’와 GeneRacer 5’primer, 3’-RACE에는 3’-anchor primer: 5’-TGAAGGTCTACCAAGG ACATACACTGG-3’와 GeneRacer 3’primer를 각각 사용하여 수행하였다.
- qPCR을 수행하였다. LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics, USA)를 사용하여 95°C에서 4분간 pre-incubation하였으며, 95°C에서 10초, 58 °C에서 5초, 72°C에서 4초의 조건으로 45cycles를 진행하였다. 돼지 MGAT4A를 위한 forward primer는 5’-CCACGTGGCA AAATGGGAAAG-3’이고, reverse primer는 5’-TACGCGTTT GAACTGCTGCAC-3’이다.
- 세포는 10% FBS (heat inactivated fetal bovine serum)와 50 units/ml의 penicillin, 50 μg/ml streptomycin을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) high glucose (Invitrogen, USA)에서 37˚C, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 돼지 HA-tagged MGAT4A 를 pcDNA3.1 vector의 EcoR V와 Not I 부위에 삽입 후 Pvu I을 이용하여 절단하였다. 절단된 vector는 lipofectamine (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포에 transfection하였고, 2주간 800 μg/ml의 G418 (Invitrogen, USA)을 사용하여 selection 하였다.
- 돼지 MGAT4A의 기능분석을 위하여, 돼지 신장세포인 PK- 15세포에 MGAT4A유전자를 과발현시켜 확인하였다. 분리된 세포들을 RT-PCR로 분석하여 MGAT4A 과발현 세포인 PK-p4A에서 MGAT4A의 발현이 PK-Con보다 높다는 것을 확인하였고(Fig.
- 돼지 MGAT4A의 서열을 동정하기 위하여, 다른 종들에서 알려진 MGAT4A의 서열을 비교하여 degenerated primer를 제작하였다. 제작된 forward primer는 5’- TGGTAYACNAC NTGGCARAAY-3’이고, reverse primer는 5’- YTCNARDAT NGCCCANACNGC -3’이다.
- 돼지 장기조직간 MGAT4A을 발현을 in vitro에서 비교하기 위하여 qPCR을 수행하였다. LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics, USA)를 사용하여 95°C에서 4분간 pre-incubation하였으며, 95°C에서 10초, 58 °C에서 5초, 72°C에서 4초의 조건으로 45cycles를 진행하였다.
- 이러한 결과는 MGAT4A가 세포내 단백질, 분비단백질의 구분 없이 당 사슬을 부과한다는 것을 알 수 있었다. 또한 DSA는 β1, 4-N-ace- tylglucosamine 구조 이외에도 polylactosamine 구조도 인지할 수 있어 대조군으로 polylactosamine 구조를 특이 적으로 인지할 수 있는 LEA를 사용하여 면역형광염색과 ELISA를 동시에 실시하였다. 실험 결과, LEA에 의한 인지는 두 세포에서 거의 검출되지 않았다.
- 또한 당사슬 기질반응을 통해 MGAT4A의 활성을 평가하였다[20]. 사용된 기질인 bi-antennery 구조에 효과적으로 β1, 4-N-acetylglucosamine이 부과되는지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다.
- 실험에 사용된 효소는 과발현된 세포로부터 M- PER buffer (Thermo, USA)를 이용, 추출하여 37°C에서 5시간 동안 반응하였다. 반응 후, 655 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 분석하였다.
- 분리된 total RNA 1 μg을 First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE healthcare, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다(동물실험승인번호: NIAS2015-593).
- 사람이나 소와 같은 동물의 MGAT4A의 유전자 서열은 이미 알려져 있기 때문에 GeneBank database에 등록되어 있는 염기서열정보들을 찾아 유전자들에 대한 상동성을 비교하여 돼지 MGAT4A유전자 동정을 위한 degeneration primer를 제작하였다. 제작된 primer를 사용하여 degeneration PCR 방법으로 MGAT4A유전자 클로닝을 시도하였고 증폭된 PCR 산물은 TA-클로닝을 실시하여 얻어진 클론들에 대한 염기서열을 확인하였다.
