PEG를 이용하여 WGA 수행 시 DNA 증폭 효율을 높이고 이를 식중독 세균의 DNA 증폭 및 검출에 적용하고자 하였다. 등온 증폭 반응인 WGA에 여러 종류의 PEG를 첨가하여 증폭한 결과, 1.5% 농도의 PEG 4,000을 첨가하는 것이 가장 효율이 높음을 알 수 있었다. 증폭 정도를 정량적으로 파악하기 위하여 3종의 식중독 세균 DNA를 이용하여 WGA를 수행하였으며 real-time PCR로 정량분석하였다. S. Typhimurium, L. monocytogenes, V. parahaemolyticus의 경우에 WGA를 하지 않은 DNA에 비하여 각각 7,777.01배, 9,981.22배, 1,239.03배 정도로 DNA의 양이 증폭되는 것을 확인하였다. 또한 PEG를 첨가함으로써 18배에서 40배의 핵산 증폭 효과가 더 있음을 알 수 있었다. 따라서 식품에 미량의 농도로 존재하는 식중독 세균은 PEG가 첨가된 WGA 반응을 통하여 검출 가능성을 높일 수 있음을 알 수 있었다.
PEG를 이용하여 WGA 수행 시 DNA 증폭 효율을 높이고 이를 식중독 세균의 DNA 증폭 및 검출에 적용하고자 하였다. 등온 증폭 반응인 WGA에 여러 종류의 PEG를 첨가하여 증폭한 결과, 1.5% 농도의 PEG 4,000을 첨가하는 것이 가장 효율이 높음을 알 수 있었다. 증폭 정도를 정량적으로 파악하기 위하여 3종의 식중독 세균 DNA를 이용하여 WGA를 수행하였으며 real-time PCR로 정량분석하였다. S. Typhimurium, L. monocytogenes, V. parahaemolyticus의 경우에 WGA를 하지 않은 DNA에 비하여 각각 7,777.01배, 9,981.22배, 1,239.03배 정도로 DNA의 양이 증폭되는 것을 확인하였다. 또한 PEG를 첨가함으로써 18배에서 40배의 핵산 증폭 효과가 더 있음을 알 수 있었다. 따라서 식품에 미량의 농도로 존재하는 식중독 세균은 PEG가 첨가된 WGA 반응을 통하여 검출 가능성을 높일 수 있음을 알 수 있었다.
In this study, polyethylene glycol (PEG) was used to improve DNA amplification efficiency during whole genome amplification (WGA). Amplification efficiency was determined by adding PEG with different molecular weights to the WGA reaction. The greatest increase in amplification efficiency was obtaine...
In this study, polyethylene glycol (PEG) was used to improve DNA amplification efficiency during whole genome amplification (WGA). Amplification efficiency was determined by adding PEG with different molecular weights to the WGA reaction. The greatest increase in amplification efficiency was obtained with PEG 4,000 used at 1.5% concentration. Foodborne pathogenic DNA was amplified by WGA and quantitatively analyzed by real-time polymerase chain reaction. DNA of Salmonella serotype Typhimurium, Listeria monocytogenes, and Vibrio parahaemolyticus was amplified 7,777.01, 9,981.22, and 1,239.03 fold, respectively, by WGA. On adding PEG in the WGA reaction (i.e., enhanced WGA [eWGA]), 18-40-fold more DNA amplification was achieved. Thus, these analyses showed that foodborne pathogens, which are usually present at very low concentration in foods, can be detected by real-time PCR and WGA.
In this study, polyethylene glycol (PEG) was used to improve DNA amplification efficiency during whole genome amplification (WGA). Amplification efficiency was determined by adding PEG with different molecular weights to the WGA reaction. The greatest increase in amplification efficiency was obtained with PEG 4,000 used at 1.5% concentration. Foodborne pathogenic DNA was amplified by WGA and quantitatively analyzed by real-time polymerase chain reaction. DNA of Salmonella serotype Typhimurium, Listeria monocytogenes, and Vibrio parahaemolyticus was amplified 7,777.01, 9,981.22, and 1,239.03 fold, respectively, by WGA. On adding PEG in the WGA reaction (i.e., enhanced WGA [eWGA]), 18-40-fold more DNA amplification was achieved. Thus, these analyses showed that foodborne pathogens, which are usually present at very low concentration in foods, can be detected by real-time PCR and WGA.
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문제 정의
PEG를 이용하여 WGA 수행 시 DNA 증폭 효율을 높이고 이를 식중독 세균의 DNA 증폭 및 검출에 적용하고자 하였다. 등온 증폭 반응인 WGA에 여러 종류의 PEG를 첨가하여 증폭한 결과, 1.
1). 그러나 WGA 반응 산물은 핵산이 다중으로 증폭되어 큰 분자 크기의 형태로 나타나므로, 증폭 정도를 육안으로 판별하기 어렵기 때문에 WGA 반응 후 multiplex PCR 반응을 통해 증폭 정도를 확인하고자 하였다. WGA를 반응시킨 후에 multiplex PCR을 수행한 결과, WGA를 하지 않은 처리구에서는 DNA band가 전혀 검출되지 않았으며 실험에 사용된 DNA 양이 감소할수록 DNA band가 희미하게 나타났다.
