본 연구는 카카오를 화장품 소재로 활용하기 위하여 항산화 및 항염증 효과를 검증하여 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다. 아세톤 추출물을 이용하여 클로로포름층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층의 극성별로 분획을 실시하였다. 카카오 분획물의 전자공여능은 100 ${\mu}g/ml$에서 에틸아세테이트 분획물이 76.2%, 부탄올 분획물이 53.9%의 소거능을 나타내었다. 또한, superoxide anion radical 소거능 측정 결과, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물이 50 ${\mu}g/ml$에서 각각 76.09%, 51.4%의 소거능이 나타났고, $Fe^{2+}$, $Cu^{2+}$의 첨가에 따른 지방산패 억제능에서 $Fe^{2+}$를 첨가한 군에서는 에틸아세테이트 분획물이 50 ${\mu}g/ml$에서 64%로 $Cu^{2+}$를 첨가한 군보다 저해능이 높았다. 항염증 효과 측정으로 hyaluronidase 저해 활성을 측정한 결과, 부탄올 분획물의 경우 100 ${\mu}g/ml$에서 53.04%의 저해활성을 나타내었으며, lipoxygenase 저해 활성 측정결과 10 ${\mu}g/ml$에서 51.32%의 저해활성을 나타내었다. 대식세포를 이용한 nitric oxide (NO) 저해활성을 측정한 결과 카카오 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 NO 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 대식세포 내에서 에틸아세테이트 분획물 100 ${\mu}g/ml$ 농도에서 iNOS, COX-2 단백질 발현을 저해하였다.
본 연구는 카카오를 화장품 소재로 활용하기 위하여 항산화 및 항염증 효과를 검증하여 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다. 아세톤 추출물을 이용하여 클로로포름층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층의 극성별로 분획을 실시하였다. 카카오 분획물의 전자공여능은 100 ${\mu}g/ml$에서 에틸아세테이트 분획물이 76.2%, 부탄올 분획물이 53.9%의 소거능을 나타내었다. 또한, superoxide anion radical 소거능 측정 결과, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물이 50 ${\mu}g/ml$에서 각각 76.09%, 51.4%의 소거능이 나타났고, $Fe^{2+}$, $Cu^{2+}$의 첨가에 따른 지방산패 억제능에서 $Fe^{2+}$를 첨가한 군에서는 에틸아세테이트 분획물이 50 ${\mu}g/ml$에서 64%로 $Cu^{2+}$를 첨가한 군보다 저해능이 높았다. 항염증 효과 측정으로 hyaluronidase 저해 활성을 측정한 결과, 부탄올 분획물의 경우 100 ${\mu}g/ml$에서 53.04%의 저해활성을 나타내었으며, lipoxygenase 저해 활성 측정결과 10 ${\mu}g/ml$에서 51.32%의 저해활성을 나타내었다. 대식세포를 이용한 nitric oxide (NO) 저해활성을 측정한 결과 카카오 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 NO 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 대식세포 내에서 에틸아세테이트 분획물 100 ${\mu}g/ml$ 농도에서 iNOS, COX-2 단백질 발현을 저해하였다.
Solvent extracts of Theobroma cacao L. (TCL) were investigated for anti-oxidative and anti-inflammatory effects in order to consider TCL as a functional ingredient for cosmetic products. TCL(A) extract was fractioned according to polarity with $CHCl_3$, EtOAc, n-BuOH, and water. Following...
Solvent extracts of Theobroma cacao L. (TCL) were investigated for anti-oxidative and anti-inflammatory effects in order to consider TCL as a functional ingredient for cosmetic products. TCL(A) extract was fractioned according to polarity with $CHCl_3$, EtOAc, n-BuOH, and water. Following TCL(A) fractionation, the electron-donating ability of the n-BuOH and EtOAc solvent fractions (each 100 ${\mu}g/ml$) was about 76.2% and 53.9%, respectively. The superoxide anion radical inhibitory effect of the n-BuOH and EtOAc solvent fractions (each 50 ${\mu}g/ml$) was about 76.09% and 51.4%, respectively. Results of lipid oxidation showed that $Fe^{2+}$ had a greater chelating effect than $Cu^{2+}$. The $Fe^{2+}$ chelating effect of the EtOAc solvent fraction (50 ${\mu}g/ml$) was about 64%. Hyaluronidase inhibition related to the anti-inflammatory effect was 53.0% with EtOAc at 100 ${\mu}g/ml$, while the lipoxygenase inhibitory effect was about 51.32% at 10 ${\mu}g/ml$. The anti-inflammatory activity in the EtOAc fraction inhibited the generation of nitric oxide. Results also showed that iNOS protein expression increased in RAW264.7 cells. In contrast, at 100 ${\mu}g/ml$ EtOAc, iNOS and COX-2 protein expression significantly decreased in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.
