B형 간염 바이러스는 간경변증과 간세포암의 원인이 되는 간섬유화를 유발한다. 하지만 현재까지 그와 관련한 자세한 메커니즘은 밝혀지지 않았기에 본 연구에서 이를 알아보고자 하였다. 실험 결과, B형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질에 의해 vimentin, fibronectin, slug, snail, NOX4가 증가되는 것을 확인하였다. NOX4에 의한 활성산소가 snail, slug 발현을 유도하고 섬유화 과정을 촉진할 수 있기 때문에 NOX4의 발현을 유도하는 HBx가 간섬유화를 조절, 유도하는 것을 확인하였다.
B형 간염 바이러스는 간경변증과 간세포암의 원인이 되는 간섬유화를 유발한다. 하지만 현재까지 그와 관련한 자세한 메커니즘은 밝혀지지 않았기에 본 연구에서 이를 알아보고자 하였다. 실험 결과, B형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질에 의해 vimentin, fibronectin, slug, snail, NOX4가 증가되는 것을 확인하였다. NOX4에 의한 활성산소가 snail, slug 발현을 유도하고 섬유화 과정을 촉진할 수 있기 때문에 NOX4의 발현을 유도하는 HBx가 간섬유화를 조절, 유도하는 것을 확인하였다.
Hepatitis B virus infection can cause hepatic fibrosis leading to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. However the mechanism remains poorly understood. In this study, we found that Hepatitis B virus X-protein (HBx) increases vimentin, fibronectin, slug, snail and NOX4 expression. Because NOX4-med...
Hepatitis B virus infection can cause hepatic fibrosis leading to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. However the mechanism remains poorly understood. In this study, we found that Hepatitis B virus X-protein (HBx) increases vimentin, fibronectin, slug, snail and NOX4 expression. Because NOX4-mediated reactive oxygen species can increase slug and snail, which can induce fibrosis, HBx may be a key regulator of hepatic fibrosis development via NOX4 induction.
Hepatitis B virus infection can cause hepatic fibrosis leading to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. However the mechanism remains poorly understood. In this study, we found that Hepatitis B virus X-protein (HBx) increases vimentin, fibronectin, slug, snail and NOX4 expression. Because NOX4-mediated reactive oxygen species can increase slug and snail, which can induce fibrosis, HBx may be a key regulator of hepatic fibrosis development via NOX4 induction.
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문제 정의
HBx에 의한 섬유화가 어떠한 과정을 거쳐 이루어지는지를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 상피-간엽전환(Epithelial-tomesenchymal transition, EMT)은 상피 세포(epithelial cell)가 침윤능력과 전이능력을 가지는 세포로 바뀌는 과정이다.
그러나 B형 간염 바이러스가 간섬유화를 유도하는 자세한 기전은 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 B형 간염 바이러스 특히 HBx가 간섬유화를 유도하는 메커니즘을 관찰하고자 하였다.
HBx는 바이러스 감염 초기 단계에서 유전자 복제에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 B형 간염 바이러스와 관련된 질병과 hepatocellular carcinoma 발병에 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 B형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질이 간섬유화 발병에 어떤 역할을 하는지 알아보기 위하여 HBx를 발현하도록 세포를 형질 전환하여 실험을 수행하였다. 먼저 vector 10 µg/mL를 형질 전환한 대조군(vector)과 HBx 10 µg/mL를 형질 전환한 실험군(HBx)에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 HBx mRNA 발현을 확인하였다.
B형 간염 바이러스는 간경변증과 간세포암의 원인이 되는 간섬유화를 유발한다. 하지만 현재까지 그와 관련한 자세한 메커니즘은 밝혀지지 않았기에 본 연구에서 이를 알아보고자 하였다. 실험 결과, B형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질에 의해 vimentin, fibronectin, slug, snail, NOX4가 증가되는 것을 확인하였다.
제안 방법
용해된 세포를 초음파 분해한 후 원심 분리하여 단백질을 분리하였다. Bicinchoninic acid assay를 통해 단백질을 정량하고 SDS-polyacrylamide gels에서 크기 별로 분리하여 polyvinylidene difluoride membrane에 옮긴 다음 일차 항체를 4에서 O/N (overnight)으로 반응시켰다. TBS-Tween 용액으로 세척 후 이차항체와 상온에서 1시간 반응시킨 후 앞과 동일한 방법으로 1시간 동안 세척하였다.
TBS-Tween 용액으로 세척 후 이차항체와 상온에서 1시간 반응시킨 후 앞과 동일한 방법으로 1시간 동안 세척하였다. ECL detection kit (Biosesang, Seongnam, Korea) 용액과 반응시켜 필름에 감광하여 결과를 확인하였다.
(Park 등, 2010). 따라서 간섬유화의 원인이 되는 EMT의 핵심조절자인 전사인자 snail (snai1)과 slug (snai2)의 mRNA와 단백질 발현을 확인하였다(Fig. 2). 그 결과 slug는 mRNA와 단백질 모두 대조군에 비해 유의적으로 증가한 것을 관찰할 수 있었으며 snail은 mRNA 수준에서는 실험군에서 유의적 차이가 있게 증가하였지만 단백질 수준에서는 유의적 차이 없이 미세한 증가를 보였다.