WGA로 DNA를 증폭하여 검출에 활용한 연구로는 오렌지주스에 존재하는 효모를 검출한 연구(15)가 보고되고 있으나 아직까지 식중독 세균 DNA를 증폭하여 검출한 연구는 보고되지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 식중독 세균의 신속 검출 기술 개발의 기초연구로서 WGA를 이용한 식중독 세균 DNA의 증폭 연구를 수행하였으며 이후 증폭된 DNA를 real-time PCR로 검출하여 분자농축 가능성을 타진하고자 하였다.
이러한 물질들은 PCR 반응에서 주형(template) DNA의 이중가닥(double strand)이 50% 정도 단일가닥(single strand)으로 바뀌는 온도인 Tm값을 변화시킴으로써 PCR 반응의 특이성(specificity)을 증가시키며 반응용액 내의 핵산이나 단백질 같은 물질들의 반응 가능성을 높여준다고 알려져 있다(16,17). 이에 본 연구팀은 보편적으로 사용되는 PEG를 등온 증폭 반응인 WGA에 첨가하여 DNA 증폭 효율 증진의 가능성을 검증하고자 하였다.
제안 방법
4가지 다른 종류의 PEG (PEG 4,000, 8,000, 20,000, 35,000)를 WGA 반응에 첨가하여 미량 존재하는 human genomic DNA를 증폭시켰다. 그 결과, PEG를 첨가시켜 WGA를 진행한 처리구와 PEG를 첨가하지 않은 처리구를 비교해 보았을 때, 전기영동 상에서 PEG를 첨가하여 WGA를 한 처리구에서 더 선명한 DNA 띠(band)를 확인하였다.
Human genomic DNA와 bacterial DNA는 SolgTM Genomic DNA Prep Kit For Blood (SolGent, Daejeon, Korea)와 SolgTM Genomic DNA Prep Kit For Bacterial cell (SolGent)를 사용하여 각각 추출하였다. DNA 추출 방법은 제조사에서 권장하는 방법에 따라 진행하였다.
5% 농도의 PEG 4,000을 첨가하는 것이 가장 효율이 높음을 알 수 있었다. 증폭 정도를 정량적으로 파악하기 위하여 3종의 식중독 세균 DNA를 이용하여 WGA를 수행하였으며 real-time PCR로 정량분석하였다. S.
대상 데이터
본 실험에 사용한 human genomic DNA는 HEK 293T cell에서 분리하여 사용하였다. 미생물균주는 ATCC (Manassas, USA)에서 분양받은 Salmonella Typhimurium ATCC 19585, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969를 사용하였다. S.
본 실험에 사용한 human genomic DNA는 HEK 293T cell에서 분리하여 사용하였다. 미생물균주는 ATCC (Manassas, USA)에서 분양받은 Salmonella Typhimurium ATCC 19585, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969를 사용하였다.
이론/모형
추출된 DNA는 SEQ-TempliGen WGA kit (SolGent)를 사용하여 증폭시켰으며 제조사에서 권장하는 방법에 따라 진행하였다. 1 µL DNA에 1 µL 1X 변성 완충용액(denaturation buffer)을 넣은 후 실온(room temperature)에서 5분 동안 반응시켰다.
성능/효과
S. Typhimurium의 경우, eWGA를 했을 때 WGA를 하지 않은 시료보다 Ct 값이 12.93 정도 단축되는 결과가 나타났는데 이는 212.93배, 즉 7,777.01배 정도 핵산 증폭 양의 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다. L.
그러나 WGA 반응 산물은 핵산이 다중으로 증폭되어 큰 분자 크기의 형태로 나타나므로, 증폭 정도를 육안으로 판별하기 어렵기 때문에 WGA 반응 후 multiplex PCR 반응을 통해 증폭 정도를 확인하고자 하였다. WGA를 반응시킨 후에 multiplex PCR을 수행한 결과, WGA를 하지 않은 처리구에서는 DNA band가 전혀 검출되지 않았으며 실험에 사용된 DNA 양이 감소할수록 DNA band가 희미하게 나타났다. 또한 1.
monocytogenes, V. parahaemolyticus의 경우에 WGA를 하지 않은 DNA에 비하여 각각 7,777.01배, 9,981.22배, 1,239.03배 정도로 DNA의 양이 증폭되는 것을 확인하였다. 또한 PEG를 첨가함으로써 18배에서 40배의 핵산 증폭 효과가 더 있음을 알 수 있었다.
