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문제 정의
- 또한, 확립된 OPLS-DA 판별 모델을 이용하여 14개의 참당귀 시료를 분석하여 산지 예측을 해본 결과, 13개 시료에서 정분류 됨을 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과를 활용하여 한약 동일종의 원산지 판별모델 확립과 과학적인 관리에 적용할 수 있으리라 판단되기에 보고 하고자 한다.
제안 방법
- 본 연구에서는 국내 및 중국의 각 재배지에서 직접 수집한 참당귀를 수증기 증류하여 얻은 휘발성분을 GC/MS로 분석하였다. 각 peak의 mass spectrum pattern에 대하여 NIST library에서 일치하는 성분을 규명하였고 gas chromatogram의 peak intensity 분석을 통해 정량분석한 후, 그 결과에 대하여 PCA, OPLS-DA 등 다변량 통계 분석을 수행함으로써 참당귀의 원산지 판별모델을 확립하였다.
- 0 ㎖/min로 사용하였다. 주입구 온도는 250℃로 정하였고 분할 주입 (1 : 1) 방법을 사용하였으며, 컬럼온도는 50℃에서 4분간 유지시킨 후 5℃/min로 280℃까지 올리고 10분간 유지하였다. 이온검출 방법은 스캔모드를 사용하여 EI (Electron Impact Ionization, 70.
- 주입구 온도는 250℃로 정하였고 분할 주입 (1 : 1) 방법을 사용하였으며, 컬럼온도는 50℃에서 4분간 유지시킨 후 5℃/min로 280℃까지 올리고 10분간 유지하였다. 이온검출 방법은 스캔모드를 사용하여 EI (Electron Impact Ionization, 70.0 eV) 법으로 m/z값 50 -500 범위를 조사하였다. 분석과정 상의 오차를 줄이기 위해, 시험시료의 분석 순서는 산지나 번호순으로 하지 않고 임의의 순서를 정하여 분석하였다.
- 0 eV) 법으로 m/z값 50 -500 범위를 조사하였다. 분석과정 상의 오차를 줄이기 위해, 시험시료의 분석 순서는 산지나 번호순으로 하지 않고 임의의 순서를 정하여 분석하였다.
- GC-MS 분석을 통해 얻은 피크는 NIST08 mass spectral library의 데이터 베이스를 이용하여 동정하였다 (NIST, 2008). 통계학적 분석을 위해 각 시료의 Total Ion Chromatography (TIC)로부터 나온 GC-MS (time vs intensity) 데이터를 ASCII file로 변환하여 엑셀 파일 (*.csv)로 저장하였다. 각 시료들 사이에 존재하는 실험오차를 보정하고 통계분석에 사용되는 변수의 수를 줄이기 위해 GC-MS 데이터의 변수를 0.
- SIMCA-P, ver 11.0 software (Umetrics, Umea, Sweden)를 이용해 chemometric method인 PCA, PLS-DA (Partial Least Squares-Discriminant Analysis), OPLS-DA 분석을 수행하였다.
- PLS-DA에서도 PCA에서 보다는 약간 개선되었지만, 각각 7개의 국내산 참당귀와 3개의 중국산 참당귀가 중첩되어 역시 모델 확립에는 적합하지 않았다 (data not shown). Fig. 2에 나타난 바와 같이, OPLS-DA에서는 국내산 참당귀와 중국산 참당귀의 모든 시료가 중첩되지 않고 잘 분리되었으며, 따라서 OPLS-DA를 이용하여 참당귀의 산지 판별 모델을 확립하였다. 한편, PCA는 독립변수만을 이용하여 새로운 주성분을 구하고 그 주성분을 이용하여 회귀식을 구하는 반면, PLS는 독립변수뿐만 아니라 종속변수를 동시에 고려하여 새로운 변수를 찾고 이를 이용하여 회귀식을 구하므로 PCA보다는 PLS에서 더욱 개선된 결과를 얻을 수 있다.