B형 간염 바이러스에 감염되어 간섬유화가 진행된 환자에게서 fibrotic marker인 vimentin과 fibronectin이 증가된 것을 관찰할 수 있다(Zhang 등, 2014). 이 현상이 HBV의 HBx에 의한 것인지를 알아보기 위해 HBx를 형질 전환시킨 후 vimentin과 fibronectin의 mRNA 및 단백질 발현을 확인하였다(Fig. 1B, C). Vimentin은 type intermediate filament 단백질로 세포이동(cell migration), 부착(adhesion) 등을 유도하며 간섬유화에서 HSC가 활성화가 되어 있는 동안 발현된다고 알려져 있다(Vassiliadis 등, 2012).
NOX4는 ROS를 생성하고 근섬유아세포(myofibroblast)의 활성화를 조절하여 폐와 신장의 섬유화에 중요한 역할을 한다(Jiang 등, 2014). 이에 snail과 slug의 증가가 ROS와 관련되어 있는지를 알아보기 위해 NAPDH oxidase의 발현을 확인하였다. 그 결과 HBx가 형질 전환된 실험군에서 NOX4가 mRNA와 단백질 수준 모두에서 대조군에 비해 증가된 것을 확인할 수 있었고 또 다른 NADPH oxidase인 NOX2는 NOX4와는 달리 HBx에 의한 증가를 보이지 않았다(Fig.
제공받은 재조합 플라스미드를 XhoI과 EcoRI의 인식 부위를 함유하는 프라이머를 이용하여 HBx 유전자 절편(gene fragment)을 PCR을 통해 증폭하였다. 이후 pcDNA3.0 vector로 HBx-expressing 재조합 플라스미드 pcDNA3.0-HBx 플라스미드를 생성하여 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 형질전환을 시행하였다.
정량 결과를 통해 2 µg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
Huh7세포에 HBx를 형질전환하기 위해서 HBx 유전자를 함유하는 재조합 pGEM 플라스미드를 송병철 박사님(Jeju University, Jeju, Korea)으로부터 제공받았다. 제공받은 재조합 플라스미드를 XhoI과 EcoRI의 인식 부위를 함유하는 프라이머를 이용하여 HBx 유전자 절편(gene fragment)을 PCR을 통해 증폭하였다. 이후 pcDNA3.
대상 데이터
incubator에서 배양하였다. Huh7세포에 HBx를 형질전환하기 위해서 HBx 유전자를 함유하는 재조합 pGEM 플라스미드를 송병철 박사님(Jeju University, Jeju, Korea)으로부터 제공받았다. 제공받은 재조합 플라스미드를 XhoI과 EcoRI의 인식 부위를 함유하는 프라이머를 이용하여 HBx 유전자 절편(gene fragment)을 PCR을 통해 증폭하였다.
실험에 사용된 세포는 인간 간암세포주 Huh7으로 10% fetal bovine serum이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium을 이용하여 37, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
성능/효과
NOX4를 억제하였을 때 TGF-β의 표적 유전자인 fibronetin, collagen I, α-smooth muscle actin 등의 발현이 억제되는 것을 확인하였고, 쥐 심장 섬유아세포에서 TGF-β에 의한 콜라겐 합성과 섬유아세포 분화가 초과산화물과 과산화수소의 억제제인 EUK-134나 NOX4의 dominant negative form를 처리하였을 때 억제되는 것을 확인하였다.
실험 결과, B형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질에 의해 vimentin, fibronectin, slug, snail, NOX4가 증가되는 것을 확인하였다. NOX4에 의한 활성산소가 snail, slug 발현을 유도하고 섬유화 과정을 촉진할 수 있기 때문에 NOX4의 발현을 유도하는 HBx가 간섬유화를 조절, 유도하는 것을 확인하였다
ROS가 snail과 slug를 유도하고 그 결과 vimentin이 증가하고 E-cadherin이 감소한다는 보고와 더불어 종합하여 보면(Kim과 Cho, 2014), HBx에 의해 NOX4의 발현이 증가되고 그 결과 TGF-β를 유도되고, 이에 따라 snail, slug가 증가하여 EMT가 발생하여 간섬유화가 유도되는 것이라 예상할 수 있다.
이에 snail과 slug의 증가가 ROS와 관련되어 있는지를 알아보기 위해 NAPDH oxidase의 발현을 확인하였다. 그 결과 HBx가 형질 전환된 실험군에서 NOX4가 mRNA와 단백질 수준 모두에서 대조군에 비해 증가된 것을 확인할 수 있었고 또 다른 NADPH oxidase인 NOX2는 NOX4와는 달리 HBx에 의한 증가를 보이지 않았다(Fig. 3).
2). 그 결과 slug는 mRNA와 단백질 모두 대조군에 비해 유의적으로 증가한 것을 관찰할 수 있었으며 snail은 mRNA 수준에서는 실험군에서 유의적 차이가 있게 증가하였지만 단백질 수준에서는 유의적 차이 없이 미세한 증가를 보였다. Slug에 의한 vimentin의 조절은 여러 논문에 의해 보고되어왔다(Virtakoivu 등, 2015).
