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문제 정의
- 초음파를 이용한 액-액 추출 방법은 공정이 단순하며 기존의 추출 방법에 비하여 추출효율 향상, 조업시간 단축, 공정 편리성 그리고 에너지 절감 등 다양한 효과를 기대할 수 있다[19]. 따라서 본 연구에서는 초음파를 이용한 액-액 추출에 의해 파클리탁셀 회수 방법을 획기적으로 개선하고자 하였다. 즉, 초음파를 이용한 액-액 추출 공정에서의 주요 공정 변수인 초음파 파워(ultrasonic power)와 조업 시간을 최적화하여 단 1회의 액-액 추출로 대부분의(>90%)의 파클리탁셀을 회수하고자 하였다.
- 2). 본 연구에서는 초음파를 이용한 액-액 추출에 의해 1회 추출로 대부분의 파클리탁셀을 회수하고자 하였다. 주요 공정 변수 최적화를 위하여, 기존 문헌[14]에서 최적의 하층/상층 부피 비(25%, v/v)를 일정하게 하고 초음파 파워와 조업 시간에 따른 영향을 조사하였다.
- 본 연구에서는 초음파를 이용한 액-액 추출에 의해 식물세포인 바이오매스로부터 파클리탁셀 회수 방법을 획기적으로 개선하고자 하였다. 기존 액-액 추출의 경우 총 3회의 추출로 바이오매스 추출물로부터 대부분의 파클리탁셀을 회수 가능한 반면 초음파 처리를 이용한 액-액 추출의 경우 단 1 회 추출로 식물세포 내 대부분의 파클리탁셀을 회수(~92%) 가능하였다.
제안 방법
- 즉, 초음파를 이용한 액-액 추출 공정에서의 주요 공정 변수인 초음파 파워(ultrasonic power)와 조업 시간을 최적화하여 단 1회의 액-액 추출로 대부분의(>90%)의 파클리탁셀을 회수하고자 하였다. 더 나아가 salting-out 효과가 우수한 무기염(NaCl)을 첨가하여 초음파를 이용한 액-액 추출에서의 효율 상승효과(synergistic effect)를 조사하였다. 이러한 연구결과는 식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀을 효율적으로 회수하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 또한 초음파를 이용한 추출 공정에서 무기염 첨가에 따른 상승효과로 추출 효율에 많은 영향을 미치는 것으로 알려져 있다[25]. 무기염이 초음파를 이용한 액-액 추출 효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여, NaCl/solvent ratio 1% (w/v)[24], 초음파 파워 250 W에서 조업 시간(5, 15, 30 min)을 변화시켜 1회 액-액 추출을 수행하였다. Fig.
- 액-액 추출을 위하여, 메탄올 농축액에 메틸렌 클로라이드(메탄올 농축액의 25%)를 첨가하여 상온에서 혼합 후 30분 동안 정체시켜 상 분리(상층: 메탄올 농축액 층, 하층: 메틸렌 클로라이드 층)를 유도하였다[14]. 상 분리 후 40 kHz ultrasonic cleaner (UC-10, Jeiotech, Korea)를 이용하여 초음파 파워(ultrasonic power) (80, 180, 250, 380, 530 W)와 조업 시간(5, 10, 15, 20, 25, 30 min)을 변화시켜 최적 조건을 선정하였다. 초음파를 이용한 액-액 추출 후 상 분리로부터 파클리탁셀을 함유하고 있는 하층(메틸렌 클로라이드 층)을 회수하여 농축하고 진공건조(40 ℃, overnight, 760 mmHg)하여 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀 순도와 수율을 측정하였다.
- 2 µM 6-benzylaminopurine, 1 g/L casein hydrolysate, 1 g/L 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid에서 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주었고, 배양 시간을 연장시키기 위해 7 일과 21 일째 되는 날에 1~2% (w/v)의 maltose를 첨가해 주고 elicitor로서 배양 초기에 4 mM의 AgNO3를 첨가해 주었다[7,20]. 식물세포배양 후 배양액으로부터 decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심 분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 회수하였다.