- 국내산 참당귀와 중국산 참당귀를 판별할 수 있는 마커 대사체를 검출하기 위해 OPLS-DA 분석으로부터 얻어진 VIP score가 1.0 이상으로 유의성이 있는 변수 (variable)를 선발하고 더욱 정확한 결과를 위해 그 중에 표준오차가 1.0 미만인 것을 추출하였다 (Fig. 3). VIP plot은 두 그룹을 나뉘게 하는데 기여를 한 순서에 따라 분류된다.
- 이상과 같이 확립된 국내산 참당귀와 중국산 참당귀의 OPLS-DA 판별모델의 정확도를 검증하고자 미지시료의 분석 값을 적용하였다. 이미 산지를 알고 있는 시료인 국내산 6개와 중국산 8개를 미지시료로 정하여 수증기 증류로 얻은 휘발성 분획을 GC/MS로 분석하였다.
- 이상과 같이 확립된 국내산 참당귀와 중국산 참당귀의 OPLS-DA 판별모델의 정확도를 검증하고자 미지시료의 분석 값을 적용하였다. 이미 산지를 알고 있는 시료인 국내산 6개와 중국산 8개를 미지시료로 정하여 수증기 증류로 얻은 휘발성 분획을 GC/MS로 분석하였다. 이 때 분석 순서는 무작위로 정하여 수행함으로써 주관적 예측과 판별은 지양하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 재료는 보건복지부 2010년도 식물대사체 연구팀 (주관기관 대전대학교)에서 직접 수집한 참당귀(Angelica gigas Nakai)로서 중앙대학교 약학대학의 황완균 교수님과 대전대학교 한의과대학 본초학교실 서영배 교수님께서 각 재배지에서 식물학적 기원을 지상부의 외형과 근경의 현미경적 관찰로 확인하였고, 재배농가에서 수확하여 건조한 약재를 직접 수집한 것으로 국내산 참당귀 25 종류와 중국산 참당귀 40 종류이다. 국내산은 경북 봉화군과 영천시, 충북 제천시, 강원 홍천군, 경남 함양군에서 수집하였고, 중국산은 길림성의 연변 (Yanbian), 통화 (Tonghwa), 훈춘 (Hunchun), 그리고 백산 (Baishan), 저장성 단동 (Dandong)과 후순 (Fushun), 감수성 (Gansu), 흑룡강성 (Heilongjiang)에서 수집 하였다 (Table 1).
- 본 연구에 사용한 재료는 보건복지부 2010년도 식물대사체 연구팀 (주관기관 대전대학교)에서 직접 수집한 참당귀(Angelica gigas Nakai)로서 중앙대학교 약학대학의 황완균 교수님과 대전대학교 한의과대학 본초학교실 서영배 교수님께서 각 재배지에서 식물학적 기원을 지상부의 외형과 근경의 현미경적 관찰로 확인하였고, 재배농가에서 수확하여 건조한 약재를 직접 수집한 것으로 국내산 참당귀 25 종류와 중국산 참당귀 40 종류이다. 국내산은 경북 봉화군과 영천시, 충북 제천시, 강원 홍천군, 경남 함양군에서 수집하였고, 중국산은 길림성의 연변 (Yanbian), 통화 (Tonghwa), 훈춘 (Hunchun), 그리고 백산 (Baishan), 저장성 단동 (Dandong)과 후순 (Fushun), 감수성 (Gansu), 흑룡강성 (Heilongjiang)에서 수집 하였다 (Table 1). 이들 시료 중 국내산은 19개, 중국산은 32 개의 시료를 분석하여 판별모델의 확립에 사용하였고, 모델의 검증을 목적으로 국내산 6개, 중국산 8개의 시료를 사용하여 산지예측을 하였다.
- 국내산은 경북 봉화군과 영천시, 충북 제천시, 강원 홍천군, 경남 함양군에서 수집하였고, 중국산은 길림성의 연변 (Yanbian), 통화 (Tonghwa), 훈춘 (Hunchun), 그리고 백산 (Baishan), 저장성 단동 (Dandong)과 후순 (Fushun), 감수성 (Gansu), 흑룡강성 (Heilongjiang)에서 수집 하였다 (Table 1). 이들 시료 중 국내산은 19개, 중국산은 32 개의 시료를 분석하여 판별모델의 확립에 사용하였고, 모델의 검증을 목적으로 국내산 6개, 중국산 8개의 시료를 사용하여 산지예측을 하였다. 진균 (fungi) 오염이 확인된 시료를 제외 하고 산지별 건조시료 10 g을 취해 세절 후 분쇄하였다.
