어린잎채소의 생산 및 가공 공정 중 식중독 미생물 분석 Analysis of Foodborne Pathogens in Brassica campestris var. narinosa microgreen from Harvesting and Processing Steps원문보기
어린잎 채소의 생산 및 가공 공정에서 원료농산물과 토양 및 용수 등 환경 시료를 채취하여 미생물학적 품질을 평가하고 식중독을 유발시킬 수 있는 주요 병원성 미생물을 분석하였다. 생산단계 어린잎 채소와 환경 시료의 일반 세균수는 모두 6.8 log CFU/g 이상 분석되었으며 대장균군은 어린잎 채소와 토양에서 각각 3.2 log CFU/g 및 3.5 log CFU/g 수준으로 오염되어 있었다. 가공공정 단계에서는 일반세균수와 대장균군 모두 세척공정이 진행됨에 따라 최종제품 단계에서는 오염수준이 감소되었다. B. cereus의 경우 생산단계에서는 어린잎 채소와 토양 또는 지지토에서 오염도가 높았으며, 가공공정에서는 원료 대비 최종 제품에서 약 1.4 log CFU/g 정도 감소되었다. 병원성 미생물의 정성분석 결과 생산단계에서는 S. aureus를 제외한 모든 병원성 미생물이 음성이었다. 본 연구에서 분리된 B. cereus를 이용하여 rep-PCR에 의한 유전적 상동성을 분석한 결과 생산단계의 경우 지지토와 시료에서 분리된 균주의 유전적 상동성이 높아 반복적으로 이용되는 지지토에 오염된 균주가 어린잎 채소로 이행되었을 가능성을 보여준 반면 가공공정에서 분리된 균주의 경우 유전적 상동성이 낮아 공정 중 재 오염될 가능성이 낮음을 시사하였다.
어린잎 채소의 생산 및 가공 공정에서 원료농산물과 토양 및 용수 등 환경 시료를 채취하여 미생물학적 품질을 평가하고 식중독을 유발시킬 수 있는 주요 병원성 미생물을 분석하였다. 생산단계 어린잎 채소와 환경 시료의 일반 세균수는 모두 6.8 log CFU/g 이상 분석되었으며 대장균군은 어린잎 채소와 토양에서 각각 3.2 log CFU/g 및 3.5 log CFU/g 수준으로 오염되어 있었다. 가공공정 단계에서는 일반세균수와 대장균군 모두 세척공정이 진행됨에 따라 최종제품 단계에서는 오염수준이 감소되었다. B. cereus의 경우 생산단계에서는 어린잎 채소와 토양 또는 지지토에서 오염도가 높았으며, 가공공정에서는 원료 대비 최종 제품에서 약 1.4 log CFU/g 정도 감소되었다. 병원성 미생물의 정성분석 결과 생산단계에서는 S. aureus를 제외한 모든 병원성 미생물이 음성이었다. 본 연구에서 분리된 B. cereus를 이용하여 rep-PCR에 의한 유전적 상동성을 분석한 결과 생산단계의 경우 지지토와 시료에서 분리된 균주의 유전적 상동성이 높아 반복적으로 이용되는 지지토에 오염된 균주가 어린잎 채소로 이행되었을 가능성을 보여준 반면 가공공정에서 분리된 균주의 경우 유전적 상동성이 낮아 공정 중 재 오염될 가능성이 낮음을 시사하였다.
This study was performed to assess the microbiological quality of Brassica campestris var. narinosa microgreen from harvesting and processing steps. The samples were analyzed for total viable cell counts (TVC), coliforms, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes,...
This study was performed to assess the microbiological quality of Brassica campestris var. narinosa microgreen from harvesting and processing steps. The samples were analyzed for total viable cell counts (TVC), coliforms, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, and Staphylococcus aureus. The total viable counts of microgreen (whole leaves) and environment samples from harvesting steps were higher than 6.8 log CFU/g and the contamination level of coliforms in the samples were 3.2 log CFU/g and 3.5 log CFU/g of microgreen and soil, respectively. In case of microgreen samples collected from processing steps, the contamination level of TVC and coliforms were higher in raw materials than samples obtained from later stages of processing, i.e. washing, drain, and final products. The contamination levels of B. cereus in raw materials and environments decreased approximately 1.4 log CFU/g in final products. S. aureus was detected in soil samples but Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus and pathogenic E. coli was not detected. In order to identify the sources of contamination for microgreen, the genetic similarity of B. cereus isolates obtained from harvesting and processing steps were compared using the repetitive-sequence-based polymerase chain reaction method. B. cereus isolates obtained from harvesting environments and microgreen were clustered with a similarity greater than 95%. In case of B. cereus isolates obtained from microgreen and environmental samples at processing steps showed low genetic similarity.