- 증폭된 RACE PCR산물은 agarose gel (Takara, Japan)에 전기영동 후, gel extraction kit (Qiagen, Germany) 로정제하여 TOPO-TA cloning kit (Invitrogen, USA)을 사용하여 cloning하였다. 선별된 DNA클론들은 sequencing을 실시하여 염기서열을 분석하였고 다른 종에서 알려진 MGAT4A 유전자 및 단백질과 비교하여 돼지 MGAT4A유전자를 동정하였다.
- 2% Triton-X 100)에서 1시간 동안 정치하였다. 이후 10μg/ml의 biotin-conjugated DSA와 Streptavidine-con- jugated Texas-red (1:2, 000 dilution)를 사용하여 형광표지를 하였다. 시약은 dilution buffer (PBS with 1% BSA and 0.
- 1 vector의 EcoR V와 Not I 부위에 삽입 후 Pvu I을 이용하여 절단하였다. 절단된 vector는 lipofectamine (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포에 transfection하였고, 2주간 800 μg/ml의 G418 (Invitrogen, USA)을 사용하여 selection 하였다. 이 후, 돼지 MGAT4A가 과발현 된 세포를 PK-p4A로, pcDNA3.
- 제작된 primer를 사용하여 degeneration PCR 방법으로 MGAT4A유전자 클로닝을 시도하였고 증폭된 PCR 산물은 TA-클로닝을 실시하여 얻어진 클론들에 대한 염기서열을 확인하였다. PCR에 의해 얻어진 유전자 파편은 ORF기준 67 번 염기부터 1572번 염기까지였고 다른 부위는 RACE 클로닝을 통해 5’-과 3’-UTR부위는 밝혀냈다(Fig.
- 주형으로 돼지 liver에서 분리한 total RNA로 합성한 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 조건은 94°C에서 3분간 pre-incubation하였으며, 94°C에서 30 초, 42°C에서 30초, 72°C에서 1분 30초의 조건으로 30 cycles을반응하였고, 72°C에서 5분간 반응을 추가로 진행하였다.
- 조직들에서 MGAT4A 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 우리는 qPCR을 통해 분석하였다. 성돈(adult pig) 에서는다른 조직들과 비교해서 간과 유선에서 그 발현 정도가 높았으며, 위나 소장, 방광에서는 발현이 매우 미약했다(Fig.
- 제작된 forward primer는 5’- TGGTAYACNAC NTGGCARAAY-3’이고, reverse primer는 5’- YTCNARDAT NGCCCANACNGC -3’이다. 주형으로 돼지 liver에서 분리한 total RNA로 합성한 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 조건은 94°C에서 3분간 pre-incubation하였으며, 94°C에서 30 초, 42°C에서 30초, 72°C에서 1분 30초의 조건으로 30 cycles을반응하였고, 72°C에서 5분간 반응을 추가로 진행하였다.
- 5’-RACE에는 5’-anchor primer: 5’-CTCTTTCTC GAGGTTGGCT ACAACACC-3’와 GeneRacer 5’primer, 3’-RACE에는 3’-anchor primer: 5’-TGAAGGTCTACCAAGG ACATACACTGG-3’와 GeneRacer 3’primer를 각각 사용하여 수행하였다. 증폭된 RACE PCR산물은 agarose gel (Takara, Japan)에 전기영동 후, gel extraction kit (Qiagen, Germany) 로정제하여 TOPO-TA cloning kit (Invitrogen, USA)을 사용하여 cloning하였다. 선별된 DNA클론들은 sequencing을 실시하여 염기서열을 분석하였고 다른 종에서 알려진 MGAT4A 유전자 및 단백질과 비교하여 돼지 MGAT4A유전자를 동정하였다.