- 간략히 기술하면, 10 g의 시료에 250 ㎖의 증류수를 넣고 80℃에서 6시간 동안 수증기증류 하였다. 증류물이 포집된 에테르 (J.T. Baker, Philipsburg, NJ, USA) 분획에무수 황산나트륨 (Junsei, Tokyo, Japan)을 넣어 탈수한 후, 건조시켜 헥산 (J.T. Baker, Philipsburg, NJ, USA)으로 용해하여 GC/MS 분석시료로 사용하였다.
- 25 ㎜, film thickness 250 ㎛, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 운반기체로 순도 99.999% 헬륨가스를 유속 1.0 ㎖/min로 사용하였다. 주입구 온도는 250℃로 정하였고 분할 주입 (1 : 1) 방법을 사용하였으며, 컬럼온도는 50℃에서 4분간 유지시킨 후 5℃/min로 280℃까지 올리고 10분간 유지하였다.
데이터처리
- 본 연구에서는 국내 및 중국의 각 재배지에서 직접 수집한 참당귀를 수증기 증류하여 얻은 휘발성분을 GC/MS로 분석하였다. 각 peak의 mass spectrum pattern에 대하여 NIST library에서 일치하는 성분을 규명하였고 gas chromatogram의 peak intensity 분석을 통해 정량분석한 후, 그 결과에 대하여 PCA, OPLS-DA 등 다변량 통계 분석을 수행함으로써 참당귀의 원산지 판별모델을 확립하였다. 또한, 확립된 OPLS-DA 판별 모델을 이용하여 14개의 참당귀 시료를 분석하여 산지 예측을 해본 결과, 13개 시료에서 정분류 됨을 확인할 수 있었다.
- GC-MS 분석을 통해 얻은 피크는 NIST08 mass spectral library의 데이터 베이스를 이용하여 동정하였다 (NIST, 2008). 통계학적 분석을 위해 각 시료의 Total Ion Chromatography (TIC)로부터 나온 GC-MS (time vs intensity) 데이터를 ASCII file로 변환하여 엑셀 파일 (*.
- csv)로 저장하였다. 각 시료들 사이에 존재하는 실험오차를 보정하고 통계분석에 사용되는 변수의 수를 줄이기 위해 GC-MS 데이터의 변수를 0.2 min 간격으로 더하는 데이터 binning을 수행하였다. 예를 들면 4.
- 0 미만인 것을 선택하였다. 그리고 통계프로그램인 SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 oneway ANOVA (analysis of variance)를 통하여 p-value가 0.05 미만인 변수를 추출하였다.
이론/모형
- 각각의 시료로부터 정유를 추출하기 위해, 유럽 약전 (EDQM, 2015)에 기재되어 있는 Clevenger-type apparatus를 이용한 수증기증류 방법을 사용했다 (Clevenger, 1928; Özek et al., 2010).
- Kim 등 (2006)의 방법을 기초로, 정유성분 분석을 위하여 Bruker 320-MS GC quadrupole mass spectrometer (Bruker, Billerica, MA, USA)를 사용하였으며 컬럼은 HP-5MS (30 m × 0.25 ㎜, film thickness 250 ㎛, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다.
- Lee 등 (2013)의 방법을 기초로 OPLS-DA 분석을 통해 VIP (Variable Importance in the Projection)를 얻어 유의성 있는 변수를 추출하였다. VIP는 두 집단이 나뉘었을 경우 변수들마다 기여한 정도의 차이를 나타내며, 두 그룹을 구분하는데 가장 기여한 정도가 큰 변수들을 찾아내기 위해 사용되었다.
