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문제 정의
- paracasei와 같은 젖산균을 이용하여 제조한 사례[25, 32, 42]가 있으나, 이는 젖산균 특유의 산미와 이취 때문에 발효두유로서 음용하기에는 무리가 있다. 따라서 본 연구에서는 선행 발효두유의 특유의 산미와 이취를 개선시키고 두유의 영양학적 가치를 높이기 위한 기초 연구로서 한국 전통발효식품인 김치로부터 젖산균을 분리 및 동정하고 발효두유를 제조하여 특성을 살펴보았다.
가설 설정
- 선행 발효두유(대조구)와 분리균주로 발효한 두유를 콩취, 고소한 맛, 외관, 식감, 맛 선호도를 항목으로 하여 ‘1: 대단히 좋지 않다 2: 아주 좋지 않다 3: 보통으로 좋지 않다. 4: 약간 좋지 않다. 5: 좋지도 싫지도 않다.
- 4: 약간 좋지 않다. 5: 좋지도 싫지도 않다. 6: 약간 좋다 7: 보통으로 좋다.
제안 방법
- 배양된 분리균주를 API 50 CHL medium과 혼합한 뒤 스트립 튜브에 기포가 생기지 않게 분주하였다. 30℃에서 48시간 동안 호기적 배양 후 당 발효성에 따른 색 변화를 관찰하였다.
- 8: 아주 좋다 9: 대단히 좋다’ 항목으로 나누어 9점 평점법으로 두 가지의 발효두유를 평가하였다.
- API 50 CHL kit(bioMérieux sa, Marcy-l'Etoile, France)를 사용하여 분리 균주를 대상으로 49종의 탄수화물 이용성을 확인하였다.
- CO2 발생유무는 Durham tube이 들어간 시험관 MRS 액체배지에 분리된 균주를 준비된 시험관에 접종한 뒤 30℃에서 48시간 동안 배양하여 Durham tube 내의 가스 발생여부를 확인하였다.
- Catalase 실험은 분리된 균주를 slide glass에 옮기고 3% hydrogen peroxide(H2O2)를 2−3방울 떨어뜨려 산소발생 유무를 관찰하였다.
- 분리된 균의 염기서열은 chelex bead를 이용한 boiling 방법으로 genomic DNA를 추출하였으며, 균의 16S rRNA를 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR 산물은 Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(Applied biosystems, Lennik, Belgium)를 이용하여 ABI 3730XL DNA analyzer(Applied biosystems, Lennik, Belgium)로 염기서열을 분석하였다. 분석결과는 Genetyx program으로 pairwise alignment를 하여 GenBank에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 상동성을 비교하고 Bioedit program과 Mega software ver.
- W. koreensis KO3의 최적 배양 온도와 시간을 알기 위해 종 배양액을 MRS 배지에 1% 접종한 후 25℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃ 온도별로 24시간 동안 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다(Table 2).
- pH는 온도와 시간을 달리하여 발효한 두유를 homogenizer로 균질화한 후 pH-meter(pH-200L, Istek, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 국산대두 100 g을 25℃에서 6시간 물에 불린 다음 물기를 제거하고 증류수 800 ml를 넣고 마쇄 후 비지를 제거한 콩물을 121℃에서 15분간 살균시켜 두유를 제조하였다. 제조된 두유를 식힌 후 분리된 89주의 균주를 2% 접종하여 30℃에서 24시간 발효시켜 임의로 산미 이취를 생성하지 않는 균 3주를 분리했다.
- koreensis KO3로 명명하였다. 그리고 16S rRNA database를 토대로 유전학적 계통도를 작성하였다(Fig. 1).
- 김치 국물을 10-7 이상 희석한 각각의 시료를 MRS(Becton, Dickison and Company, New Jersey, USA) 한천 평판배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 서로 색깔, 모양이 다른 균락 89주를 분리하였다.
- 발효두유 제조를 위해 분리한 3주의 균(Strain No. R53, R83, R84)을 동정하기 위해 염기서열 분석 및 생화학적·형태학적 분석을 실시하였다.