- 식물세포배양 후 배양액으로부터 decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심 분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 회수하였다.
- 식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1:1(w/v)로 하여 상온(room temperature)에서 30분 동안 교반 하에서 4회 반복 추출하였다[14]. 추출 후 여과지(150 mm, Whatman)로 감압 여과하여 파클리탁셀 추출 여액을 회수하고 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 농축(원액의 30%)하였다.
- 추출 후 여과지(150 mm, Whatman)로 감압 여과하여 파클리탁셀 추출 여액을 회수하고 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 농축(원액의 30%)하였다. 액-액 추출을 위하여, 메탄올 농축액에 메틸렌 클로라이드(메탄올 농축액의 25%)를 첨가하여 상온에서 혼합 후 30분 동안 정체시켜 상 분리(상층: 메탄올 농축액 층, 하층: 메틸렌 클로라이드 층)를 유도하였다[14]. 상 분리 후 40 kHz ultrasonic cleaner (UC-10, Jeiotech, Korea)를 이용하여 초음파 파워(ultrasonic power) (80, 180, 250, 380, 530 W)와 조업 시간(5, 10, 15, 20, 25, 30 min)을 변화시켜 최적 조건을 선정하였다.
- 본 연구에서는 초음파를 이용한 액-액 추출에 의해 1회 추출로 대부분의 파클리탁셀을 회수하고자 하였다. 주요 공정 변수 최적화를 위하여, 기존 문헌[14]에서 최적의 하층/상층 부피 비(25%, v/v)를 일정하게 하고 초음파 파워와 조업 시간에 따른 영향을 조사하였다. 초음파 파워(80, 180, 250, 380, 530 W)와 조업 시간(5, 10, 15, 20, 25, 30 min)을 각각 변화시켜 1회 액-액 추출을 수행하였다.
- 즉, 초음파를 이용한 액-액 추출 공정에서의 주요 공정 변수인 초음파 파워(ultrasonic power)와 조업 시간을 최적화하여 단 1회의 액-액 추출로 대부분의(>90%)의 파클리탁셀을 회수하고자 하였다.
- 주요 공정 변수 최적화를 위하여, 기존 문헌[14]에서 최적의 하층/상층 부피 비(25%, v/v)를 일정하게 하고 초음파 파워와 조업 시간에 따른 영향을 조사하였다. 초음파 파워(80, 180, 250, 380, 530 W)와 조업 시간(5, 10, 15, 20, 25, 30 min)을 각각 변화시켜 1회 액-액 추출을 수행하였다. Fig.
- 상 분리 후 40 kHz ultrasonic cleaner (UC-10, Jeiotech, Korea)를 이용하여 초음파 파워(ultrasonic power) (80, 180, 250, 380, 530 W)와 조업 시간(5, 10, 15, 20, 25, 30 min)을 변화시켜 최적 조건을 선정하였다. 초음파를 이용한 액-액 추출 후 상 분리로부터 파클리탁셀을 함유하고 있는 하층(메틸렌 클로라이드 층)을 회수하여 농축하고 진공건조(40 ℃, overnight, 760 mmHg)하여 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀 순도와 수율을 측정하였다. 초음파를 이용한 액-액 추출 공정을 Fig.
- 식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1:1(w/v)로 하여 상온(room temperature)에서 30분 동안 교반 하에서 4회 반복 추출하였다[14]. 추출 후 여과지(150 mm, Whatman)로 감압 여과하여 파클리탁셀 추출 여액을 회수하고 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 농축(원액의 30%)하였다. 액-액 추출을 위하여, 메탄올 농축액에 메틸렌 클로라이드(메탄올 농축액의 25%)를 첨가하여 상온에서 혼합 후 30분 동안 정체시켜 상 분리(상층: 메탄올 농축액 층, 하층: 메틸렌 클로라이드 층)를 유도하였다[14].
