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문제 정의
- 본 연구에서는 김치를 비롯한 전통 발효식품으로부터 젖산균을 분리하고, β-glucosidase[30], β-glucuronidase[2], β-xylosidase[19], β-galactosidase[26], β-arabinofuranosidase[18], β-arabinopyranosidase[31], β-arabinosidase[8] 등 기존에 알려진 생물전환과 관련된 효소의 활성을 평가하여 우수 젖산균을 선발하였다. 선발된 젖산균을 녹차 추출물의 발효에 적용한 후 카테킨의 함량 변화를 조사하였고, 카테킨 중 EGC의 함량을 유의적으로 증대시키는 균주를 선정한 후 배양조건에 따른 생육특성을 조사하여 최적배양 조건을 위한 기초자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- Leuconostoc mesenteroides MBE1424 균주의 생육 특성을 조사하기 위하여 배양 온도와 배지의 초기 pH를 조절하여 배양하였다. MBE1424 균주를 다양한 온도에서 배양하고 비성장속도를 측정하였는데 40℃에서 비성장속도가 0.
- 본 연구에서 분리된 MBE1424 균주는 문헌에 보고된 기존의Leuconostoc mesenteroides 균주보다 열내성이 우수한 균주로 판단되며 산업적 이용이 기대된다. MBE1424 균주를 초기 pH가 조절된 MRS 배지에서 배양하고 비성장속도를 측정하였다(Fig. 1B). 배지의 초기 pH를 6 또는 8로 조절하였을 때, 유사한 수준의 비성장속도를 나타냈으며, pH 4로 조절한 MRS배지에서 비성장속도가 0.
- C에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕배양한 후 원심분리하여 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 녹차추출물은 고형분의 농도가 100 mg/ml이 되도록 멸균 증류수에 현탁한 후, 전배양한 젖산균을 초기 세포농도(OD600)가 1.0이 되도록 접종하였다. 균주를 접종하고 일부를 회수하여 발효전 시료로서 -80℃에 보관하였으며, 나머지는 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하여 발효물을 제조한 후 -80℃에 보관하였다.
- 초임계 추출기의 압력은 80 bar, 추출온도는 70℃로 설정하였다. 멸균 증류수로 희석한 주정(80%, v/v)을 보조용매로 사용하였으며 10 ml/min의 유속으로 35분간 추출기로 투입하여 녹차 추출물을 침지하였다. 이산화탄소와 보조용매를 각각 70 ml/min, 10 ml/min의 유속으로 150분간 투입하여 녹차를 추출하였다.
- 본 연구에서는 김치를 비롯한 전통 발효식품으로부터 젖산균을 분리하고, β-glucosidase[30], β-glucuronidase[2], β-xylosidase[19], β-galactosidase[26], β-arabinofuranosidase[18], β-arabinopyranosidase[31], β-arabinosidase[8] 등 기존에 알려진 생물전환과 관련된 효소의 활성을 평가하여 우수 젖산균을 선발하였다.
- 발효식품으로부터 분리된 젖산균은 효소활성을 측정한 후 가장 우수한 효소활성을 나타낸 젖산균을 박 등[22]이 보고한 방법으로 동정하였다. 선발한 균주의 생육특성을 조사하기 위하여 배양 온도 및 배지의 초기 pH를 조절하고 비성장속도를 비교하였다. MRS배지 초기 pH는 2 N HCl 또는 2 N NaOH를 사용하여 조절하였다.
- 선발한 젖산균을 이용하여 초임계 녹차추출물의 발효물을 제작하고 젖산균 발효에 의한 EGCG, EGC, ECG, EC 등 카테킨의 함량 변화를 측정하였다(Table 2). EGCG, ECG, EC의 함량은 젖산균 발효에 의하여 유의적인 변화는 없었으나, EGC의 함량은 9종의 젖산균 발효에 의하여 모두 유의적으로 증가하였다.
- 멸균 증류수로 희석한 주정(80%, v/v)을 보조용매로 사용하였으며 10 ml/min의 유속으로 35분간 추출기로 투입하여 녹차 추출물을 침지하였다. 이산화탄소와 보조용매를 각각 70 ml/min, 10 ml/min의 유속으로 150분간 투입하여 녹차를 추출하였다. 추출물은 60℃에서 농축한 후 동결 건조하여 분말형태의 초임계 녹차추출물을 제작하였다.
