초록이 없습니다.

AI 본문요약

엑셀 다운로드

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

• 연구 주제
• 연구 방법
• 연구 결과

문제 정의

• gracilis)가 산업적으로 유용성을 갖기 위해서는 어류 자치어가 요구하는 기능성 물질은 높게 유지하면서 경제성 있는 배양방법의 개발이 절실하다. 따라서 이번 연구에서는 그 기초실험의 일환으로 배양방법에 따른 유글레나의성장과 지질영양학적인 변화를 조사하고자 하였다.

제안 방법

• 사용하였다. 타가영양배양과 혼합영양배양은 Cramer-Myers medium 를 기본 배지로 사용하여 Glucose 15 g/L, Sodium glutamate 5 g/L 추가하여 제조하였으며, 각각의 배지별로 제조한 후 121℃에서 15분간 고압멸균하였다.
• 배양방법은 자가영양배양(Autotrophic culture), 타가영양배양(Heterotrophic culture) 그리고 혼합영양배양(Mixotrophic culture)으로 하였다. 자가영양배양방법은 1 L 둥근플라스크에 500 mL 용량으로 배양하였으며, 광주기는 18L:6D, 주간의 조도는 3, 000 lx로 유지하였고, Air는 0.
• 하였다. 자가영양배양방법은 1 L 둥근플라스크에 500 mL 용량으로 배양하였으며, 광주기는 18L:6D, 주간의 조도는 3, 000 lx로 유지하였고, Air는 0.20 µm sterilized air filter (Advantec mfs, Inc., Japan)를 통해 공급하였다. 타가 영양배양 방법은 500 mL 삼각플라스크를 이용하여 200 mL 용량으로 배양하였으며, 광주기는 0L:24D로 하였으며, 교반은 진탕배양기 (KSI-200L, Koencon Co.
• , Ltd)를 이용하여 120 rpm으로 하였다. 혼합영양배양방법은 500 mL 삼각플라스크를 이용하여 200 mL 용량으로 배양하였으며, 광주기는 18L:6D, 주간의 조도는 3, 000 lx로 유지하였다. 이때 모든 실험구의 배양온도는 25±0.
• 5℃로 유지하였다. 초기 접종밀도는 10×10⁴ cells/mL 로 7일간 3반복으로 배양하였고, 2회/일 동일한 시간에 Haemacytometer로 3회 반복 계수하여 평균 세포수를 측정계 수하였으며, 배양이 완료된 배양액은 4℃의 고속원심분리기(UNION32R, Hanil Science Industrial Co., Ltd. Korea)에서 3, 000 rpm으로 25분간 원심분리한 후, 배양액은 버리고 세포만 회수하여 동결 건조하여 분석에 사용하였다.
• , Tokyo, Japan)에서 15,000 rpm로 5분간 분쇄한 후, Chloroform과 Methanol을 2:1로 혼합한 추출 용매를 시료의 2 배량 넣어 하루 동안 방치한 다음 chloroform 층만을 분리하기 위하여 둥근 플라스크 위에 깔때기를 놓고, 그 위에 Na₂SO₄를 넣어 서서히 chloroform층만 흘러내리게하였다. 분리된 chloroform 층은 진공회전농축기(Rotavapor R-114, BUCHI)를 사용하여 40℃이하에서 용매를 완전히 증발시킨 후, 추출된 총 지질의 무게를 측정하였다. 모든 작업은질소 기류 하에서 행하였다.