- 분리된 균주는 24시간 종배양하고 MRS 액체배지에 1% 접종한 주 배양액을 실험에 사용하였다. 배양액을 25℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃의 온도로 24시간 3시간 간격으로 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리된 균의 염기서열은 chelex bead를 이용한 boiling 방법으로 genomic DNA를 추출하였으며, 균의 16S rRNA를 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR을 진행하였다.
- 시중에 판매되고 있는 김치와 가정에서 섭취하고 있는 김치를 수집하여 시료로 사용하였다. 수집한 시료의 김치 국물을 연속 희석하여 MRS(Becton, Dickison and Company, New Jersey, USA) 한천 평판배지에 도말한 후 30oC에서 24시간 동안 배양하여 서로 다른 형태의 균락을 분리하였다.
- 에탄올로 탈색 후 Safranin O로 30초간 대조염색 후 세척하여 광학현미경(×1,000)으로 관찰하였다.
- 이는 식품공전에서 명시된 발효유 유산균 기준 106 CFU/ml을 훨씬 넘는 수치였다. 온도 및 시간별 생균수를 비교하였을 때 발효두유 제조를 위한 최적 조건은 30℃, 12시간으로 정하였다.
- koreensis KO3은 25−37℃까지 잘 자랐으며, 3−12시간 사이에서 급격한 생장을 보이며 이후에는 점차 생장속도가 감소하여 24시간에서 가장 높은 생육을 나타내었다. 온도별, 시간별 생육도를 비교하였을 때 분리균주의 최적 배양 조건은 30℃, 9시간으로 정하였다.
- 국산대두 100 g을 25℃에서 6시간 물에 불린 다음 물기를 제거하고 증류수 800 ml를 넣고 마쇄 후 비지를 제거한 콩물을 121℃에서 15분간 살균시켜 두유를 제조하였다. 제조된 두유를 약 40℃까지 식힌 후 1차 분리된 89주를 2% 접종하여 30℃에서 24시간 발효시켜 임의로 산미 및 이취를 생성하지 않는 균 3주(Strain No. R53, R83, R84)를 선별하였다.
- 주사전자현미경(SEM) 이용하여 균의 형태를 관찰하기 위해 1시간 동안 2.5% glutaraldehyde로 전 고정 후 osmium teroxide로 1시간 후 고정하였다. 탈수는 ethanol 50, 60, 70, 90, 95, 100%를 단계별로 15분씩 탈수 후 hexamethldisilazane (HMDS)로 건조시킨 시료를 SEM(SEM, HITACHI S3500N, Japan)으로 관찰하였다.
- 일정한 농도로 희석한 여과액 1 ml, 5% phenol 1 ml, 그리고 진한황산 5 ml과 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총당 정량은 glucose를 일정농도로 희석 제조하여 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
- 최적 발효두유 조건 알아보기 위해 W. koreensis KO3 주 배양액을 두유에 2%씩 접종하여 온도별 시간별 생균수를 측정하였다(Table 3).
- 5% glutaraldehyde로 전 고정 후 osmium teroxide로 1시간 후 고정하였다. 탈수는 ethanol 50, 60, 70, 90, 95, 100%를 단계별로 15분씩 탈수 후 hexamethldisilazane (HMDS)로 건조시킨 시료를 SEM(SEM, HITACHI S3500N, Japan)으로 관찰하였다.
- 여과액을 일정량으로 희석하고 희석한 여과액 1 ml, 3,5-dinitrosalicylic aicd시약 3 ml을 혼합한 후 90℃ 항온수욕조에서 10분간 발색 후 냉각한 다음 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원당 정량은 glucose를 일정 농도별로 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
대상 데이터
- 그리고 이 그룹에서 가장 이취·산미를 가장 적게 생성한다고 판단되는 Strain No. R83을 본 실험 균주로 사용하였으며, 이를 W.koreensis KO3로 명명하였다. 그리고 16S rRNA database를 토대로 유전학적 계통도를 작성하였다(Fig.
-
시료
시중에 판매되고 있는 김치와 가정에서 섭취하고 있는 김치를 수집하여 시료로 사용하였다. 수집한 시료의 김치 국물을 연속 희석하여 MRS(Becton, Dickison and Company, New Jersey, USA) 한천 평판배지에 도말한 후 30oC에서 24시간 동안 배양하여 서로 다른 형태의 균락을 분리하였다.