- 전통발효 식품으로부터 젖산균을 분리하고, β-glucosidase, β-glucuronidase, β-xylosidase, β-galactosidase, β-arabinofuranosidase, β-arabinosidase, β-arabinopyranosidase등 생물전환과 관련된 유용 효소활성을 조사하였다.
- 젖산균 배양액 중의 단백질 농도는 Bradford Dye Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 적정 농도로 희석된 bovine serum albumin(BSA, Bio-Rad)을 이용하여 검량선을 작성하였다. 발효식품으로부터 분리된 젖산균은 효소활성을 측정한 후 가장 우수한 효소활성을 나타낸 젖산균을 박 등[22]이 보고한 방법으로 동정하였다.
- 이산화탄소와 보조용매를 각각 70 ml/min, 10 ml/min의 유속으로 150분간 투입하여 녹차를 추출하였다. 추출물은 60℃에서 농축한 후 동결 건조하여 분말형태의 초임계 녹차추출물을 제작하였다.
- 전통발효 식품으로부터 젖산균을 분리하고, β-glucosidase, β-glucuronidase, β-xylosidase, β-galactosidase, β-arabinofuranosidase, β-arabinosidase, β-arabinopyranosidase등 생물전환과 관련된 유용 효소활성을 조사하였다. 효소활성 평가를 통하여 선발된 9점의 젖산균 발효에 의한epigallocatechin-3-gallate(EGCG), epigallocatechin(EGC), epicatechin gallate(ECG), 및 epicatechin(EC)의 함량 변화를 조사하였다. 배추 김치에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides MBE1424로 명명된 균주는 발효에 의하여 카테킨 중 EGC의 함량을 약 60% 증가시켰으며, 배양온도40℃에서 가장 우수한 비성장속도를 나타내어 기존에 보고된 균주보다 상대적으로 내열성이 우수한 것으로 판단되었다.
대상 데이터
- 강원도를 포함한 전국에서 수집된 김치를 비롯한 총 40점의 발효식품으로부터 젖산균을 분리하기 위하여 채취된 시료를 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl)에 현탁한 후, 적정농도로 희석하여 MRS(deMan, Rogosa and Sharpe medium, BD, Detroit, MI, USA) 평판배지에 도말하고 30oC에서 48시간 동안 배양하였다. 단일집락을 bromocresol purple(0.
- 1%(v/v)의 acetic acid와 acetonitrile의 비율이 15:85−30:70(v/v)이 되도록 농도구배를 설정하고 1 ml/min의 유속으로 흘려주었다. 검출기로 photodiode array detector(Waters)를 사용하였으며, 상업적으로 판매되는 카테킨(EGCG, ECG, ECG, EC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 구입하여 정량 분석을 위한 표준물질로 사용하였다.
- 경상남도 사천시에서 2015년도에 수확한 녹차 150 g에1,000 ml의 주정(95%, Korea Ethanol Supplies Company, Seoul, Korea)을 첨가하고 (주)다당앤에서 자체 제작한 초임계 추출장치에 투입하였다. 초임계 추출기의 압력은 80 bar, 추출온도는 70℃로 설정하였다.
- 녹차추출물은 150 g의 녹차를 초임계 추출장비에 투입하여 주정을 보조용매로 사용하여 제작하였다. 초임계 녹차추출물은 60℃에서 농축하고 동결 건조하여 최종 54 g의 초임계 추출 녹차분말을 회수하여 약 36%의 회수율을 나타냈다.
- 발효에 의하여 EGC의 함량을 가장 현저히 증가시킨MBE1424 균주를 Leuconostoc mesenteroides MBE1424로 명명하고 한국미생물보존센터에 기탁하였다(KCCM43175). 카테킨 중 EC은 본 연구에서 사용한 대다수의 젖산균 발효물에서 함량이 다소 감소하는 경향을 나타났으나, MBE1424균주를 이용하여 제작한 발효물에서는 함량이 약 8% 증가하였다.
- 전국에서 수집된 발효식품으로부터 156 종의 젖산균을 분리하고 β-glucosidase, β-galactosidase, β-arabinosidase 등의 효소활성을 측정하여 우수한 효소활성을 나타낸 9 종의 젖산균을 선발하였다(Table 1).