• 지질의 classes 는 TLC/FID와 Iatrorecorder TC-21 intergrator가 장착된 Iatroscan New MK-5 (Iatron Laboratory Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 분석조건에서 공기의유속은 2 L/min이며 detector 수소량은 160 mL/min으로, scanning speed는 0.
• 30 cm/s로 하였다. 분석 과정은 먼저 Rod S-Ⅲ (0.9×150 mm, 석영봉 규산 코팅)를 5분간 수세한 후, 다시 증류수 10 mL로 헹군 다음 수분을 증발시키기 위하여 아세톤 10 mL로 씻고 50℃로 조정한 Rod-Dryer (TK-5 Iatron Lab. Inc., Tokyo, Japan)에서 5분간 건조시킨 후 Iatroscan내에서 수소염이온화불꽃상에서 3회 이상 반복하여 유기물을 완전히 제거시켰다. Rod에 시료 1 μL를 Microdispenser (Drummond Scientific Co.
• , Bromall, PA, USA)로써 점적하여 전개조 (NaCl로 포화시킴)에서 10분간 포화시켰다. 전개용매는 n-hexane : diethyl ether : acetic acid = 97:3:1 (v/v)를 이용하여 약 10 cm까지 전개시킨 후, Rod를 전개조에서 꺼내고 Rod-Dryer에서 5분간 건조시켜서 Iatroscan으로 분석하여 지질 획분의 조성비를 구하고 그 함량을 산출하였다. 동정은 표품인 cholesterol ester, free fatty acid, triglyceride, cholesterol 및 phospholipid에 의하여 동정하였다.
• 즉시 3 mL의 포화식염수를 가한 다음 흔들어 방치하여 iso-octane 층이 분리되도록 하였다. Iso-octane층을 시료 병(4 mL)에 옮긴 후, 다시 Iso-octane 1 mL를 첨가한 다음 흔들어 재추출하여 시료 병에 모으고 이를 지방산 methyl ester 시료로 하였다. 지방산 분석에 사용하는 GLC는 Omegawax^TM-320 fused-silica capillary column (30 m×0.
• 0 kg/cm²)을 사용하였다. 지방산의 분석은 동일 조건에서 분석한 표준품의 ECL과 비교하여 동정하였고,지방산 표준품은 14:0, 16:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 22:1, 24:0 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)과 GC-MS로 동정된 menhaden oil을 사용하였다.
• 배양방법에 따른 세포의 성장 실험은 실험구마다 동일하게 10 X 104 cells/mL로 접종하였다. 자가영양배양방법을 통한 배 양 결과는 초기 배양 밀도 10.2 X 104 cell/mL로 접종한 후 12시간 간격으로 성장을 측정하였다. 그 결과 접종 이후 24시간 경과 19.
• 0 g/ L였다. 타가영양배양방법을 통한 배양 결과는 초기 배양 밀도 10.2×104 cell/mL로 접종한 후 12시간 간격으로 성장을 측정하였다. 최초 접종 후 24시간 경과 42.
• 이러한 경향은 초기 투여된 배지가 모두 소진되어 더 이상 성장을 할 수 없는 배양조건이 된 것으로 보여짐에 따라 타가영양배양의 경우 배양 시작 후 84시간전후로 추가 배지 공급이 이루어져야 지속적인 성장이 이루어질 것으로 사료된다. 혼합영양배양방법으로 배양한 결과는 초기 배양 밀도 10.2×10⁴ cell/mL로 접종한 후, 12시간 간격으로 성장 측정을 하였다. 그 결과 접종 후 24시간 경과 45.