데이터처리
- 5% 수준에서 분석분석(ANOVA)을 이용한 Duncan’s multiple range test 또는 paired t-test를 실시하여 유의적 차이를 검정하였다.
- 1 cycle sequencing kit(Applied biosystems, Lennik, Belgium)를 이용하여 ABI 3730XL DNA analyzer(Applied biosystems, Lennik, Belgium)로 염기서열을 분석하였다. 분석결과는 Genetyx program으로 pairwise alignment를 하여 GenBank에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 상동성을 비교하고 Bioedit program과 Mega software ver. 6.0을 이용하여 계통도를 나타내었다.
이론/모형
- 발효두유의 일반성분은 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조회분은 직접회화법, 조지방은 속실렛 추출법, 조단백질은 킬달증류법, 조섬유는 헨네베르크 스트오만개량법을 이용하여 분석[5]하였다.
- 총당은 phenol-sulfuric acid법[16]을 이용하였다. 동결건조된 두유분말을 산분해 반응시킨 후 여과하였다.
- 환원당은 DNS법[45]을 이용하였다. 두유분말을 증류수와 교반 후 10% trichloroacetic acid(v/v in water)를 소량 첨가하여 단백질을 침전시킨 후 여과하였다.
성능/효과
- 30℃에서 가장 빠른 생육을 나타내 12시간까지 발효했을 때 생균수가 8.71 × 108 CFU/ml로 가장 높았으며 그 이후에는 생균수가 비슷한 수준을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
- API 50 CHL kit를 이용하여 당 발효성을 관찰한 결과(Table 1) 3주의 균 모두 공통적으로 L-arabinose, D-ribose, D-glucose, D-mannose, N-acetylglucosamine, potassium 2-ketogluconate 이용하였으며 R53의 경우 D-galactose, R83의 경우 D-fructose, D-xylose, R84의 경우 D-xylose를 추가로 이용하여 발효하는 양상을 나타내었다. 일부 당 발효양상을 제외하고는 대체적으로 일치하였으며 이러한 결과는 Yu[59]가 분리한 W.
- W. koreensis KO3를 이용하여 30℃에서 12시간 발효한 두유의 아미노산 분석을 실시한 결과 총 27종의 아미노산 및 유도체들이 확인되었다(Table 6). 발효 전에 비해 대부분의 아미노산들은 유의적으로 증가, 감소하는 경향을 나타냈으며 필수 아미노산 중에서는 L-valine이 22.
- W. koreensis KO3은 25−37℃까지 잘 자랐으며, 3−12시간 사이에서 급격한 생장을 보이며 이후에는 점차 생장속도가 감소하여 24시간에서 가장 높은 생육을 나타내었다.
- 3과 같다. pH 및 산도는 발효시간 경과에 따라 유의적으로 감소하였으며 산도는 유의적으로 증가하는 경향을 보였다. 이는 젖산균 배양에서 일반적으로 관찰되는 유기산 생산에 따라 pH는 감소하고 산도는 증가하는 현상과 일치하였다.
- pH가 약 3.9−4.2, 산도는 0.64−1.12%인 선행연구의 발효두유[36, 37]에 비해서 낮은 산 생성능력을 갖기 때문에 젖산균 특유의 산미가 없는 것을 확인할 수 있었다.
- 4배 증가하였다. 그리고 L-arginine, asparagine, L-phenylalanine, Lleucine이 감소하여 젖산균이 이러한 유리아미노산들을 생육인자로 이용하는 것을 확인할 수 있었다.
- 발효한 두유와 발효 전 두유(대조구)의 총당 및 환원당 결과값은 Table 5에 나타내었다. 대조구에 비해서 총당은 거의 차이는 없었으나, 단당류, 엿당, 젖당 등에 속하는 환원당은 0.062%에서 0.052%로 약 16.1% 감소하였다. 이러한 차이는 유산균이 증식하면서 영양원으로 환원당을 이용하였기 때문이라는 보고와 유사하였다[36].