4가지 다른 종류의 PEG (PEG 4,000, 8,000, 20,000, 35,000)를 WGA 반응에 첨가하여 미량 존재하는 human genomic DNA를 증폭시켰다. 그 결과, PEG를 첨가시켜 WGA를 진행한 처리구와 PEG를 첨가하지 않은 처리구를 비교해 보았을 때, 전기영동 상에서 PEG를 첨가하여 WGA를 한 처리구에서 더 선명한 DNA 띠(band)를 확인하였다. 따라서 WGA 반응에 PEG를 첨가한 것이 핵산 증폭에 효과가 있는 것으로 판단되었다(Fig.
낮은 농도의 bacterial DNA를 WGA 후 real-time PCR을 통해 증폭 효율을 비교한 결과, 세가지 균 모두 PEG를 첨가하여 WGA를 했을 때 PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 cycle 수인 Ct 값이 단축되는 양상을 나타내었다(Table 2). WGA를 실시하지 않고 real-time PCR을 수행했을 때 S.
PEG를 이용하여 WGA 수행 시 DNA 증폭 효율을 높이고 이를 식중독 세균의 DNA 증폭 및 검출에 적용하고자 하였다. 등온 증폭 반응인 WGA에 여러 종류의 PEG를 첨가하여 증폭한 결과, 1.5% 농도의 PEG 4,000을 첨가하는 것이 가장 효율이 높음을 알 수 있었다. 증폭 정도를 정량적으로 파악하기 위하여 3종의 식중독 세균 DNA를 이용하여 WGA를 수행하였으며 real-time PCR로 정량분석하였다.
그 결과, PEG를 첨가시켜 WGA를 진행한 처리구와 PEG를 첨가하지 않은 처리구를 비교해 보았을 때, 전기영동 상에서 PEG를 첨가하여 WGA를 한 처리구에서 더 선명한 DNA 띠(band)를 확인하였다. 따라서 WGA 반응에 PEG를 첨가한 것이 핵산 증폭에 효과가 있는 것으로 판단되었다(Fig. 1).
따라서 미량의 식중독 세균 DNA가 존재할 때 WGA를 통하여 35배에서 432배의 핵산 증폭 효과가 있었으며 또한 PEG를 첨가함으로써 1,239배에서 9,981배의 핵산 증폭 효과가 있음을 알 수 있었다. 균별로는 V.
또한 PEG를 첨가함으로써 18배에서 40배의 핵산 증폭 효과가 더 있음을 알 수 있었다. 따라서 식품에 미량의 농도로 존재하는 식중독 세균은 PEG가 첨가된 WGA 반응을 통하여 검출 가능성을 높일 수 있음을 알 수 있었다.
WGA를 반응시킨 후에 multiplex PCR을 수행한 결과, WGA를 하지 않은 처리구에서는 DNA band가 전혀 검출되지 않았으며 실험에 사용된 DNA 양이 감소할수록 DNA band가 희미하게 나타났다. 또한 1.5% 농도의 PEG 4,000을 WGA 반응에 첨가하였을 때 다른 처리구보다 더 선명한 DNA band를 나타내어 PEG 4,000이 WGA에 의한 DNA 증폭 효과가 가장 우수한 것으로 판단되었다(Fig. 2).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식중독 세균이 국내외 가공식품과 즉석식품에서 다양하게 검출되고 있으며 이에 따라 식중독 발생이 증가하고 있는 원인은 무엇인가?
식중독 세균은 최근 식생활 패턴 변화, 지구 온난화 현상, 수명 연장에 의한 노인 인구와 같은 취약 인구 증가, 실내온도 상승 등 환경변화로 인하여 국내외 가공식품과 즉석식품에서 다양하게 검출되고 있으며 이에 따라 식중독 발생이 증가하고 있다(1). 2014년 우리나라에서 발생된 식중독 발생건은 349건, 식중독 환자 수는 7,466명으로 보고되고 있다(2).
2014년 우리나라에서 발생된 식중독 발생 건은 몇 건이고 식중독 환자 수는 몇 명인가?
식중독 세균은 최근 식생활 패턴 변화, 지구 온난화 현상, 수명 연장에 의한 노인 인구와 같은 취약 인구 증가, 실내온도 상승 등 환경변화로 인하여 국내외 가공식품과 즉석식품에서 다양하게 검출되고 있으며 이에 따라 식중독 발생이 증가하고 있다(1). 2014년 우리나라에서 발생된 식중독 발생건은 349건, 식중독 환자 수는 7,466명으로 보고되고 있다(2). 미국의 경우, 미국 질병 관리센터 자료에 의하면 Salmonella spp.
식중독 세균 중 Salmonella spp.를 검출하는 걸리는 시간은 어느 정도인가?
식중독 세균을 검출하기 위해서는 비교적 오랜 시간이 요구된다. Salmonella spp.의 경우 증균배양, 분리배양을 거쳐 확인시험과 혈청시험 등의 과정이 필요하기 때문에 일주일 정도가 소요된다. 이러한 단점을 극복하고 식중독 세균을 신속하게 검출하기 위한 기술로 식중독 세균의 DNA 분석을 기반으로 하는 PCR 방법이 현재 보편적으로 사용되고 있다(4).
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