Solvent extracts of Theobroma cacao L. (TCL) were investigated for anti-oxidative and anti-inflammatory effects in order to consider TCL as a functional ingredient for cosmetic products. TCL(A) extract was fractioned according to polarity with $CHCl_3$, EtOAc, n-BuOH, and water. Following TCL(A) fractionation, the electron-donating ability of the n-BuOH and EtOAc solvent fractions (each 100 ${\mu}g/ml$) was about 76.2% and 53.9%, respectively. The superoxide anion radical inhibitory effect of the n-BuOH and EtOAc solvent fractions (each 50 ${\mu}g/ml$) was about 76.09% and 51.4%, respectively. Results of lipid oxidation showed that $Fe^{2+}$ had a greater chelating effect than $Cu^{2+}$. The $Fe^{2+}$ chelating effect of the EtOAc solvent fraction (50 ${\mu}g/ml$) was about 64%. Hyaluronidase inhibition related to the anti-inflammatory effect was 53.0% with EtOAc at 100 ${\mu}g/ml$, while the lipoxygenase inhibitory effect was about 51.32% at 10 ${\mu}g/ml$. The anti-inflammatory activity in the EtOAc fraction inhibited the generation of nitric oxide. Results also showed that iNOS protein expression increased in RAW264.7 cells. In contrast, at 100 ${\mu}g/ml$ EtOAc, iNOS and COX-2 protein expression significantly decreased in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.
NO 생성량은 24시간 후에 supernatant를 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.
Nitric oxide (NO) 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide (NO)의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다[11]. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2×106개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide (LPS) 10 μg/ml을 control군을 뺀 모든 well 에 다 넣어서 자극시켰다.
Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2×106개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide (LPS) 10 μg/ml을 control군을 뺀 모든 well 에 다 넣어서 자극시켰다.
그 다음 TBST로 10분간 3회씩 세척한 다음 primary antibody 를 염증 관련 단백질인 iNOS (BD Bionsience1:1,000), COX-2 (Cayman1:1,000)와 house keeping gene인 GAPDH (santacruz1:1,000)가 되도록 3% skimmed milk in TBST로 희석하여 membrane과 함께 상온에서 4∼5시간 배양하였다.
1 ml 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각 시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 3 ml을 가하여 37℃에서 20분간 배양한 다음 585nm에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 산출하였다.
단백질은 bradford법을 통하여 정량하였으며, 20 μg의 샘플을 10% SDS-polyacrylamide gel에 100 V로 2시간 동안 전기영동 하였다.
세포주 macrophage (Raw 264.7) cell을 96 well plate 에 5×103 cells/well이 되게 0.2 ml 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후, 무혈청배지 0.18 ml 에 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 ml 첨가한 후 대조군은 시료와 동량의 무혈청 배지를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.
염증 관련 단백질 발현을 측정하기 위하여 Raw 264.7 세포를 10% FBS contained DMEM으로 희석하여 1 ml당 5×104가 되도록 한 후 100 mm dish에 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간을 배양하였다.
이 아세톤 추출물의 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다.
55 g)을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었다. 이들 분획물들을 감압, 농축 후 동결 건조하여 용매를 제거한 후 실험에 사용하였다.
Membrane을 PBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-conjugated secondary antibody (santacruz1)을 1:1,000으로 희석 하여 membrane과 함께 상온에서 50분간 배양하였다. 이를 TBST로 10분간 3회 세척한 후 ECL western blotting detection reagents를 처리하여 생성된 luminescence를 X-ray film에 감 광해 확인하였다.
즉, 100배 희석한 시료용액 3 ml에 folin-ciocalteu phenol reagent 시약 1 ml를 가하고, 1N HCl 0.2 ml을 넣은 후, 포화용액 Na2CO3 1 ml를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, 640 nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
카카오 에틸아세테이트 분획물이 iNOS, COX-2 protein 발현 저해효과가 있는지 알아보기 위하여 RAW 264.7 cell에 LPS (10 μg/μl)을 처리하고 1시간 뒤, 카카오 에틸아세테이트 분획물을 100 μg/ml 로 처리 한 후 24시간 배양한 후 iNOS, COX-2 protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 카카오(Theobroma cacao L.)는 가나산 카카오를 (주)롯데 식품사업부에서 시판되고 있는 원료를 롯데 그룹 중앙 연구소에서 공급받아 실험재료로 사용하였다.
