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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 비지로부터 젖산균을 분리, 동정하고, 분리한 젖산균의 콩 미세분말용액에서의 생육특성을 조사함으로써 비지의 젖산발효에 필요한 젖산균의 배양조건 확립 및 콩발효유 제조 가능성을 찾고자 한다.
제안 방법
- 존재하였다. MRS plate에서 생육된 유산균(LL, LS)만 순수 분리하여, MRS plate및 MRS 액체배지에서 활성화시켰다. MRS plate에서 LL과 LS균의 온도에 따른 생육정도는 Table 1과 같다.
- faecium LL이 두유발효에 우수한 능력이 있음을 확인한 후 비지로부터 분리한 유산균 Ent. faecium LL과 L. rhamnosus LS를 5%(w/v) 대두미 세분말용액과 5%(w/v) skim milk용액을 9 : 1, 4 : 1, 2 : 1 로 혼합한 용액에 접종하여 37°C에서 20시간 동안 배양시켰다. Fig.
- 도말하여 2회 측정 한 평 균값으로 구하였 다. pH는 pH-meter(Digital pH meter 110, 认出eaton)로 측정 하였으며 , 적정산도(%, titratable acidity)는 발효유에 phenolphthalein 지시약을 2〜3방울 떨어뜨린 후 0.1 N NaOH로 시료가 분홍색이 될 때까지 중화적정 하였으며 , 이 때 소모된 NaOH의 양으로부터 적정산도를 젖산의 양(%, w/v)으로 환산하였다(18).
- 형성된 colony의 크기를 기준으로 큰 colony(LL)와 작은 colony(LS)를 분리하였으며, 이를 MRS plate에서 streaking하여 순수분리하였다. 각각의 분리된 균주는 현미경으로 세균의 형태를 관찰하였으며, 그람염 색을 실시하였다(17). 균주의 동정은 Gram Positive Identification(GPI) card와 Analytical Profile Index(API) 50 CHL kit를 사용하여 실 시 하였다.
- 각각의 분리된 균주는 현미경으로 세균의 형태를 관찰하였으며, 그람염 색을 실시하였다(17). 균주의 동정은 Gram Positive Identification(GPI) card와 Analytical Profile Index(API) 50 CHL kit를 사용하여 실 시 하였다. 또한 대두미 세 분말/skim milk 혼합액에서 30°C에서 20시간 배양된 LS균주는 Scanning Electron Microscope(S-4200, Hitachi, Japan)를 이용해서 균의 형태를 관찰하였다.
- 대두미 세 분말 함량을 5%(w/v)로 조절하고 균질기 (Model-AM, Nihonseiki Kaisha Ltd, Japan)로 10, 000 rpm에서 1 분동안 균질화한 후 유리용기 에 50 mL씩 분주하여 121°C에서 15분간 가압멸균하였다. 37°C로 냉각시킨 후 젖산균을 각각 1% (v/v) 접종하고 37°C에서 20시간 동안 발효시 켰다.
- 37°C로 냉각시킨 후 젖산균을 각각 1% (v/v) 접종하고 37°C에서 20시간 동안 발효시 켰다. 대두미세분말/skim milk 혼합배지는 5%(w/v) 대두미세분말과 5%(w/v) skim milk를 9 : 1, 4 : 1, 2 : 1로 혼합한 후 위와 동일한 방법으로 살균하여 사용하였다.
- 대두미세분말을 5%(w/v) 고형분으로 하는 배지에 젖산균을 접종한 후 37°C에서 20시간 동안 배양하여 pH와 산도를 측정하였다. 대두미세분말용액의 초기 pH는 6.
- LS균 경우에는 GPI card에 의한 생화학적 반응으로부터 동질성 이 있는 그람양성균주를 결정할 수 없었다. 따라서 젖산균의 동정을 위해서 API 50 CHL kit에 의한 생화학적 특성조사를 하였으며 결과는 Table 3과 같다. LS균은 Lactobacillus rhamnosus오+ 99.
- 균주의 동정은 Gram Positive Identification(GPI) card와 Analytical Profile Index(API) 50 CHL kit를 사용하여 실 시 하였다. 또한 대두미 세 분말/skim milk 혼합액에서 30°C에서 20시간 배양된 LS균주는 Scanning Electron Microscope(S-4200, Hitachi, Japan)를 이용해서 균의 형태를 관찰하였다.
- rhamnosus LS로 확인되 었다. 분리 된 균을 대두미세분말용액에서 발효정도를 알아보기 위하여 pH, 산도, 생균수 및 유기산 함량을 측정하였다. Ent.
- 나타내었다. 분리된 균들의 생화학적 발효특성을 즉정하기 위하여 Vitek(Bio Merieux, France)과 GPI card를 이용하여 분석 하였다. LL균의 생화학적 특성은 Table 2와 같다.
- 30°C 배양기 에서 24시간동안 배양하였다. 형성된 colony의 크기를 기준으로 큰 colony(LL)와 작은 colony(LS)를 분리하였으며, 이를 MRS plate에서 streaking하여 순수분리하였다. 각각의 분리된 균주는 현미경으로 세균의 형태를 관찰하였으며, 그람염 색을 실시하였다(17).