This study was performed to assess the microbiological quality of Brassica campestris var. narinosa microgreen from harvesting and processing steps. The samples were analyzed for total viable cell counts (TVC), coliforms, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, and Staphylococcus aureus. The total viable counts of microgreen (whole leaves) and environment samples from harvesting steps were higher than 6.8 log CFU/g and the contamination level of coliforms in the samples were 3.2 log CFU/g and 3.5 log CFU/g of microgreen and soil, respectively. In case of microgreen samples collected from processing steps, the contamination level of TVC and coliforms were higher in raw materials than samples obtained from later stages of processing, i.e. washing, drain, and final products. The contamination levels of B. cereus in raw materials and environments decreased approximately 1.4 log CFU/g in final products. S. aureus was detected in soil samples but Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus and pathogenic E. coli was not detected. In order to identify the sources of contamination for microgreen, the genetic similarity of B. cereus isolates obtained from harvesting and processing steps were compared using the repetitive-sequence-based polymerase chain reaction method. B. cereus isolates obtained from harvesting environments and microgreen were clustered with a similarity greater than 95%. In case of B. cereus isolates obtained from microgreen and environmental samples at processing steps showed low genetic similarity.
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문제 정의
본 연구에서는 어린잎 채소 생산과 가공공정에서 원료농산물과 가공단계별 원료 및 환경을 채취하여 미생물학적 품질을 평가하고, 식중독을 유발시킬 수 있는 주요 병원성 미생물을 분석함으로써 생산 및 가공 단계에서의 오염 실태를 파악하고자 하였다. 아울러 어린잎 채소의 생산 및 가공 단계에서 분리된 균주의 유전적 상동성 분석을 통해 오염원을 추정하여 최종 식품의 미생물 안전성을 제고하고 식중독 미생물에 대한 잠재적인 위험성을 평가하는 미생물 위해평가의 기초자료로 활용하고자 하였다.
본 연구에서는 어린잎 채소 생산과 가공공정에서 원료농산물과 가공단계별 원료 및 환경을 채취하여 미생물학적 품질을 평가하고, 식중독을 유발시킬 수 있는 주요 병원성 미생물을 분석함으로써 생산 및 가공 단계에서의 오염 실태를 파악하고자 하였다. 아울러 어린잎 채소의 생산 및 가공 단계에서 분리된 균주의 유전적 상동성 분석을 통해 오염원을 추정하여 최종 식품의 미생물 안전성을 제고하고 식중독 미생물에 대한 잠재적인 위험성을 평가하는 미생물 위해평가의 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하고 모든 DNA 농도가 25 ng/µL이 되도록 하였다. Genomic DNA 중 non-coding intergenic repetitive elements의 rep-PCR 증폭을 위하여 diversilab DNA kit (BioMerieux)를 사용하였다. Rep-PCR master mix1 18 µL, GeneAmp 10x PCR buffer 2.
5 µL 그리고 template DNA 2 µL를 혼합하여 총 25 µL가 되게 준비한 후 원심분리하여 Mastercycler® pro(Eppendorf, Hamburg, Germany)로 PCR을 수행하였다. PCR 분석 후 증폭된 DNA는 Diversilab system(BioMerieux)을 이용하여 분석하였다.
Rep-PCR master mix1 18 µL, GeneAmp 10x PCR buffer 2.5 µL, Primer mix 2 µL, AmpliTaq DNA polymerase 0.5 µL 그리고 template DNA 2 µL를 혼합하여 총 25 µL가 되게 준비한 후 원심분리하여 Mastercycler® pro(Eppendorf, Hamburg, Germany)로 PCR을 수행하였다.