성능/효과
- 각 peak의 mass spectrum pattern에 대하여 NIST library에서 일치하는 성분을 규명하였고 gas chromatogram의 peak intensity 분석을 통해 정량분석한 후, 그 결과에 대하여 PCA, OPLS-DA 등 다변량 통계 분석을 수행함으로써 참당귀의 원산지 판별모델을 확립하였다. 또한, 확립된 OPLS-DA 판별 모델을 이용하여 14개의 참당귀 시료를 분석하여 산지 예측을 해본 결과, 13개 시료에서 정분류 됨을 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과를 활용하여 한약 동일종의 원산지 판별모델 확립과 과학적인 관리에 적용할 수 있으리라 판단되기에 보고 하고자 한다.
- 화살표 및 숫자로 표기한 피크는 NIST mass spectra library를 이용하여 동정한 피크를 표시한 것이다. GC/MS 분석으로 얻은 TIC 및 MS fragment 양상을 기초로 NIST mass spectra library부터 대사체의 정성분석이 용이했다. 한편, 중국산과 국내산 참당귀 시료의 피크 intensity와 양상이 다른 것을 육안으로 확인할 수 있었다.
- Table 4에 나타낸 바와 같이, VIP와 SPSS를 통해 동시에 추출된 유의성 있는 변수들 중 GC/MS NIST library 탐색을 통해 동정된 성분은 styrene (7.19 min), α-pinene (8.95 min), β-terpinene (9.86 min)으로 총 3 가지의 마커 대사체를 얻을 수 있었다 (Table 4).
- 그 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이 총 14개의 시료 중 중국산 1개 시료를 제외하고 13개의 시료가 정분류 되었으며 정확도는 93%이었다.
- PCA, PLS-DA, OPLS-DA 등의 다변량 통계분석법을 시도해 본 결과, PCA는 각각 9개의 국내산 참당귀와 7개의 중국산 참당귀가 중첩되어 모델 확립에는 적합하지 않았다 (data not shown). PLS-DA에서도 PCA에서 보다는 약간 개선되었지만, 각각 7개의 국내산 참당귀와 3개의 중국산 참당귀가 중첩되어 역시 모델 확립에는 적합하지 않았다 (data not shown).
- 한편, Tianniam 등 (2008)은 일당귀 (Angelica acutiloba)의 당, 유기산과 아미노산 등을 GC-TOF MS로 분석하고 PCA를 통한 산지판별모델을 보고하였다. 즉, 일본의 4개 산지로부터 구입한 일당귀의 1, 2차 대사물질의 분포양상에 따라 PCA score의 값에 차이가 확인되었으며 판별의 유의성을 제시하였다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 보면, GC/MS 분석을 기반으로 대사 체학 기법을 사용하여 한약의 원산지 판별모델을 확립함으로써 국내산 참당귀와 중국산 참당귀의 과학적인 관리에 적용할 수 있을 것이며, 나아가 다른 한약의 원산지 판별모델을 확립하는데도 기여할 것으로 사료된다. 한편, 본 연구에서는 수확 후 건조한 당해연도의 시료를 사용하였기 때문에 연차에 따른 변수를 고려하지 않았으나, 한약재의 대사체는 연차 및 건조 조건과 건조 후 저장조건에 따라 변할 수 있으므로 이점을 고려하여 분석시료를 수집해야할 것이다. 또한 이러한 대사체학 연구에 의해 한약의 과학적 관리가 용이해짐으로써 한약발전에도 크게 기여할 것을 확신한다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, GC/MS 분석을 기반으로 대사 체학 기법을 사용하여 한약의 원산지 판별모델을 확립함으로써 국내산 참당귀와 중국산 참당귀의 과학적인 관리에 적용할 수 있을 것이며, 나아가 다른 한약의 원산지 판별모델을 확립하는데도 기여할 것으로 사료된다. 한편, 본 연구에서는 수확 후 건조한 당해연도의 시료를 사용하였기 때문에 연차에 따른 변수를 고려하지 않았으나, 한약재의 대사체는 연차 및 건조 조건과 건조 후 저장조건에 따라 변할 수 있으므로 이점을 고려하여 분석시료를 수집해야할 것이다.
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