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문제 정의
- 지방구 크기의 변화를 광학현미경을 이용하여 더욱 자세히 관찰하고자 하였다(Fig. 3). Aging time이 길어지면서 CE를 첨가한 것과 control의 현미경 측정 결과 합일(coalescence)에 의해 생긴 큰 지방구들이 보였으며 CE와 control의 지방구 크기와 분포가 큰 차이 없게 관측되었다.
제안 방법
- 유화액을 적정기기에서 효소용액 1mL를 첨가한 후 반응조건에서 10분 동안 가수분해하였다. CE를 첨가하지 않은 유화액을 대조군으로 하였으며, 유화액을 제조한 후 aging time(0, 5, 24시간)에 따른 가수분해율 변화를 비교하였다.
- Type Ⅰ은 카카오 추출물을 기질(soybean oil)과 함께 소화액에 첨가하는 방법으로 수행하였다. CE를 첨가한 시료(CE)와 첨가하지 않은 시료(control)를 비교하여 실험하였으며, ultra-sonicator를 사용하여 emulsion 제조 후에 aging time(0, 5, 24시간)에 따른 가수분해율을 비교하였다 (Fig. 1). Aging time에 따른 가수분해 경향은 control과 CE 사이에 큰 차이를 보이지 않았으며, aging time이 증가할수록 전체적인 가수분해율은 감소하는 경향을 보였다.
- 스크롤 캡이 있는 삼각 플라스크에 시료 50g을 취하여 500mL의 hexane을 가하고, shaking water bath(55°C, 135 rpm)에서 30분 동안 추출하였다. Hexane이 시료와 분리될 때까지 방치한 후에 hexane층을 제거하였는데 이를 세 번 반복하여 지질을 제거한 다음 질소가스를 사용하여 남아있는 hexane을 모두 제거하였다. 탈지된 시료에 80% 에탄올을 250mL 혼합하여 55°C에서 135 rpm의 shaking water bath를 이용하여 1시간 동안 추출하였다.
- 이를 적정기기에서 효소용액 1mL를 첨가한 후 반응 조건에서 10분 동안 가수분해를 진행하였으며, CE를 첨가하지 않고 만들어진 micro-emulsion을 대조군으로 하였다. O/W micro-emulsion을 제조한 후 aging time(0, 2, 4, 7, 18, 43일) 동안 각각 가수분해하여 비교하였다.
- Serum층을 관찰하기 위해 유화액을 제조 후 눈금이 그려진 5mL vial에 옮겼다. Serum층 측정은 유화액이 들어 있는 vial 뒷면에 흰색 배경지를 두고 육안으로 높이를 측정하였다.
- Type Ⅰ은 카카오 추출물을 기질(soybean oil)과 함께 소화액에 첨가하는 방법으로 수행하였다. CE를 첨가한 시료(CE)와 첨가하지 않은 시료(control)를 비교하여 실험하였으며, ultra-sonicator를 사용하여 emulsion 제조 후에 aging time(0, 5, 24시간)에 따른 가수분해율을 비교하였다 (Fig.
- Type Ⅱ에서는 제조된 emulsion을 3mL(10% oil 함유) 첨가하여 pancreatic lipase의 활성을 평가하였다. 더욱 안정한 emulsion을 제조하기 위해 유화제(Tween 20)를 첨가하고 micro-fluidizer를 사용하였다.
- p기질로부터 가수분해된 FFA의 양(μmole)을 계산한 후이를 기질로부터 분해되어 방출될 수 있는 총 FFA의 양에 대한 비율로 가수분해율(hydrolysis rate, %)을 나타내었다.
- 실험 방법은 Versantvoort 등(13)의 방법을 일부 변형하였으며 모든 소화액은 실험 당일 제조하여 사용하였다(Table 1). 기질 형태(oil 또는 emulsion 형태)에 따라 실험 방법을 type Ⅰ과 Ⅱ로 나누었는데, type Ⅰ은 soybean oil(oil 형태)을 소화액과 유화 시에 CE를 넣어 유화액을 제조하였고, type Ⅱ는 soybean oil을 Tween 20와 CE를 혼합하여 micro-emulsion(emulsion 형태)으로 만든 후 이를 digestion model에서 평가하였다. 따라서 soybean oil이 oil 형태이거나 emulsion 형태로 가수분해율 변화가 측정되었다.
- 더욱 안정한 emulsion을 제조하기 위해 유화제(Tween 20)를 첨가하고 micro-fluidizer를 사용하였다. 따라서 지방구는 Tween 20로 유화된 상태로 lipase의 가수분해가 진행되었고 0, 2, 4, 7, 18, 43일의 aging time에 따른 변화를 관찰하였다(Fig. 5). Aging time이 길어짐에 따라 control과 CE-emulsion의 최대 가수분해율(Ф max)이 낮아지는 경향을 보였으며, control과 CE-emulsion의 가수분해율의 차이가 나타났다.