이론/모형
- 젖산균 배양액 중의 단백질 농도는 Bradford Dye Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 적정 농도로 희석된 bovine serum albumin(BSA, Bio-Rad)을 이용하여 검량선을 작성하였다. 발효식품으로부터 분리된 젖산균은 효소활성을 측정한 후 가장 우수한 효소활성을 나타낸 젖산균을 박 등[22]이 보고한 방법으로 동정하였다. 선발한 균주의 생육특성을 조사하기 위하여 배양 온도 및 배지의 초기 pH를 조절하고 비성장속도를 비교하였다.
- 분리한 젖산균은 MRS 배지를 사용하여30oC에서 24시간 배양한 후 β-glucosidase (E.C. 3.2.1.21)와 β-xylosidase(E.C. 3.2.1.37) 효소활성은 장 등[11, 12]의 방법으로, β-glucuronidase (E.C. 3.2.1.31), β-arabinosidase (E.C. 3.2.1.88), β-arabinofuranosidase(E.C. 3.2.1.55), β-galactosidase(E.C. 3.2.1.23), β-arabinopyranosidase(E.C. 3.2.1.99)는 문헌에 보고된 방법[3, 9, 28, 31, 34]을 이용하여 세포 외 효소활성을 측정하였다.
성능/효과
- β-Glucosidase 활성이 우수한 것으로 나타난 MBE1456과 MBE1982 균주는 Lactobacillus plantarum과 16S rDNA 유전자 염기서열이 100% 상동성을 나타냈다.
- β-arabinofuranosidase, β-galactosidase, β-arabinopyranosidase, β-xylosidase 효소활성이 우수한 균주로 선발된 MBE1518, MBE1558, MBE1563, MBE1573 균주는 각각 Pediocccus pentosaceus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sp., Leuconostoc lactis로 동정되었다.
- 선발한 젖산균을 이용하여 초임계 녹차추출물의 발효물을 제작하고 젖산균 발효에 의한 EGCG, EGC, ECG, EC 등 카테킨의 함량 변화를 측정하였다(Table 2). EGCG, ECG, EC의 함량은 젖산균 발효에 의하여 유의적인 변화는 없었으나, EGC의 함량은 9종의 젖산균 발효에 의하여 모두 유의적으로 증가하였다. 그 중에서도 MBE1424, MBE1429 및MBE1440 균주에 의한 발효물에서 EGC의 함량이 각각60%, 50%, 38% 증가하였다.
- Leuconostoc mesenteroides MBE1424 균주는 배추김치에서 분리되었고, 세포 외 β-glucuronidase(0.59 ± 0.19 unit/mg protein) 효소활성이 분리된 균주 중에서 가장 우수하였으며, MBE1429와 MBE1440 균주는 각각 β-arabinosidase, β-arabinofuranosidase 효소활성이 우수하였다.
- 배추 김치에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides MBE1424로 명명된 균주는 발효에 의하여 카테킨 중 EGC의 함량을 약 60% 증가시켰으며, 배양온도40℃에서 가장 우수한 비성장속도를 나타내어 기존에 보고된 균주보다 상대적으로 내열성이 우수한 것으로 판단되었다. Leuconostoc mesenteroides 균주는 녹차 추출물의 생물전환에 필요한 유용한 효소계를 보유하고 있는 것으로 추정되었다.
- MBE1424 균주를 다양한 온도에서 배양하고 비성장속도를 측정하였는데 40℃에서 비성장속도가 0.99 ± 0.05(1/h)로 상대적으로 가장 우수하였다(Fig. 1A).
- EGCG, ECG, EC의 함량은 젖산균 발효에 의하여 유의적인 변화는 없었으나, EGC의 함량은 9종의 젖산균 발효에 의하여 모두 유의적으로 증가하였다. 그 중에서도 MBE1424, MBE1429 및MBE1440 균주에 의한 발효물에서 EGC의 함량이 각각60%, 50%, 38% 증가하였다. 박 등[23]은 1종의 Lactobacillus graminis, 2종의 Leuconostoc mesenteroides 등의 젖산균을 이용하여 녹차 추출물을 발효하였으나, EGC의 함량은 증가하지 않았다.