하지만 현재까지 그와 관련한 자세한 메커니즘은 밝혀지지 않았기에 본 연구에서 이를 알아보고자 하였다. 실험 결과, B형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질에 의해 vimentin, fibronectin, slug, snail, NOX4가 증가되는 것을 확인하였다. NOX4에 의한 활성산소가 snail, slug 발현을 유도하고 섬유화 과정을 촉진할 수 있기 때문에 NOX4의 발현을 유도하는 HBx가 간섬유화를 조절, 유도하는 것을 확인하였다
Fibronectin은 간섬유화 과정에서 중요한 세포외기질 중 하나이다. 실험 결과, HBx를 형질 전환시킨 실험군에서 대조군과 비교하여 vimentin의 mRNA와 단백질 모두 증가된 것을 관찰할 수 있었으며, fibronectin 또한 증가된 단백질 발현양을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 통해 HBx가 형질 전환된 Huh7 세포에서 간섬유화가 진행되는 것을 확인할 수 있었다.
먼저 vector 10 µg/mL를 형질 전환한 대조군(vector)과 HBx 10 µg/mL를 형질 전환한 실험군(HBx)에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 HBx mRNA 발현을 확인하였다. 실험결과 대조군에서는 HBx mRNA가 발현되지 않았고 실험군에서 발현된 것을 통해 형질전환이 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다(Fig. 1A). B형 간염 바이러스에 감염되어 간섬유화가 진행된 환자에게서 fibrotic marker인 vimentin과 fibronectin이 증가된 것을 관찰할 수 있다(Zhang 등, 2014).
실험 결과, HBx를 형질 전환시킨 실험군에서 대조군과 비교하여 vimentin의 mRNA와 단백질 모두 증가된 것을 관찰할 수 있었으며, fibronectin 또한 증가된 단백질 발현양을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 통해 HBx가 형질 전환된 Huh7 세포에서 간섬유화가 진행되는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
ROS가 snail과 slug를 유도하고 그 결과 vimentin이 증가하고 E-cadherin이 감소한다는 보고와 더불어 종합하여 보면(Kim과 Cho, 2014), HBx에 의해 NOX4의 발현이 증가되고 그 결과 TGF-β를 유도되고, 이에 따라 snail, slug가 증가하여 EMT가 발생하여 간섬유화가 유도되는 것이라 예상할 수 있다. 추가적인 연구를 통해 정확한 기전을 규명하면 B형 간염에 의한 간섬유화 및 간질환의 치료법에 기반이 될 수 있으리라 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
B형 간염 바이러스가 유발하는 질병은?
B형 간염 바이러스는 간경변증과 간세포암의 원인이 되는 간섬유화를 유발한다. 하지만 현재까지 그와 관련한 자세한 메커니즘은 밝혀지지 않았기에 본 연구에서 이를 알아보고자 하였다.
상피-간엽전환이 간조직에서 발생이 되는 때는 어느 경우인가?
상피-간엽전환(Epithelial-tomesenchymal transition, EMT)은 상피 세포(epithelial cell)가 침윤능력과 전이능력을 가지는 세포로 바뀌는 과정이다. EMT가 간조직에서 발생이 될 때는 간에 손상이나 염증이 발생하였을 경우이다. 간세포가 EMT를 통해 간엽세포로 분화된 후 다시 간엽-상피 전환을 거치면서 재생이 일어나 손상이 회복된다.
간섬유화는 무엇인가?
간섬유화(Hepatic fibrosis)는 만성적인 간 손상 후에 간의 상처 치료 반응으로써, 세포외기질의 과도한 축적으로 정의될 수 있다. 간섬유화는 간경변증, 간부전, 간세포암을 유발하며 사망에 까지 이르게 한다.
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Jiang F, Liu GS, Dusting GJ, and Chan EC (2014) NADPH oxidasedependent redox signaling in TGF-beta-mediated fibrotic responses. Redox Biol 2, 267-72.
Nam HJ, Park YY, Yoon G, Cho H, and Lee JH (2010) Co-treatment with hepatocyte growth factor and TGF-beta1 enhances migration of HaCaT cells through NADPH oxidase-dependent ROS generation. Exp Mol Med 42, 270-9.
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Virtakoivu R, Mai A, Mattila E, De Franceschi N, Imanishi SY, Corthals G et al. (2015) Vimentin-ERK Signaling Uncouples Slug Gene Regulatory Function. Cancer Res 75, 2349-62.
Yang C, Song B, and Cho M (2012) A Natural Mutation of the Hepatitis B Virus X Gene Affects Cell Cycle Progression and Apoptosis in Huh7 Cells. J Korean Soc Appl Biol Chem. 55, 229-36.
Zhang M, Wang F, Chong Y, Tai Q, Zhao Q, Zheng Y et al. (2014) Liver myofibroblasts from hepatitis B related liver failure patients may regulate natural killer cell function via PGE2. J Transl Med 12, 308,014-0308-9.
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