- 특히, 선행 발효두유와 비교해서 고소한 맛, 산미에 대해 큰 점수 차이를 나타냈으며, 외관과 식감에 있어서의 점수차이는 선행 발효두유의 경우 높은 산 생성으로 인해 커드를 생성하기 때문이라고 생각된다. 또한 콩취, 맛 선호도, 두유로서 전반적인 바람직성 항목에서도 개선된 평가를 얻었다. 따라서 이러한 관능검사 결과와 앞서 실시한 pH 및 산도 그리고 유리 아미노산 결과를 토대로 볼 때 W.
- 발효 전에 비해 대부분의 아미노산들은 유의적으로 증가, 감소하는 경향을 나타냈으며 필수 아미노산 중에서는 L-valine이 22.80 ± 0.80 mg/100 g으로 가장 높았으며 L-tryptophan은 검출되지 않았다.
- 발효 전과 발효 후 두유의 일반성분은 Table 4에 나타나있다. 발효 후 수분은 약 94.06%, 조회분은 0.18%, 조지방은 1.16% 조단백질은 2.71%, 조섬유 0.01%로서 조회분, 지방, 수분은 차이가 없지만 조단백질과 조섬유의 함량은 차이가 있었다. 발효 후 단백질의 경우 2.
- 본 실험의 arginine이 97.30 ± 1.16 mg/100 g에서 1.00 ± 0.50 mg/100 g 감소하였는데 이는 젖산균이 arginine deiminase(ADI) pathway를 통해 arginine을 분해하고 citrulline을 경유하여 ornithine, CO2, NH3를 생성한다고 알려져 있으며[6, 8], ornithine이 생성된 것으로 보아 본 실험균주가 ADI pathway를 통해 ornithine을 생성해냈다고 생각된다.
- 선별된 균주들의 형태학적 특성 생화학적 특성으로는 3주의 균 모두 gram positive, 포자를 형성하지 않는 구균 또는 단간균으로 관찰되었다. 그리고 당을 이용하여 CO2를 생성하였고 catalase negative 균으로 확인되었다.
- koreensis OK1-6의 당 발효양상 및 균주의 특성과 유사하였다. 염기서열 분석 결과 3주의 균은 W.koreensis 동정되었고, 당 발효 양상과 형태학적, 생화학적 분석 결과 차이가 거의 없기 때문에 최종적으로 3주의 균을 1개의 W. Koreensis 그룹으로 분류하였다. 그리고 이 그룹에서 가장 이취·산미를 가장 적게 생성한다고 판단되는 Strain No.
- 염기서열 분석에서, 선별균주와 표준 균주의 16S rRNA 상동성을 비교한 결과, 선별된 3주의 균들은 Weissella koreensis(accession number: CP002899)와 99% 일치하였다.
- 점수가 1−9점으로 값이 높을수록 우수한 관능을 나타내는데, 선행 발효 두유에 비해 모든 항목에서 개선된 평가를 얻었다.
후속연구
- 또한 콩취, 맛 선호도, 두유로서 전반적인 바람직성 항목에서도 개선된 평가를 얻었다. 따라서 이러한 관능검사 결과와 앞서 실시한 pH 및 산도 그리고 유리 아미노산 결과를 토대로 볼 때 W. koreensis KO3로 제조한 발효두유는 음료로서 적합하다고 여겨지며, 추후에 기능성 성분에 대한 분석이 더 이루어진다면 새로운 형태의 건강기능식품이 될 가능성이 있다고 생각된다.
- 50 mg/100 g 감소하였는데 이는 젖산균이 arginine deiminase(ADI) pathway를 통해 arginine을 분해하고 citrulline을 경유하여 ornithine, CO2, NH3를 생성한다고 알려져 있으며[6, 8], ornithine이 생성된 것으로 보아 본 실험균주가 ADI pathway를 통해 ornithine을 생성해냈다고 생각된다. 이외에도 W. koreensis의 ornithine 생성능에 관한 보고가 있어[59], 향후 젖산균의 ornithine을 생성 효소의 분리나 유전자에 대한 체계적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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