- 기질의 가수분해를 위해 pancreatin 54mg, lipase 36mg을 혼합된 juice 1mL에 녹여 사용하였으며, 가수분해는 37°C와 150 rpm의 조건에서 진행되었다. 또한 가수분해 결과로 생성된 free fatty acid(FFA)의 양은 potentiometer automatic titrator(AT-40E, Kyoto Electronics MFG. Co., Ltd., Kyoto, Japan)와 auto piston buret(APB-410, Kyoto Electronics MFG. Co., Ltd.)을 사용하여 0.05 N NaOH 용액으로 적정하였다. 모든 pH-stat digestion model의 결과는 아래의 식을 사용하여 적정에 사용된 NaOH의 양(mL)을 통해서 가수분해 결과 생성된 FFA의 양을 μM 단위로 나타내었다.
- 또한 광학현미경(Olympus CX21, Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 유화액의 지방구를 육안으로 확인하였다.
- 본 실험에서는 페놀화합물의 함량이 높다고 알려진 카카오(powder)로부터 카카오 추출물(cacao extract, CE)을 획득한 후, CE가 pancreatic lipase의 활성에 미치는 영향과 CE를 함유한 emulsion의 aging에 의한 가수분해율 변화를 살펴보았고, 이를 위하여 pH-stat digestion model을 이용하였다.
- 실험 방법은 Versantvoort 등(13)의 방법을 일부 변형하였으며 모든 소화액은 실험 당일 제조하여 사용하였다(Table 1). 기질 형태(oil 또는 emulsion 형태)에 따라 실험 방법을 type Ⅰ과 Ⅱ로 나누었는데, type Ⅰ은 soybean oil(oil 형태)을 소화액과 유화 시에 CE를 넣어 유화액을 제조하였고, type Ⅱ는 soybean oil을 Tween 20와 CE를 혼합하여 micro-emulsion(emulsion 형태)으로 만든 후 이를 digestion model에서 평가하였다.
- 추출이 끝난 후 시료와 용매를 분리하고, 용매층을 filter paper로 걸러 둥근 플라스크에 옮겼다. 위의 반응을 4번 반복하여 추출하였으며, 감압농축기를 사용하여 용매를 완전히 제거한 뒤 카카오 추출물의 무게를 측정하였다. 페놀화합물의 불순물을 제거하기 위해 HP-20 column을 사용하였는데 HP-20 resin 50g(추출물 2.
- 카카오 추출물이 함유된 O/W 유화액을 제조하여 aging time(방치 기간)에 따른 유화액의 안정도와 pancreatic lipase의 지방 소화 활성 변화를 살펴보았다. 유화액은 20mM bis-tris buffer(pH 7)와 soybean oil을 9:1(w/w) 비율로 준비하고 유화제로 Tween 20를 0.1% 첨가하였으며, 유화액의 부패 방지를 위해 bis-tris buffer 제조 시 sodium azide 0.02%를 첨가하였다. CE는 0.
- 유화액을 제조한 후 눈금이 그려진 10mL vial에 일정량취하여 aging time에 따른 유화액의 안정도를 평가하였다 (Fig. 4). 4일까지는 control와 CE의 serum layer가 관측되지 않았으나 7일에 control의 serum layer가 2.
- Type Ⅱ: 100mL 비커에 혼합 juice 35mL를 취한 뒤 여기에 방법 3에 제시된 조건으로 만들어진 O/W microemulsion(oil 10%)을 3mL 첨가하였다. 이를 적정기기에서 효소용액 1mL를 첨가한 후 반응 조건에서 10분 동안 가수분해를 진행하였으며, CE를 첨가하지 않고 만들어진 micro-emulsion을 대조군으로 하였다. O/W micro-emulsion을 제조한 후 aging time(0, 2, 4, 7, 18, 43일) 동안 각각 가수분해하여 비교하였다.
- 지방구의 크기는 입도분석기(Mastersizer S, Malvern Instrument, Worcestershire, UK)를 사용하여 측정하였으며 0, 2, 4, 7, 18, 43일마다 분석하였다. 그 결과는 아래의식에 의해 계산되어 얻어진 volume surface mean diameter(d32)와 weighted average mean diameter(d43)로 나타냈다.
- 카카오 추출물이 함유된 O/W 유화액을 제조하여 aging time(방치 기간)에 따른 유화액의 안정도와 pancreatic lipase의 지방 소화 활성 변화를 살펴보았다. 유화액은 20mM bis-tris buffer(pH 7)와 soybean oil을 9:1(w/w) 비율로 준비하고 유화제로 Tween 20를 0.
대상 데이터
- 모든 실험에 사용된 소화액은 Table 1에 제시된 조건으로 duodenal juice와 bile juice를 각각 제조하였으며 이를 각각 2:1로 혼합하였다. 기질의 가수분해를 위해 pancreatin 54mg, lipase 36mg을 혼합된 juice 1mL에 녹여 사용하였으며, 가수분해는 37°C와 150 rpm의 조건에서 진행되었다.