각 단계 희석액 1 mL를 평판에 분주하고 Plate Count Agar (PCA, Merck, Darmstadt, Germany)를 약 15 mL씩 부어 고르게 혼합한 후 37℃에서 24−48시간 배양하여 성장한 집락 수를 측정하였다.
1). 각 단계에서 멸균 장갑과 멸균 플라스틱 백을 이용하여 시료를 채취한 후 4-10℃의 아이스박스에 보관하여 이동하였으며, 시료 채취 후 6시간이내에 실험을 진행하였다.
계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 TSA (Merck)에 획선 도말하여 VITEK2® compact로 확인한 후 MFDS에 따라 B. cereus를 최종확인하고 정량 결과값에 반영하였다.
대장균군(coliforms)은 일반세균수와 동일한 시험액 10, 1, 0.1 mL씩 5개를 듀람관을 넣은 Brilliant-green bile lactose broth (BGLB, Merck)에 접종하고 37℃에서 48시간 배양하여 가스의 발생이 확인되면 Endo agar(Merck)에 획선 배양하였다. 전형적인 집락이 확인되면 Nutrient agar(Merck)에 획선 배양하여 성장한 집락이 그람 음성, 무아포성간균이 확인되면 대장균군 양성으로 확정하고, 최확수표(most probable number, MPN)에 따라 대장균군수를 산출하였다.
2 mL씩 5장에 도말하여 총 접종액이 1 mL이 되게 한 후 30℃에서 24시간 배양하였다. 성장한 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락을 계수하였다. 계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 TSA (Merck)에 획선 도말하여 VITEK2® compact로 확인한 후 MFDS에 따라 B.
어린잎 채소 생산 및 가공공정에서 분리된 B. cereus를 배양하여 UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하고 모든 DNA 농도가 25 ng/µL이 되도록 하였다.
의심되는 집락을 TSA에 획선 도말한 후 37℃에서 24시간 배양한 다음 VITEK2® compact로 최종 확인하였다.
1 mL씩 5개를 듀람관을 넣은 Brilliant-green bile lactose broth (BGLB, Merck)에 접종하고 37℃에서 48시간 배양하여 가스의 발생이 확인되면 Endo agar(Merck)에 획선 배양하였다. 전형적인 집락이 확인되면 Nutrient agar(Merck)에 획선 배양하여 성장한 집락이 그람 음성, 무아포성간균이 확인되면 대장균군 양성으로 확정하고, 최확수표(most probable number, MPN)에 따라 대장균군수를 산출하였다.
평판에서 성장한 집락 중에서 분홍색, 빨강색, 보라색을 띄는 5개의 집락을 취하여 Tryptic soy agar(TSA, Merck)에 획선 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 VITEK2® compact(BioMerieux, Marcy I'Etoile, France)로 동정하였다.
대상 데이터
어린잎 채소와 토양(지지토)의 경우 생산면적의 1/4에 해당하는 위치마다 시료를 채취하였다. 가공단계의 미생물 분석을 위하여 2012년 4월부터 2013년 7월까지 충청남도 소재의 신선편의 식품 가공공장을 총 4회 방문하여 원료, 세척, 헹굼, 탈수, 완제품 등 총 5단계의 공정에서 어린잎 채소 시료를 채취하였다(Fig. 1). 각 단계에서 멸균 장갑과 멸균 플라스틱 백을 이용하여 시료를 채취한 후 4-10℃의 아이스박스에 보관하여 이동하였으며, 시료 채취 후 6시간이내에 실험을 진행하였다.
신선편의 식품 시료채취.
어린잎 채소(비타민, Brassica campestris var. narinosa)의 생산 및 가공 공정 중 미생물학적 품질 및 식중독균 오염을 분석하기 위하여 생산단계의 시료는 2013년 6월부터 7월까지 경기도, 충청남도 및 충청북도 소재 어린잎 채소 생산 농가를 방문하여 원료농산물(종자 및 어린잎 채소)과 환경 시료(토양, 용수, 영양액)를 채취하였다. 어린잎 채소와 토양(지지토)의 경우 생산면적의 1/4에 해당하는 위치마다 시료를 채취하였다.
이론/모형
Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus 및 E. coli O157:H7와 같은 병원성 미생물은 MFDS(2014)에 따라 정성 분석하였다. 즉, 시료 25 g에 분석할 각 병원성 미생물별 배양액을 225 mL 가한 후 균질기를 이용하여 1분간 균질화시킨 후 L.
