식중독 세균 검출에 있어서 리포좀의 이용 가능성을 병원성 식중독 세균인 E. coli O157:H7을 대상으로 검토하였다. 리포좀의 표면에 E. coli O157:H7을 인식하는 항체를 공유결합시키고 리포좀의 내부 수용액상에는 형광 표지물질인 sulforhodamine B를 포집시켰다. 이렇게 합성된 면역리포좀이 진단시약으로써의 기능을 하는지 알아보기 위해 두 가지 분석 방법을 적용하였다. 첫번째 방법으로써, test-strip을 이용한 분석은 E. coli O157:H7의 존재 유무를 test-strip 상에 나타난 분석 신호을 육안으로 관찰하는 것으로써 E. coli O157:H7 존재시 분석 신호가 저하되는 것을 원리로하였다. 이 방법은 고가의 실험 장비가 필요하지 않아 현장적용성이 용이한 장점이 있다. 두번째 방법은, IMS 후 목표 세균에 결합되어 있는 리포좀을 파괴시켜 나오는 형광도의 세기를 측정하는 방법으로 이때는 형광도의 강도와 E. coli O157:H7 세균 수와 비례적 관계가 나타났다. 상기의 두 방법에서 얻은 결과는, 리포좀을 E. coli O157:H7 검출에 응용할 수 있는 가능성을 제시하며 추후에 식품 적용 실험이 요구된다.
식중독 세균 검출에 있어서 리포좀의 이용 가능성을 병원성 식중독 세균인 E. coli O157:H7을 대상으로 검토하였다. 리포좀의 표면에 E. coli O157:H7을 인식하는 항체를 공유결합시키고 리포좀의 내부 수용액상에는 형광 표지물질인 sulforhodamine B를 포집시켰다. 이렇게 합성된 면역리포좀이 진단시약으로써의 기능을 하는지 알아보기 위해 두 가지 분석 방법을 적용하였다. 첫번째 방법으로써, test-strip을 이용한 분석은 E. coli O157:H7의 존재 유무를 test-strip 상에 나타난 분석 신호을 육안으로 관찰하는 것으로써 E. coli O157:H7 존재시 분석 신호가 저하되는 것을 원리로하였다. 이 방법은 고가의 실험 장비가 필요하지 않아 현장적용성이 용이한 장점이 있다. 두번째 방법은, IMS 후 목표 세균에 결합되어 있는 리포좀을 파괴시켜 나오는 형광도의 세기를 측정하는 방법으로 이때는 형광도의 강도와 E. coli O157:H7 세균 수와 비례적 관계가 나타났다. 상기의 두 방법에서 얻은 결과는, 리포좀을 E. coli O157:H7 검출에 응용할 수 있는 가능성을 제시하며 추후에 식품 적용 실험이 요구된다.
Feasibility tests on using liposomes for detecting food-borne pathogenic bacteria were studied with E. coli 0157:H7 as a model analyte. lmmunoliposomes, whose surface was conjugated with anti-E. coli 0157:H7 IgG and which encapsulated the marker dye, sulforhodamine B, were used for the detection lab...
Feasibility tests on using liposomes for detecting food-borne pathogenic bacteria were studied with E. coli 0157:H7 as a model analyte. lmmunoliposomes, whose surface was conjugated with anti-E. coli 0157:H7 IgG and which encapsulated the marker dye, sulforhodamine B, were used for the detection label. Among the feasibility tests, the first test was to use a test-strip on which antibodies to anti-E. coli O157:H7 IgG were immobilized. In this format, immunoliposomes that did not bind to E. coli O157:H7 in sample were captured and then exhibited a visible signal which was inversely related with the number of E. coli O157:H7 in sample. The second test was a direct liposome assay followed by immunomagnetic separation. In this format, immunoliposomes which were bound to E. coli O157:H7 were lysed with detergent and produced a signal which was proportionally related with the number of E. coli O157:H7 in sample. The results from both formats indicate that liposomes can be utilized as a detection label.
Feasibility tests on using liposomes for detecting food-borne pathogenic bacteria were studied with E. coli 0157:H7 as a model analyte. lmmunoliposomes, whose surface was conjugated with anti-E. coli 0157:H7 IgG and which encapsulated the marker dye, sulforhodamine B, were used for the detection label. Among the feasibility tests, the first test was to use a test-strip on which antibodies to anti-E. coli O157:H7 IgG were immobilized. In this format, immunoliposomes that did not bind to E. coli O157:H7 in sample were captured and then exhibited a visible signal which was inversely related with the number of E. coli O157:H7 in sample. The second test was a direct liposome assay followed by immunomagnetic separation. In this format, immunoliposomes which were bound to E. coli O157:H7 were lysed with detergent and produced a signal which was proportionally related with the number of E. coli O157:H7 in sample. The results from both formats indicate that liposomes can be utilized as a detection label.
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문제 정의
이렇게 개발된 방법들은 리포좀을 면역화학 분야에서 분석 도구로 이용 가능하게 하였다. 본 연구에서는 식중독 세균 검출에 있어서 리포좀의 이용 가능성을 알아보고자 대표적인 식중독 세균인 E. coli O157:H7을 대상으로 test・strip을 이용한 방법과 리포좀을 파괴시켜 형광도를 측정하는 두 종류의 분석 방법을 검토하였다.