대상 데이터
- 사용하였다. 발효유의 제조원료로는 skim milk(서울우유)와 전지활성생대두미세분말(micronized full-fat soy flour, MFS, Perican Co., Japan)을 혼합해가며 사용하였다. 젖산균으로는 Streptococcus thermophilusCKCTC 2185), Lacto bacillus bulgaricus(KCTC 3188)를 한국생명공학연구소에서 분양 받아 37°C에서 20시간 동안 5%(w/v) 전지 활성 생대두미세분말용액(이하 대두미세분말용액)과 5%(w/v) skim milk용액의 비율이 4 :1°1 되도록 조제한 액체배지에 2회 계대배양하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 비지는 (주)풀무원(경상남도 의령)으로부터 구입하여 500 g씩 비닐 pack에 개별 포장한 후 -20°C에서 냉동보관하면서 사용하였다. 발효유의 제조원료로는 skim milk(서울우유)와 전지활성생대두미세분말(micronized full-fat soy flour, MFS, Perican Co.
- , Japan)을 혼합해가며 사용하였다. 젖산균으로는 Streptococcus thermophilusCKCTC 2185), Lacto bacillus bulgaricus(KCTC 3188)를 한국생명공학연구소에서 분양 받아 37°C에서 20시간 동안 5%(w/v) 전지 활성 생대두미세분말용액(이하 대두미세분말용액)과 5%(w/v) skim milk용액의 비율이 4 :1°1 되도록 조제한 액체배지에 2회 계대배양하여 사용하였다.
- 45 Jim membrane filter(GelmanSciences)로 여과하여 HPLC 분석 용 시 료로 사용하였 다. 표준 유기 산으로는 oxalic acid, tartaric acid, lactic acid, acetic acid를 사용하였다. 분석 용 column 은 uBondapak Cis(300 mmx 3.
성능/효과
- rhamnosus LS를 5%(w/v) 대두미 세분말용액과 5%(w/v) skim milk용액을 9 : 1, 4 : 1, 2 : 1 로 혼합한 용액에 접종하여 37°C에서 20시간 동안 배양시켰다. Fig. 4에서 볼 수 있듯이 L. rhamnosus LS의 경우에 대두미 세분말용액에서는 산을 생성하지 못하였지 만 skim milk를 첨가한 용액 에서는 skim milk의 첨가비율이 증가할수록 산도가 증가하여 대두미세분말과 skim milk의 비율이 2 :1인 배지에서 1.05%로 가장높은 산도값을 보였다. 한편 5% 대두미세분말과 5% skim milk를 4 :1로 혼합한 용액에서도 산도 0.
- Gram염색 후에 현미경으로 관찰한 결과 LL과 LS균 모두 그람양성을 나타내었다. 분리된 균들의 생화학적 발효특성을 즉정하기 위하여 Vitek(Bio Merieux, France)과 GPI card를 이용하여 분석 하였다.
- 대두미세분말은 300 mesh의 콩 미세분말로서 현재는 전두부의 제조에 주로 활용되고 있다. L. rhamnosus LS는 발효배지로서 5% 대두미세분말용액을 이용하는 경우에 산생성 능력은 미 미하였지 만 생균수는 높은 값을 보였다(Fig. 4). 또한 배지 에 1% 수준의 glucose 또는 lactose의 첨 가로 발효유의 산생성이 급격하게 증가되면서 전형적인 curd를 형성하면서 대두 요구르트 제조에 활용될 수 있는 가능성을 보였다.
- MRS plate에서 LL과 LS균의 온도에 따른 생육정도는 Table 1과 같다. LL과 LS 모두 37°C에서 성장이 제일 양호하였으며, LL균은 50°C에서도 생육이 가능하였다. 반면에 LS균은 40°C에서는 생육이 가능하였지만 45°C에서는 LL균과는 달리 생육하지 못하였다.
- 따라서 젖산균의 동정을 위해서 API 50 CHL kit에 의한 생화학적 특성조사를 하였으며 결과는 Table 3과 같다. LS균은 Lactobacillus rhamnosus오+ 99.5%의 동질성을 갖는 것으로 동정되었다. SEM에 의 해 확인된 LS균은 길이가 1.
- Ent. faecium LL은 대 두미 세분말용액 에서 배양시에 대 체로 높은 산도값을 보였으나 skim milk의 첨가는 산생성에 효과가 없었다. 이는 Fig.
- ftiecium LL이 1.8 x IO, CFU/m丄로 가장 우수하였으며 S. thermophilus는 1.3 xlO9 CFU/mL, L. rhamnosus LS는 4.6 x 108 CFU/mL, L bulgaricus는 L9xi(f CFU/mL의 생균수를 보였다. 요구르트의 성분 규격에 의하면 신선한 액상 및 호상 요구르트의 유산균수를 각각 1(/〜 Ilf CFU/mL 이상으로 규정 하고 있는데 본 실험의 결과 그 이상의 생균수를 보였다.