- 클로닝된 돼지 MGAT4A의 기질반응성을 확인하기 위하여 Glycosyltransferase Activity Kit (R&D Systems, USA)를 사용하여 1 mM N-glycan core structure (bi-antennary)에 대한 200 μM UDP-GlcNAc (Sigma-Aldrich, USA) 활성반응을 측정하였다[21]. 실험에 사용된 효소는 과발현된 세포로부터 M- PER buffer (Thermo, USA)를 이용, 추출하여 37°C에서 5시간 동안 반응하였다.
- 05% Triton-X 100)를 사용하여 희석하였다. 핵은 1μg/ml의 DAPI 를 이용하여 염색하였고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 골지체는 BODIPY® TR ceramide (Invitrogen, USA)로, HA-tagged MGAT4A는 HA항체(SantaCruz, USA)를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
- 핵은 1μg/ml의 DAPI 를 이용하여 염색하였고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 골지체는 BODIPY® TR ceramide (Invitrogen, USA)로, HA-tagged MGAT4A는 HA항체(SantaCruz, USA)를 이용하여 확인하였다.
- 국립축산과학원에서 사육되고 있는 랜드레이스(Landrace) 돼지로부터 얻은 각 장기조직들은 Trizol (Invitrogen, USA)과 homogenizer로 분쇄하고 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA 1 μg을 First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE healthcare, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다(동물실험승인번호: NIAS2015-593).
- 돼지 MGAT4A를 위한 forward primer는 5’-CCACGTGGCA AAATGGGAAAG-3’이고, reverse primer는 5’-TACGCGTTT GAACTGCTGCAC-3’이다. 대조구로 사용된 β-actin을 위한 forward primer는 5’- CATCACCATCGGCAACGAGC -3’이고, reverse primer는 5’- TAGAGGTCCTTG CGGATGTC -3’ 이다.
- 돼지 MGAT4A의 기능분석을 위하여 돼지신장세포인 PK- 15 세포주를 사용하였다. 세포는 10% FBS (heat inactivated fetal bovine serum)와 50 units/ml의 penicillin, 50 μg/ml streptomycin을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) high glucose (Invitrogen, USA)에서 37˚C, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과는 SAS 9.2를 이용하여 최소 유의차검정과 General Linear Models 절차를 이용한 Duncan’s mul- tiple range test을 적용하였으며, p<0.05 수준에서 유의차를 검정하였다.
성능/효과
- Type II membrane topology는 거의 모든 당 전이 효소에서 나타나는 공통적인 특징이며 돼지 MGAT4A도 Type II mem- brane topology의 특징을 가진다는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 또한 hydrophobic score도 알려진 다른 종들의 MGAT4A 단백질과 대부분 일치하는 것을 확인하였다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 DSA를 이용하여 면역염색을 실시하였으며, PK-p4A에서 PK-Con보다 더 강하게 DSA가 염색이 되는 결과를 얻었다(Fig. 4C). 이는 MGAT4A의 발현이 PK-15 세포에서 β1, 4-N-acetylglucosamine 구조 증가에 영향을 주었음을 보여주는 결과이며 또한, 배양배지를 이용한 ELISA 결과도 PK-p4A에서 약 1.
- 2B). 또한 hydrophobic score도 알려진 다른 종들의 MGAT4A 단백질과 대부분 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 이러한 결과들을 통해, MGAT4A유전자가 종간 보존성이 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다.
- 아미노산 서열은 다른 종들과 90%가 넘는 상동성을 보였으며,특히 사람과 쥐(rat)와의 상동성은 96%로 가장 높았다. 또한 계통분석을 통해 소와 유전적 연관성이 가장 가깝다는 것을 확인하였다(Fig. 2A).