- 배지의 초기 pH를 6 또는 8로 조절하였을 때, 유사한 수준의 비성장속도를 나타냈으며, pH 4로 조절한 MRS배지에서 비성장속도가 0.59 ± 0.03(1/h)으로 다른 pH에서 보다 상대적으로 가장 낮은 수준을 나타내었다.
- 효소활성 평가를 통하여 선발된 9점의 젖산균 발효에 의한epigallocatechin-3-gallate(EGCG), epigallocatechin(EGC), epicatechin gallate(ECG), 및 epicatechin(EC)의 함량 변화를 조사하였다. 배추 김치에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides MBE1424로 명명된 균주는 발효에 의하여 카테킨 중 EGC의 함량을 약 60% 증가시켰으며, 배양온도40℃에서 가장 우수한 비성장속도를 나타내어 기존에 보고된 균주보다 상대적으로 내열성이 우수한 것으로 판단되었다. Leuconostoc mesenteroides 균주는 녹차 추출물의 생물전환에 필요한 유용한 효소계를 보유하고 있는 것으로 추정되었다.
- 본 연구를 통하여 배추김치로부터 β-glucuronidase 효소활성이 우수한 Leuconostoc mesenteroides MBE1424 균주를 분리하였으며, 이 균주는 녹차 추출물의 카테킨 중 EGC의 함량을 약 60% 증가시켰으며, 대조구 균주와 비교하여 상대적으로 내열성이 우수하였다.
- 분리된 젖산균 중 β-glucuronidase 효소활성이 우수한 것으로 나타난 MBE1424로 명명된 균주와 β-arabinosidase, β-arabinofuranosidase효소활성이 각각 우수하였던 MBE1429, MBE1440 균주는 기존에 보고된 Leuconostoc mesenteroides와 16S rDNA 유전자의 염기서열이 99% 이상의 상동성을 나타내었다.
- 젖산균을 이용한 초임계 녹차 추출물 발효에서 β-glucuronidase 효소활성이 우수하였던 MBE1424로 명명된Leuconostoc mesenteroides 균주가 녹차의 카테킨 함량을 증대시키는 것으로 나타났으며 녹차 추출물 발효공정에 가장적합한 균주로 판단되었다.
- 녹차추출물은 150 g의 녹차를 초임계 추출장비에 투입하여 주정을 보조용매로 사용하여 제작하였다. 초임계 녹차추출물은 60℃에서 농축하고 동결 건조하여 최종 54 g의 초임계 추출 녹차분말을 회수하여 약 36%의 회수율을 나타냈다.
- 발효에 의하여 EGC의 함량을 가장 현저히 증가시킨MBE1424 균주를 Leuconostoc mesenteroides MBE1424로 명명하고 한국미생물보존센터에 기탁하였다(KCCM43175). 카테킨 중 EC은 본 연구에서 사용한 대다수의 젖산균 발효물에서 함량이 다소 감소하는 경향을 나타났으나, MBE1424균주를 이용하여 제작한 발효물에서는 함량이 약 8% 증가하였다.
후속연구
- 배추김치에서 분리한 MBE1424 균주는 녹차에 함유된 카테킨 중에서 EGC의 함량을 증가시켰으며, 이러한 결과는 β-glucuronidase를 포함하는 생물전환계에 의하여 에스테르형 카테킨인 ECG와 EGCG가 가수분해되어 유리형태인 EGC의 함량이 증가하는 것으로 추정되며[29], 보다 명확한 원인을 규명하기 위한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 기존에 보고된Leuconostoc mesenteroides A02 균주는 30℃에서 가장 높은 성장속도를 나타냈으며[32], Leuconostoc mesenteroides JFY균주는 34℃ 이상에서 균주의 생육이 억제되었다[36]. 본 연구에서 분리된 MBE1424 균주는 문헌에 보고된 기존의Leuconostoc mesenteroides 균주보다 열내성이 우수한 균주로 판단되며 산업적 이용이 기대된다. MBE1424 균주를 초기 pH가 조절된 MRS 배지에서 배양하고 비성장속도를 측정하였다(Fig.
- 초임계 녹차 추출물에 함유된 카테킨 중 EGC의 함량을 증가시키는 생물전환 효소계가 β-glucuronidase와 관련이 있을 것으로 추정되며, 선발 균주의 산업적 응용을 위하여 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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