- 파클리탁셀 함량 분석을 위해 HPLC 시스템(Waters, USA)과 Capell Pak C18 (250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다.
대상 데이터
- HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도:>97%)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. Taxus chinensis로부터 기원된 현탁액 세포는 24 ℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다.
- 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.
성능/효과
- 이로 인해 더 많은 파클리탁셀이 상층으로 이동되어 회수율이 오히려 감소하는 것으로 판단된다[23,26]. 결과적으로 NaCl 첨가에 따른 상승효과로 초음파 파워 250 W 이하 구간에서는 무기염 첨가에 의해 파클리탁셀 회수율이 증가한 반면 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 회수율이 오히려 감소하였다. 즉, 무기염과 초음파를 이용한 액-액 추출에서 파클리탁셀 수율을 극대화하기 위하여 적절한 무기염 농도와 초음파 파워가 요구됨을 알 수 있었다.
- 초음파 처리 유무에 관계없이 액-액 추출에서 얻은 파클리탁셀 순도(>15%)는 거의 차이가 없음을 알 수 있었다(data not shown). 결과적으로 초음파를 이용한 액-액 추출에서 초음파 파워 250 W, 조업 시간 15 min에서 1회 추출로 가장 높은 파클리탁셀 수율(~92%)을 하층(메틸렌 클로라이드 층)으로 부터 얻을 수 있었다.
- 일반적으로 높은 초음파 파워를 이용한 액-액 추출 공정에서 수율 감소는 높은 초음파 파워에서 장시간 노출에 따른 목적성분의 분해에 기인하는 것으로 알려져 왔다[17,18]. 높은 초음파 파워(530 W)에서 장시간(400 min) 노출에 따른 파클리탁셀의 분해 여부를 조사한 결과, 초음파 처리 후에도 파클리탁셀의 순도(~99%)에는 전혀 변화가 없었다(data not shown). 이러한 결과로부터 높은 초음파 파워(>250 W)에서 장시간 노출로 인한 수율 감소는 파클리탁셀 분해가 아닌 초음파 파워에 따른 기포 형상과 이동(물질전달)의 영향임을 재확인할 수 있었다.
- 4에서 보는 바와 같이 초음파를 이용한 액-액 추출에 NaCl을 첨가한 경우 NaCl만을 첨가하여 액-액 추출한 경우보다 파클리탁셀 수율이 오히려 감소하였다. 또한 NaCl/solvent ratio 1.0% (w/v), 조업 시간 15 min에서 초음파 파워(80, 180, 250, 380, 530 W)를 변화시켜 1회 액-액 추출을 수행한 결과, Fig. 5에서 보는 바와 같이 초음파 파워 250 W 이하 구간에서는 NaCl이 첨가된 경우 더 높은 파클리탁셀 수율을 나타내었다. 반면 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 NaCl이 첨가된 경우 파클리탁셀 수율이 현저하게 감소하였다.
- 초음파 파워 80~180 W 구간에서는 NaCl 첨가에 따른 상승효과로 초음파에 의해 생성된 기포가 하층으로 더 효과적으로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 초음파 파워가 증가할수록 기포가 하층으로 더 효과적으로 이동하다 초음파 파워 250 W 에서는 거의 변화가 없었다. 이로 인해 파클리탁셀 또한 하층으로 효과적으로 전달되어 회수율이 증가하는 것으로 판단된다.
- 이러한 결과는 초음파 파워와 조업 시간 변화에 따른 기포 형상과 이동(물질전달)의 흐름에 기인하는 것으로 판단된다. 또한 초음파를 이용한 액-액 추출에서 무기염(NaCl)을 첨가한 경우, 초음파 상승효과(synergistic effect)로 인하여 회수율을 극대화하기 위해서는 적절한 무기염 농도와 초음파 파워가 요구됨을 알 수 있었다. 이러한 연구결과는 식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀을 효율적으로 회수하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 상층 벌커(bulk)의 표면장력(surface tension)으로 인해 파클리탁셀은 벌커-기포 경계면(bulk-bubble interface)으로 이동하여 기포와 함께 하층으로 효과적으로 전달되어 회수율이 증가하는 것으로 판단된다[21,22]. 반면 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 초음파 파워가 증가할 수록 초음파에 의해 생성된 기포가 미세한 기포로 쪼개지면서 하층보다 오히려 상층으로 더 분산되어 이동함을 관찰할 수 있었다. 또한 조업 시간이 경과할수록 초음파에 의해 생성된 기포가 미세하게 쪼개지면서 하층보다 상층으로 더 분산되어 이동하였다.