대상 데이터

• 본 실험에 사용된 유글레나는 한국 해양미세조류은행으로부터 Euglena gracilis KMMCC-1351를 분양 받아 사용하였으며, 배양에 사용한 기본배지는 Table 1에 나타낸 바와 같이 Cra-mer-Myers medium (Cramer and Myers, 1952)을 사용하였다. 타가영양배양과 혼합영양배양은 Cramer-Myers medium 를 기본 배지로 사용하여 Glucose 15 g/L, Sodium glutamate 5 g/L 추가하여 제조하였으며, 각각의 배지별로 제조한 후 121℃에서 15분간 고압멸균하였다.

데이터처리

• 모든 자료는 SPSS (16.0) 프로그램을 이용하여 분산분석 (one-way ANOVA)과 회귀분석(Regression Analysis)을 실시하여 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 평균 간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.

이론/모형

• 총 지질 추출은 Bligh and Dyer방법(1959)에 준하였다. 비커에 균체 5 g을 취하여 세포분쇄기(homogenizer AM-12, Nihonseiki Kaisha Co.

성능/효과

• 2 X 104 cell/mL로 접종한 후 12시간 간격으로 성장을 측정하였다. 그 결과 접종 이후 24시간 경과 19.8×10⁴ cell/mL, 48시간 경과 27.3×10⁴ cell/mL, 72시간경과 31.8×10⁴ cell/mL, 96시간 경과 49.7×10⁴ cell/mL, 120 시간 경과 45.0×10⁴ cell/mL, 144시간 경과 61.3×10⁴ cell/ mL로 증가하였으며 그 이후 감소하는 경향을 나타냈다. 이로서 자가영양배양에 의한 성장은 접종 후 144시간째 61.
• 2×104 cell/mL로 접종한 후 12시간 간격으로 성장을 측정하였다. 최초 접종 후 24시간 경과 42.7×10⁴ cell/mL, 48시간경과 112.0×10⁴ cell/mL, 72시간 경과 178.3×10⁴ cell/mL, 96 시간 경과 204.6×10⁴ cell/mL, 120시간 경과 196.4×10⁴ cell/ mL, 144시간 경과 186.0×10⁴ cell/mL였으며 그리고 168시간경과 시 180.8×10⁴ cell/mL였다. 타가영양배양에 의한 성장은접종 후 96시간 경과 204.
• 8×10⁴ cell/mL였다. 타가영양배양에 의한 성장은접종 후 96시간 경과 204.6×10⁴ cell/mL일 때 가장 높은 성장을 보였으며, 이때 바이오매스는 12.0 g/L였으며, 이후 점차 감소하기 시작하였다(P<0.05). 이러한 경향은 초기 투여된 배지가 모두 소진되어 더 이상 성장을 할 수 없는 배양조건이 된 것으로 보여짐에 따라 타가영양배양의 경우 배양 시작 후 84시간전후로 추가 배지 공급이 이루어져야 지속적인 성장이 이루어질 것으로 사료된다.
• 2×10⁴ cell/mL로 접종한 후, 12시간 간격으로 성장 측정을 하였다. 그 결과 접종 후 24시간 경과 45.0×104 cell/mL, 48시간 경과 126.3×10⁴ cell/mL, 72시간 경과 203.2×104 cell/mL, 96시간 경과 216.0×10⁴ cell/mL, 120시간 경과 238.2×10⁴ cell/mL, 144시간 경과 242.4×10⁴ cell/ mL였으며 그리고 168시간 경과 후 248.2×10⁴ cell/mL였다. 혼합영양배양에 의한 성장은 접종 후 156시간 후에 250.
• 05). 타가영양배양과 혼합영양배양에서는 접종 후 급격히 증가하는 경향을 보이며, 타가영양배양의 경우는 접종 후 84시간째 199.8×10⁴cells/mL로 급격한 증가를 보였으며 이후 증가 속도가 낮아지며 96시간째 204.6×104cells/ mL로 가장 높게 나타났다(P<0.05). 혼합영양배양의 경우는 접종 후 84시간째 220.