- 분리된 세포들을 RT-PCR로 분석하여 MGAT4A 과발현 세포인 PK-p4A에서 MGAT4A의 발현이 PK-Con보다 높다는 것을 확인하였고(Fig. 4A), 면역형광염색을 통해 단백질로의 번역 또한 확인하였다. 이 때, 대부분의 당 전이효소가 골지체에서 그 역할을 수행하기 때문에 골지체를 함께 염색하여 분석한 결과 MGAT4A효소도 골지에 위치한다는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
- 또한 DSA는 β1, 4-N-ace- tylglucosamine 구조 이외에도 polylactosamine 구조도 인지할 수 있어 대조군으로 polylactosamine 구조를 특이 적으로 인지할 수 있는 LEA를 사용하여 면역형광염색과 ELISA를 동시에 실시하였다. 실험 결과, LEA에 의한 인지는 두 세포에서 거의 검출되지 않았다.
- 사용된 기질인 bi-antennery 구조에 효과적으로 β1, 4-N-acetylglucosamine이 부과되는지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 실험 결과, PK-Con의 반응성은 35.5±15.43 pmol/min/mg, PK-p4A의 반응성은 133.77±11.09 pmol/ min/mg으로 측정되어 PK-p4A이 PK-Con보다 기질에 대한 반응성이 3배 이상 높았다(Fig. 4E).
- 1B), 다른 종들과도 높은 상동성을 보였다. 아미노산 서열은 다른 종들과 90%가 넘는 상동성을 보였으며,특히 사람과 쥐(rat)와의 상동성은 96%로 가장 높았다. 또한 계통분석을 통해 소와 유전적 연관성이 가장 가깝다는 것을 확인하였다(Fig.
- 4C). 이는 MGAT4A의 발현이 PK-15 세포에서 β1, 4-N-acetylglucosamine 구조 증가에 영향을 주었음을 보여주는 결과이며 또한, 배양배지를 이용한 ELISA 결과도 PK-p4A에서 약 1.3배 β1, 4-N-acetylglucos- amine 구조가 증가했음을 보여 주었다(Fig. 4D). 이러한 결과는 MGAT4A가 세포내 단백질, 분비단백질의 구분 없이 당 사슬을 부과한다는 것을 알 수 있었다.
- 4D). 이러한 결과는 MGAT4A가 세포내 단백질, 분비단백질의 구분 없이 당 사슬을 부과한다는 것을 알 수 있었다. 또한 DSA는 β1, 4-N-ace- tylglucosamine 구조 이외에도 polylactosamine 구조도 인지할 수 있어 대조군으로 polylactosamine 구조를 특이 적으로 인지할 수 있는 LEA를 사용하여 면역형광염색과 ELISA를 동시에 실시하였다.
- 2B). 이러한 결과들을 통해, MGAT4A유전자가 종간 보존성이 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다.
- 1A). 클로닝된 1863 개 염기서열 중 돼지 MGAT4A의 open reading frame (ORF) 은 535개의 아미노산을 구성하는 1638개의 nucleotide로 구성되어 있으며(Fig. 1B), 다른 종들과도 높은 상동성을 보였다. 아미노산 서열은 다른 종들과 90%가 넘는 상동성을 보였으며,특히 사람과 쥐(rat)와의 상동성은 96%로 가장 높았다.
후속연구
- 하지만 아직까지도돼지에서는 많은 당 전이효소들이 명확히 알려져 있지 않다. 유선세포에서 발현되는 당 전이효소의 기능 분석은 돼지를 생체반응기로써 이용하는데 있어서 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다.
- 이번에 클로닝한 MGAT4A는 2-4 branched triantennary N-glycan을 구성하는 효소이므로 단백질 말단에 최대한으로 당 사슬을 늘리기 위해서는 추가적으로 유선내 MGAT5도 발현이 필요할 것으로 생각된다. MGAT5는 α1, 6-mannose에 N-acetylglucosamine의 β1, 6 연결을 촉매하는 효소로 N-형 당 사슬의 tetraantennary를 만드는 효소이다[4].
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.