이 시료는 다시 선택적강화배양을 위해 조성된 배지로 옮겨지며 이때 목적균은 성장하는 반면 내재 미생물은 억제된다. 필요한 경우 postenrichment 단계가 수반되기도 하는데, 이는 선택적으로강화배양된 목적 세균을 검출 용이한 수준으로 더 증폭하는데 목적이 있다. 이렇게 강화배양된 시료는 선택차별배지에도말되고 이때 생성된 균 집락의 특성을 기초로 세균의 정체가 추정적으로 밝혀진다.
모세관 현상에 의하여 수용액이 test-strip의 싱단부에 이를 때까지 기다린다. Test-strip의 capture zone에 나타난분석 신호를 육안으로 관찰한다.
따라서 엄격한 실험 조건 아래에서도 리포좀 합성시 다양한 크기의 소포가 생기게 된다. 단일크기의 입자를 얻기 어려운 점을 개선시키고자 Szoka 등 (1980)이 보고한 자료를 참고로 하여 리포좀 제조 과정 단계에서 일정 크기의 구멍 크기를 갖는 syringe filter를 통과시 켰다. Fig.
리포좀은 reverse-phase evaporation 방법 (Siebert et al., 1993; Szoka et al., 1980)을 변형하여 다음과 같이 합성하였다.
본 분석 방법은 E. coli O157:H7을 면역리포좀과 반응시킨 후 비반응 면역리포좀을 test-strip 상에서 포획함으로써분석 신호를 얻는 것이다(Fig. 3). 따라서 분석 신호의 강도는 시료 내 균수와 반비례 관계를 나타내며 전형적인 분석결과의 예는 Fig.
결합되지 않은 항원은 몇 번의 수세과정에서 제거된다. 이후 효소 결합형의 2차 항체를 첨가하고 이 효소에 대한 기질을 가하며 효소 반응이 종료되면 나타나는 색깔의 형성 정도를 육안으로 관찰하거나 흡광도를이용해 정량화한다. ELISA 이외의 다양한 면역 분석법으로는 목표 분석원으로 또는 이에 대한 항체로 coating된 latex 입자를 이용하여 응집반응을 보는 latex agglutination과 immunodiffusion, 목표 분석원에 대한 항체가 coating된 dipstick을 이용하는 방법 등이 있다.
2 순서로 연결한 후 리포좀액을 통과시킨다. 통과된 액을 Sephadex G-50-150 column 에 통과시켜 SRB 가 포집된 리포좀 분획만을 모아0.15 M NaCl을 포함하는 0.02 M trizma base(0.02 M TBS),pH 7.0, 완충액으로 투석한다.
대상 데이터
0.2, 0.4, 3 m의 구멍 크기를 갖는 polycarbonate syringe filters 는 Poretics(Livermore, CA, USA), nitrocellulose mem- branes는 Sartorius(Goettingen, Germany)에서 구입하였다. E.
75 mm X 12 mm(높이 X 외경) 크기의 시험관에 IMS를 위해 IMB 20 를 첨가한다. 시료당 세 개의 시험관에negative control로써 살균된 TSB 1 mL과 시료로써 E.
coli O157:H7에 대한 항체는 Kirkegaard & Perry Labora- tories(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하거나 뉴질랜드산가토에서 생산하였다. Ae-Succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA), Ae-[kappa-Maleimidoundecanoyloxy]-sulfosuccinimide ester(sulfb-KMUS), hydroxylamine hydrochloride는 Pierce (Rockford, IL, USA), Trypticase Soy Broth(TSB), Sorbitol MacConKey Agar(SMAC)는 Difbo Laboratories(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. E.
Ae-Succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA), Ae-[kappa-Maleimidoundecanoyloxy]-sulfosuccinimide ester(sulfb-KMUS), hydroxylamine hydrochloride는 Pierce (Rockford, IL, USA), Trypticase Soy Broth(TSB), Sorbitol MacConKey Agar(SMAC)는 Difbo Laboratories(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. E. coli O157:H7(ATCC 43895)는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD,USA)으로부터 구입하였다.
Dynabeads anti-£. coli 0157 inununomagnetic beads(IMB), magnetic particle concentrator(MPC)^- Dynal Inc. (Lake Success, NY, USA)에서 구입하였다.
성능/효과
5와 같다. E coll O157:H7 순수 배양액으로 실험을 실시한 결과, 104 CFU/mL 에서 negative control(즉 0 CFU/mL) 과 구별되는 분석 신호의 증가가 나타나기 시작하여 생균수가 1 CFU/ mL 이상의 경우는 뚜렷한 분석 신호의 증가가 나타나는 것으로 보아 이 범위의 오염도에서는 E coll O157:H7를쉽게 검출할 수 있을 것이다(Fig. 6). 이 결과는 적은 수의 균이 시료에 오염되어 있을 경우, 어느 정도의 강화배양을 통하여 균수를 증폭시킨 후 목적균을 분석해야 함을 의미한다.
Reverse-phase evaporation 방법에 의해 합성한 리포좀이 실제 어떤 모양을 가지고 있는지 확인하기 위해 투과전자현미경하에서 관찰한 결과 구형의 소포임을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 대략 직경 250 nm를 중심으로 다양한 크기의 소포가 분포되어 있음을 알 수 있었다(Fig.
후속연구
이렇게 강화배양된 시료는 선택차별배지에도말되고 이때 생성된 균 집락의 특성을 기초로 세균의 정체가 추정적으로 밝혀진다. 이들 분리균의 동정은 일련의 생화학적 검사를 거쳐 확인되며 균에 따라서는 혈청학적 방법에의한 추가 확인이 필요하다. 이상의 전통적 방법은 효과적이어서 오랫동안 식품 병원성 세균을 분리, 동정하는데 이용되어 왔지만 그 과정은 매우 노동 집약적이다.
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