이론/모형
Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다[12]. 각 시료용액 0.
산화 촉진제인 Fe2+, Cu2+의 첨가에 따른 지방 산패 억제도 측정은 Buege와 Aust의 방법[4]에 따라 측정하였다. 미리 조제된 oil emulsion 0.
세포 생존율 측정은 Carmichael 등의 방법[7]에 따라 측정 하였다. 세포주 macrophage (Raw 264.
Fe2+를 첨가한 군에서는 vitamin C의 경우 50 μg/ml에서 57%의 저해능이 나타난 반면, 에틸아세테이트층은 50 μg/ ml에서 64%의 억제능을 나타내어 vitamin C보다 높은 활성을 나타내었고, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물 모두 100 μg/ml에서 50% 이상의 저해능이 확인되었다.
IC50 값으로 Fe2+를 첨가한 군에서는 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 IC50값은 각각 99.78 μg/ml, 27.59 μg/ml, 68.13μg/ml, 647.84 μg/ml로 나타났고, vitamin C의 IC50값은 28.02μg/ml으로 나타났으며, Cu2+를 첨가한 군에서는 에틸아세테이트 분획물의 IC50값은 833.3 μg/ml으로 나타난 반면, vitamin C은 752.5 μg/ml로 나타났다.
LPS 를 첨가하지 않은 군에서는 16∼18%의 NO를 생성하였고, LPS와 카카오 분획물을 첨가한 군에서는 에틸아세테이트 분획물이 NO의 생성량을 가장 많이 억제하였다.
대조적으로 카카오 에틸아세테이트 분획물 100 μg/ml 농도로 처리시 LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2 protein 발현을 감소시켰다. 따라서 카카오 에틸아세테이트 분획물이 LPS로 유발된 NO생성과 iNOS, COX-2 protein 발현을 억제함으로서 항염증 반응에 관여할 것으로 사료된다.
또한 lipoxygenase를 50% 저해하는 농도(IC50)를 측정한 결과 에틸아세테이트 분획물은 9.1 μg/ml, 클로로포름 분획물은 309 μg/ml, 부탄올 분획물은 554.3 μg/ml, 물 분획물은 728.8 μg/ml을 나타내어 에틸아세테이트 분획물의 IC50값이 가장 낮게 나타났다.
특히 에틸아세테이트 분획물이 500 μg/ml에서 90% 이상의 활성을 나타내었으며, 부탄올과 물 분획물의 경우 500 μg/ml에서 50% 이상의 활성을 나타내었다. 또한 모든 분획물에서 농도 증가에 따라 활성이 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 Kim 등[18]의 백단향의 전자공여능 측정에서 메탄올 추출물의 IC50은 35.
또한 분획물의 농도 증가에 따라 활성이 증가함을 확인할 수 있었으며, 에틸아세데이트 분획물의 경우 500 μg/ml에서 90%의 활성을, 부탄올 분획물의 경우 500 μg/ml에서 80%의 활성을, 물 분획물의 경우 500 μg/ml에서 80%의 활성을 나타내어 500 μg/ml에서 가장 활성 증가가 높음을 확인할 수 있었으며, superoxide anion radical 소거능의 경우 대조군인 Vit.
이는 대조군인 카테킨의 100μg/ml의 농도에서 75%의 저해율과 비교할 때 클로포름 및 에틸아세테이트 분획물의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 분획물의 농도가 증가할수록 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 lipoxygenase를 50% 저해하는 농도(IC50)를 측정한 결과 에틸아세테이트 분획물은 9.
5 μg/ml로 나타났다. 상대적으로 Cu2+보다 Fe2+첨가의 지방산패 억제능이 더 높음을 확인하였으며, 특히 에틸아세테이트 분획물의 Fe2+ 이온 첨가에 따른 지방산패 억제 능이 가장 탁월함을 확인할 수 있었다.
34%를 억제 하였다. 이는 Byun 등[6]의 현삼 메탄올 추출물과 Kim 등[17]의 상황 H2O 추출물의 LPS로 유도된 Raw cell의 NO 생성 억제능에 미치는 결과와 비교하여 보면 카카오 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 NO 생성 억제능이 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
이는 대조군인 카테킨의 100μg/ml의 농도에서 75%의 저해율과 비교할 때 클로포름 및 에틸아세테이트 분획물의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.
09 mg TAE/g의 폴리페놀 함량이 나타났다는 보고가 있다. 이들 결과와 비교해 볼 때 카카오에도 상당한 폴리페놀이 함유됨을 확인할 수 있었다.