- 이러한 결과로부터 높은 초음파 파워(>250 W)에서 장시간 노출로 인한 수율 감소는 파클리탁셀 분해가 아닌 초음파 파워에 따른 기포 형상과 이동(물질전달)의 영향임을 재확인할 수 있었다.
- 반면 초음파 파워 250 W 이후에는 파클리탁셀 수율이 급격하게 감소하였다. 조업 시간이 증가할수록 파클리탁셀 수율 또한 증가하여 조업 시간 15 min에서 가장 높은 수율(~92%)을 얻을 수 있었다. 초음파 파워 250 W 이하 구간에서는 조업 시간 15 min 이후에도 수율 변화가 거의 없었지만 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 수율이 급격하게 감소하였다.
- 결과적으로 NaCl 첨가에 따른 상승효과로 초음파 파워 250 W 이하 구간에서는 무기염 첨가에 의해 파클리탁셀 회수율이 증가한 반면 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 회수율이 오히려 감소하였다. 즉, 무기염과 초음파를 이용한 액-액 추출에서 파클리탁셀 수율을 극대화하기 위하여 적절한 무기염 농도와 초음파 파워가 요구됨을 알 수 있었다.
- 초음파 처리 유무에 관계없이 액-액 추출에서 얻은 파클리탁셀 순도(>15%)는 거의 차이가 없음을 알 수 있었다(data not shown).
- 식물세포배양에 의해 생산된 파클리탁셀은 대부분 바이오매스(식물세포)에 포함되어 있으며, 먼저 메탄올을 이용하여 바이오매스를 추출하고 메틸렌 클로라이드를 이용하여 액-액 추출을 수행하여 파클리탁셀을 분리/회수한다[15]. 초음파 처리를 하지 않은 기존의 액-액 추출은 1회 추출 시 75%, 2회 추출 시 15%, 3회 추출 시 9% 파클리탁셀이 각각 회수되어 총 3회의 추출로 대부분의 파클리탁셀 회수가 가능하였다(Fig. 2). 본 연구에서는 초음파를 이용한 액-액 추출에 의해 1회 추출로 대부분의 파클리탁셀을 회수하고자 하였다.
- 반면 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 NaCl이 첨가된 경우 파클리탁셀 수율이 현저하게 감소하였다. 초음파 파워 80~180 W 구간에서는 NaCl 첨가에 따른 상승효과로 초음파에 의해 생성된 기포가 하층으로 더 효과적으로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 초음파 파워가 증가할수록 기포가 하층으로 더 효과적으로 이동하다 초음파 파워 250 W 에서는 거의 변화가 없었다.
- 초음파 파워 250 W 이하 구간에서는 조업 시간 15 min 이후에도 수율 변화가 거의 없었지만 초음파 파워 250 W 이상 구간에서는 수율이 급격하게 감소하였다. 초음파 파워 80~250 W 구간에서는 초음파 파워가 증가할 수록 초음파에 의해 생성된 기포(bubble)가 하층으로 더 효과적으로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 조업 시간이 경과할수록 초음파에 의해 생성된 기포가 하층으로 더 효과적으로 이동하다 15 min 이후에는 거의 변화가 없었다.
후속연구
- 더 나아가 salting-out 효과가 우수한 무기염(NaCl)을 첨가하여 초음파를 이용한 액-액 추출에서의 효율 상승효과(synergistic effect)를 조사하였다. 이러한 연구결과는 식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀을 효율적으로 회수하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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