B. cereus의 분석은 MFDS(2014)에 따라 실시하였다. 일반세균수 분석과 동일한 시험액 1 mL를 단계 희석한 후, Mannitol-eggyolk-polymyxine agar (MYEP, Merck)에 각 단계 희석액을 0.
의심되는 집락을 TSA에 획선 도말한 후 37℃에서 24시간 배양한 다음 VITEK2® compact로 최종 확인하였다. 병원성대장균의 경우 분리된 대장균에 대하여 병원성 인자 보유 유무를 Kim 등(2014)의 방법에 의하여 분석하였다.
장내세균은 ISO 방법(2004)에 따라 분석하였다. 일반세균수와 동일한 시험액 1 mL를 평판에 분주하고 Crystal-violet neutral-red bile glucose agar (VRBD, Merck)를 약 15 mL씩 부어 고르게 혼합하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
aureus, Salmonella spp., V. parahaemolyticus, L. monocytogenes 및 E. coli O157:H7과 같은 병원성 미생물 오염을 분석한 결과 토양에서 S. aureus가 1건 분석되었으나 시료에는 오염되지 않았으며 위생지표인자로 활용되는 E. coli의 경우 일부 시료와 환경에서 분석되었다. 검출된 E.
aureus, Salmonella spp., V. parahaemolyticus, L. monocytogenes 및 E. coli O157:H7과 같은 병원성 식중독균 오염을 분석한 결과 시료 채취 시기 여부와 관계없이 모두 음성으로 분석되었다(Table 2).
9 log CFU/g 정도 감소되었다. 가공 공정 중 시료의 대장균군 오염도를 살펴본 결과 원료의 대장균군 오염 수준은 3.4 log CFU/g였으나 세척 및 탈수 공정을 거쳐 최종제품에서는 1.6 log CFU/g로 감소되는 경향을 보였다. 기존 국내 시판 샐러드 시료를 대상으로 한 연구에 따르면 일반세균수의 경우 약 6.
가공공정 단계에서 어린잎 채소 중 B. cereus를 분석한 결과(Table 2) 원료의 오염 수준은 3.89±2.11 log CFU/g, 최종제품은 2.45±2.25 log CFU/g로 분석되어 세척 가공이 진행될수록 B. cereus의 오염도는 감소하였으나 그 수준이 낮았다.
coli의 경우 일부 시료와 환경에서 분석되었다. 검출된 E. coli의 경우 동일한 위치의 시료와 토양에서 공통적으로 분석되어 토양으로부터 어린잎 채소로 오염이 전이되었을 가능성을 보여주었다. 한편 분리된 대장균의 병원성 인자는 음성이었다(Table 2).
도 검출되었다. 공정의 각 단계별로 장내세균이 고르게 분석되었으며, 세척공정에서 가장 낮게 검출되었으나 헹굼 및 탈수단계로 진행되는 동안 장내세균의 검출 빈도가 증가하였다. 장내세균 중 Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Yersinia spp.
2 log CFU/g 수준이었다. 대장균군은 어린잎 채소에서 2.9-3.5 log CFU/g, 종자에서 1.5-4.2 log CFU/g이 검출되었으며, 환경시료에서 평균 3.0 log CFU/g이상이 검출되어 환경시료와 원료 어린잎 채소의 오염도 차이가 크지 않았다.
물과 영양액에서는 1.0 log CFU/g 이하의 B. cereus가 분석된 반면 토양, 지지토 및 어린잎 채소에서는 2.77±0.44−3.21±0.30 log CFU/g이 분석되어 종자나 재배용수 및 영양액 보다는 재배과정 중 토양으로부터 B. cereus가 이행될 가능성이 높음을 시사하고 있다(Table 2).
4와 같다. 분리된 균주들의 상동성은 95% 수준 이하로 낮아 단일 균주의 clone이 원료로부터 최종제품으로 이행되거나 공정 중 보편적으로 오염되어있지 않은 것으로 사료되었고 유전적으로 상동성을 보이는 균주(Key No. 4, 5)는 동일 샘플에서 얻어진 것으로, 공정단계 진행 중 재오염되고 있을 가능성은 낮음을 보여주고 있다.