7 cell에 LPS (10 μg/μl)을 처리하고 1시간 뒤, 카카오 에틸아세테이트 분획물을 100 μg/ml 로 처리 한 후 24시간 배양한 후 iNOS, COX-2 protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였으며, Fig. 9, 10과 같이 LPS를 처리 하지 않은 normal 군에서는 iNOS, COX-2 protein 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 산화적 스트레스가 유발되어 염증 반응을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 iNOS protein 발현이 130 kDa에서 상당 수준으로 나타났다. 대조적으로 카카오 에틸아세테이트 분획물 100 μg/ml 농도로 처리시 LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2 protein 발현을 감소시켰다.
이상의 결과로부터 카카오 분획물의 항산화 및 항염증 효과를 효소 및 세포에서 측정하여 활성을 확인할 수 있었으며, 전반적으로 에틸아세테아트 분획물의 활성이 우수하였다. 특히 100 μg/ml 이상의 농도에서 활성이 우수함을 확인할 수있었다.
즉 카카오 분획물이 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 nitric oxide의 생성을 감소시킨 것인지, 카카오 분획물의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하는 것인지를 측정한 결과, 카카오 부탄올 분획물을 제외하고 모두 500 μg/ml까지 20%이하의 세포 독성을 나타내었으며, 부탄올 분획물은 vitamin C와 비교 시 50 μg/ml부터 농도 의존적으로 높은 세포 독성율을 보였고, 50 μg/ml에서 20% 이상의 독성을 나타내어 가장 높은 세포 독성을 나타내었다.
즉, 에틸아세테이트 분획물은 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제함을 확인할 수 있었으며 1,000 μg/ml에서 NO의 생성을 78.34%를 억제 하였다.
특히 100 μg/ml 이상의 농도에서 활성이 우수함을 확인할 수있었다.
후속연구
또한 분획물의 hyaluronidase 저해활성의 경우 100 μg/ml의 농도까지만 증가하는 경향을 보이다가 그 이후의 농도에서는 부탄올을 제외한 나머지 분획물에서는 활성의 변화를 확인할 수 없었다. 이는 농도가 증가할수록 효소와 반응한 분획물의 색이 짙어져 흡광도 수치가 높아지면서 정확한 값을 측정하기 어려웠으며, 이후 세포를 통한 메커니즘 분석에서 정확한 효능을 확인해야할 것으로 사료된다. 타 논문과 비교한 결과 Bu 등[5]의 감태에서 분리한 6개의 탄닌 화합물 IC50값에서 eckol (36.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
카카오는 무엇을 칭하는 것입니까?
)는 무덥고 습한 기후에서 잘 자라며 씨를 심어서 3~4년만에 열리기 시작하여 10~20년 자라면 가장 많이 열리고 40년이 지나면 늙어버린다. 카카오라는 이름은 원래 나무의 이름이나 발효되지 않은 pod를 언급할 때사용하였으나 최근에는 카카오나무의 열매를 따서 씨만을 꺼내어 3~9일간 45℃ 이하에서 적당히 발효시켜 만든 성숙한 씨를 지칭한다[1]. 씨(cacao bean)에는 1.
카카오에 있는 비타민과 아미노산의 피부에 대한 효과는?
5%의 starch, 15%의 protein, phenolic acid, anthocianin, leucoanthocianin, purin, tannin, theobromin 등 다수의 성분들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 카카오에는 피부노화를 방지해 주는 폴리페놀 성분이 녹차나 와인에 비해 더 많이 함유되어 있으며, 카카오에 함유된 비타민과 아미노산은 피부의 보습효과, 항염 작용, 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다[21,30].
카카오의 영양 성분 조성은?
카카오라는 이름은 원래 나무의 이름이나 발효되지 않은 pod를 언급할 때사용하였으나 최근에는 카카오나무의 열매를 따서 씨만을 꺼내어 3~9일간 45℃ 이하에서 적당히 발효시켜 만든 성숙한 씨를 지칭한다[1]. 씨(cacao bean)에는 1.3~2%의 알칼로이드, 45~58%의 유지가 있다. 이 외에도 16.5%의 starch, 15%의 protein, phenolic acid, anthocianin, leucoanthocianin, purin, tannin, theobromin 등 다수의 성분들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 카카오에는 피부노화를 방지해 주는 폴리페놀 성분이 녹차나 와인에 비해 더 많이 함유되어 있으며, 카카오에 함유된 비타민과 아미노산은 피부의 보습효과, 항염 작용, 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다[21,30].
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