- 다. 그러나 본 실험 에서는 비지의 현 탁액을 30°C 또는 37°C에서 20시간동안 발효시 켰기 때문에 비교적 고온에서 생육하는 고초균보다는 젖산균의 생육을 촉진시킬 수 있었고, 따라서 젖산균주의 분리가 용이했던 것으로 본다. 그러 나 오염 균 중에 는 점 질물질 생성 균을 포함한 고초균과 유사한 균들이 발견되었다.
- 4). 또한 배지 에 1% 수준의 glucose 또는 lactose의 첨 가로 발효유의 산생성이 급격하게 증가되면서 전형적인 curd를 형성하면서 대두 요구르트 제조에 활용될 수 있는 가능성을 보였다. 특히 5% 수준의 대두미 세분말용액은 살균시킨 후에 대두발효유 제조를 위한 젖산균 스타터의 배양배지로서 적합함을 알 수 있었다.
- 6 x 108 CFU/mL, L bulgaricus는 L9xi(f CFU/mL의 생균수를 보였다. 요구르트의 성분 규격에 의하면 신선한 액상 및 호상 요구르트의 유산균수를 각각 1(/〜 Ilf CFU/mL 이상으로 규정 하고 있는데 본 실험의 결과 그 이상의 생균수를 보였다. 특히 비지에서 분리 된 Ent.
- 또한 배지 에 1% 수준의 glucose 또는 lactose의 첨 가로 발효유의 산생성이 급격하게 증가되면서 전형적인 curd를 형성하면서 대두 요구르트 제조에 활용될 수 있는 가능성을 보였다. 특히 5% 수준의 대두미 세분말용액은 살균시킨 후에 대두발효유 제조를 위한 젖산균 스타터의 배양배지로서 적합함을 알 수 있었다. 앞으로 대두미세분말용액에서 배양시킨 젖산균을 콩 관련 발효유 제품의 스타터로서 이용 가능성이 기대된다.
후속연구
- 특히 비지에서 분리 된 Ent. JZzecium LL이 두유발효에서 가장 높은 생균수와 산생성능력을 나타냄으로 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 본다.
- 3에서 대두미세분말용액 발효시 당첨가에 따른 산생성 효과가 없는 것과 같은 결과로 Ent. faecium LL은 대두의 발효성 당을 비교적 잘 이용하면서, 첨가된 skim milk의 유당에 의한 산생성 촉진효과가 없는 것은 앞으로 자세한 연구가 요구된다.
- 콩미 세분말은 전지 활성 생 대두미 세 분말(micronized full-fat soyflour)로서 현재 일본에서 생산된 제품이 수입되어 전두부제조에 이용되고 있다. 대두미세분말의 가공적성의 여러 장점 때문에 식품가공에서 유용한 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. 특히 콩발효식품의 제조시에 가격이 저렴한 대두미세분말을 젖산균 starter 배양배지로 활용한다면 경제적 인 면에서도 매우 도움이 될 것으로 기대된다.
- 반면 에 생육조건이 비교적 까다로운 젖산균을 이용한 비지의 젖산발효에 관한 연구는 매우 미흡한 실정이며, probiotics로서 젖산균에 의한 비지의 발효는 비지의 저장성, 영양성 및 기능성을 증진시킴으로써 식품 및 생물소재로서 활용이 기대된다. 따라서 비지에 존재하는 미생물로부터 유용젖산균을 분리하여 이를 콩발효유 또는 비지의 발효에 이용한다면 산업적으로 유용할 것이다.
- pullorum, Sta aureus 등에 대하여 생육저 해효과가 있는 probiotics 생산균주로 알려지면서 다양한 연구들이 진행되고 있다(21-23). 따라서 비지에서 분리된 L. rhamnosus LS의 probiotics 및 기능성 다당류의 생산균주로서의 연구가 필요하며, 앞으로 콩 소재를 이용한 젖산발효에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 특히 5% 수준의 대두미 세분말용액은 살균시킨 후에 대두발효유 제조를 위한 젖산균 스타터의 배양배지로서 적합함을 알 수 있었다. 앞으로 대두미세분말용액에서 배양시킨 젖산균을 콩 관련 발효유 제품의 스타터로서 이용 가능성이 기대된다.
- 비지를 고초균에 의해서 띄우는 방법으로는 자연발효를 시키는데 2〜3일이 소요되므로 고초균에 의한 자연발효로서는 하루에 생산되는 수많은 양의 비지를 처리하기가 어려우며 독특한 발효냄새 때문에 이용이 제한적이다. 앞으로 비지 에서 분리된 젖산균(Ent. faecium LL, L. rhamnosus LS)을 대두유 발효와 비지 발효에 이용함으로써 일정량의 젖산과 젖산균을 포함하는 대두발효유 및 발효비지의 생산이 기대되며, 비지의 저장성의 향상은 물론 probiotics를 포함하는 기능성소재로서도 활용이 기대된다.
- 대두미세분말의 가공적성의 여러 장점 때문에 식품가공에서 유용한 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. 특히 콩발효식품의 제조시에 가격이 저렴한 대두미세분말을 젖산균 starter 배양배지로 활용한다면 경제적 인 면에서도 매우 도움이 될 것으로 기대된다.
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