세균 간의 분류와 계통 발생관계를 정하기 위한 분자 타이핑 방법으로 알려져 있으며 다른 subtyping 방법에 비해 신속하고 간편한 장점이 있다(Rameshkumar와 Nair, 2009; Hyeon 등, 2011). 어린잎 채소 생산단계의 식품 및 환경 시료에서 분리된 B. cereus 21주의 유전적 상동성을 rep-PCR을 이용하여 분석한 결과 Key no. 14, 15, 16 및 17과 같이 95% 이상의 상동성을 보인 2개 균주 이상으로 구성된 그룹이 분석되었다(Fig. 3). 이들은 총 3곳의 어린잎 생산농장 중 2개의 농장(Farm I, II)의 지지토와 토양에서 분리된 균주로 이중 한 농장(Farm I)의 경우 간이형 수경재배를 위하여 용수에 잠긴 지지토 위에 토양에 식재된 어린잎 채소를 생산하는 방식으로 운영되고 있으며 이 경우 여러 번 생산에 이용되는 지지토에 오염된 B.
어린잎 채소의 생산단계 시료에서 B. cereus를 분석한 결과 분석된 35점 시료 중 71%에서 B. cereus가 검출되었다. 토양과 지지토에서는 분석한 시료에서 모두 검출되었으며 어린잎 채소와 종자의 약 67%에서 B.
어린잎 채소의 신선편의 가공공정 단계에서 수집한 시료의 일반세균수를 분석한 결과 원료, 세척, 헹굼, 탈수 및 최종 제품 단계 중 원료에서 일반세균수가 7.3 log CFU/g로 가장 높았으며 세척 및 헹굼에 의해서 1.2-1.9 log CFU/g 정도 감소되었다. 가공 공정 중 시료의 대장균군 오염도를 살펴본 결과 원료의 대장균군 오염 수준은 3.
cereus가 검출되었다. 토양과 지지토에서는 분석한 시료에서 모두 검출되었으며 어린잎 채소와 종자의 약 67%에서 B. cereus가 검출되었다. 물과 영양액에서는 1.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
신선편의 식품의 장점과 단점은?
샐러드, 새싹채소 등 신선편의 식품은 조리시간의 절약과 간편성 그리고 가열로 인한 영양소의 파괴가 없다는 장점이 있지만, 최소한의 비가열적 가공공정만을 거쳤기 때문에 원료 농산물의 생산 및 유통과정 중 세균, 바이러스 등에 노출되기 쉬우며, 식품자체가 식중독 매개체로서의 역할을 할 수 있다(Chang 등, 2004; Cho 등, 2007; Berger등, 2010). 최소 가공된 신선채소와 과일 섭취에 대한 소비자의 요구가 증가함에 따라 이들 식품의 안전성에 대해서도 우려가 제기되고 있다.
어린잎 채소의 가공 공정에서 분리된 장내세균들 중, 사람에서 감염을 유발시킬 수 있는 것은?
공정의 각 단계별로 장내세균이 고르게 분석되었으며, 세척공정에서 가장 낮게 검출되었으나 헹굼 및 탈수단계로 진행되는 동안 장내세균의 검출 빈도가 증가하였다. 장내세균 중 Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Yersinia spp. 등은 사람에서 감염을 유발시킬 수 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 안전성을 고려할 필요가 있다(HPA, 2007).
해외의 식중독 발생 현황은?
과거에는 동물성 식품에 의해 대규모 식중독 사고가 발생한 반면 최근 유럽에서 발생한 대규모 STEC O104 감염사례와 같이 채소류 섭취로 인한 식중독 가능성이 증가하고 있다(EFSA, 2011). 식중독 발생은 생활수준이 높은 유럽이나 미국과 같은 선진국에서도 증가하는 추세이며, 미국의 경우 1970년대 1%에 불과하던 농산물관련 식중독이 1990년부터 2004년 사이에 21%로 발생빈도가 증가하였고(Sivapalasingam 등, 2004), 2008년 환자수를 기준으로 원인 식품별로 식중독 발생 현황을 분석한 결과, 농산물에 의한 식중독이 가장 많았다고 보고된 바 있다(Painter 등, 2013).
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