성능/효과
- Aging time이 길어짐에 따라 control과 CE-emulsion의 최대 가수분해율(Ф max)이 낮아지는 경향을 보였으며, control과 CE-emulsion의 가수분해율의 차이가 나타났다. 0일의 가수분해 결과 control과 CE-emulsion 모두 2분까지 급격히 증가한 뒤, 8분까지 일정한 속도로 증가하여 최대 가수분해율에 도달하였고, control과 CE-emulsion 간의 가수분해 차이는 거의 보이지 않았다. 반면에 2~18일에 얻어진 가수분해 결과에서는 반응이 시작되고 6~7분까지는 카카오 추출물을 첨가한 CE-emulsion의 가수분해율이 다소 높았으나, 그 이후로는 CE-emulsion의 가수분해율이 더 이상 증가하지 않아 8분 이후로는 control의 가수분해율보다 낮았다.
- 10분동안 가수분해된 FFA 양(μmole)의 경우 0일에서 control은661.13 μmole, CE는 670.00 μmole로 뚜렷한 차이를 보이지 않았고, aging time이 길어질수록 control과 CE-emulsion에서 가수분해된 FFA의 양은 감소하는 경향을 보였다.
- 1). Aging time에 따른 가수분해 경향은 control과 CE 사이에 큰 차이를 보이지 않았으며, aging time이 증가할수록 전체적인 가수분해율은 감소하는 경향을 보였다. Emulsion을 제조하고 바로(aging time: 0시간) digestion 실험을 한 결과, control과 CE는 1분에서 약 40%의 가수분해가 진행되었고 8분까지 일정한 비율로 100% 가까이 가수분해되었으며, 그 이후에는 더 이상 증가하지 않았다.
- 3). Aging time이 길어지면서 CE를 첨가한 것과 control의 현미경 측정 결과 합일(coalescence)에 의해 생긴 큰 지방구들이 보였으며 CE와 control의 지방구 크기와 분포가 큰 차이 없게 관측되었다. 시간이 흐르면서 유화액의 지방구가 상부로 이동하여 상층에는 크림층이 형성되고, 하층에는 투명층이 형성되는데 이를 serum층이라 한다.
- Aging time이 길어질수록 CE-emulsion의 Φ max가 control보다 더 많이 감소하여 43일에는 control이 92.13%, CE-emulsion이 77.69%로 나타나 control보다 CE-emulsion의 가수분해가 저해되었다.
- 5). Aging time이 길어짐에 따라 control과 CE-emulsion의 최대 가수분해율(Ф max)이 낮아지는 경향을 보였으며, control과 CE-emulsion의 가수분해율의 차이가 나타났다. 0일의 가수분해 결과 control과 CE-emulsion 모두 2분까지 급격히 증가한 뒤, 8분까지 일정한 속도로 증가하여 최대 가수분해율에 도달하였고, control과 CE-emulsion 간의 가수분해 차이는 거의 보이지 않았다.
- Aging time에 따른 가수분해 경향은 control과 CE 사이에 큰 차이를 보이지 않았으며, aging time이 증가할수록 전체적인 가수분해율은 감소하는 경향을 보였다. Emulsion을 제조하고 바로(aging time: 0시간) digestion 실험을 한 결과, control과 CE는 1분에서 약 40%의 가수분해가 진행되었고 8분까지 일정한 비율로 100% 가까이 가수분해되었으며, 그 이후에는 더 이상 증가하지 않았다. pH-stat digestion parameter(Table 2)를 살펴보면 Φ max가 control의 경우에는 105%, CE는 102%로 뚜렷한 차이가 없었고, initial rate의 경우에도 control과 CE가 각각 0.
- pH-stat digestion parameter(Table 2)를 살펴보면 Φ max가 control의 경우에는 105%, CE는 102%로 뚜렷한 차이가 없었고, initial rate의 경우에도 control과 CE가 각각 0.11mM/s와 0.12mM/s로 큰 차이가 없었다.
- 2%로 증가하였다. 따라서 CE의 serum layer가 control보다 낮은 경향을 보였고, 이는 CE를 첨가한 emulsion이 control보다 더 안정적이라는 것을 의미한다.
후속연구
- 유화액은 제조 후 시간이 지날수록 지방구가 emulsion 표면에 집적되며 지방구의 합일과 응집 때문에 지방구의 크기가 증가하면서 emulsion의 안정도가 낮아지고(16,17), 유화액의 안정도가 낮아지면서 지방구 크기가 커지면 가수분해에도 영향을 준다(7,14). 한편 첨가한 약산성 페놀 추출물의 양은 소량(500 ppm)이나 이들에 의한 pH-stat 결과에 대한 영향도 차후 고려해 보아야 할 것으로 판단된다.
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