• 05). 이로써 배양방법에 따른 E. gracilis의 배양 결과는 혼합영양배양법을 통한 배양이 가장 높은 성장을 나타냈으며, 다음으로 타가영양배양법 그리고 자가영양배양법 순으로 나타났다. 이로써 성장측면에서 E.
• gracilis의 배양 결과는 혼합영양배양법을 통한 배양이 가장 높은 성장을 나타냈으며, 다음으로 타가영양배양법 그리고 자가영양배양법 순으로 나타났다. 이로써 성장측면에서 E. gracilis의 생산을 위한 가장 적합한 방법은 혼합영양배양법인 것으로 나타났다.
• 배양방법에 따른 총 지질의 변화는 Table 2에 나타낸 바와 같이 자가영양배양방법 18.36%, 타가영양배양방법 21.02%, 혼합영양배양 19.16%으로 타가영양배양방법이 자가 영양배양 방법에 비하여 총 지질의 함량이 높은 것으로 나타났다(P<0.05). 배양방법에 따른 E.
• gracilis의 지질 class조성은 Table 2에 나타낸 바와 같다. 극성지질과 비극성지질의 조성을 보면 극성지질이 모든 실험구에서 68.15-91.48%로 지질 조성의 대부분을 차지하였다. 특히 자가영양배양방법을 통하여 배양하였을 때 91.
• 48%로 지질 조성의 대부분을 차지하였다. 특히 자가영양배양방법을 통하여 배양하였을 때 91.48%로 가장 높게 나타났으며, 그 다음이 혼합영양배양법을 통한 배양에서 83.72%였으며, 타가영양배양법을 통한 배양의 경우에 68.15% 로 가장 낮게 나타났다(P<0.05). 자가 영양배양 방법이 타가영양배양방법에 비하여 극성지질이 뚜렷하게 증가하는 이유는 광합성의 유무에 의한 차이로 생각된다.
• 비극성지질의 조성에서는 모든 실험구에서 triglycerols (TG) 가 가장 높게 나타났으며 그 정도는 타가영양배양밥법 24.93%, 혼합영양배양방법 12.40%, 자가영양배양방법 5.74%의 순으로 나타났다(P<0.05). 이는 극성지질과 역관계를 나타냈다.
• TG는 에너지원인 저장지질로서 타가영양방법의 배지의 주성분인 포도당이 저장지질로서의 전환 가능성을 나타낸다. Cholesteryl ester (CHOL)의 함량은 자가영양배양법을 통하여 배양하였을 때 1.91%로 가장 낮게 나타났으며(P<0.05), 혼합영양배양법을 통한 배양에서 2.79%였으며, 타가영양배양법을 통한 배양의 경우에 4.93% 로 가장 높게 나타났다(P<0.05). 배양방법에 따라서는 TG와 같은 경향을 나타냈다.
• 배양방법에 따라서는 TG와 같은 경향을 나타냈다. Free fatty acids (FFA) 함량은 자가영양배양법을 통하여 배양하였을 때 0.87% 로 가장 낮게 나타났으며(P<0.05), 혼합영양배양법을 통한 배양에서 1.09%였으며, 타가영양배양법을 통한 배양의 경우에 1.99% 로 가장 높게 나타났다(P<0.05). 유글레나의 바이오매스의 획득이 목적이 아니라, 색소와 극성지질과 같은 기능성물질을 중점적으로 얻기 위한 배양방법은 광 조건에서 배양하는자가영양배양방법이 유효한 것으로 나타났다.
• 05). 유글레나의 바이오매스의 획득이 목적이 아니라, 색소와 극성지질과 같은 기능성물질을 중점적으로 얻기 위한 배양방법은 광 조건에서 배양하는자가영양배양방법이 유효한 것으로 나타났다.
• gracilis의 지방산 조성은 Table 3에 나타낸 바와 같다. 자가영양배양, 타가영양배양 그리고 혼합영양배양 방법을 통해서 배양된 결과는 포화지방산(Saturated fatty acid) 의 경우 자가영양배양, 타가영양배양 그리고 혼합영양배양에서 각각 51.54%, 70.09% 그리고 34.78%로 타가 영양배양을 할 경우 포화지방산이 가장 높았으며, 자가영양배양 그리고 혼합영양배양 순으로 나타났다(P<0.05). 포화지방산의 종류에 있어서도 자가영양배양, 타가영양배양 그리고 혼합영양배양 방법에서 공통적으로 16:0, 18:0 가 주요 지방산을 차지하였다.
• 그러나 그 함량에는 배양 방법에 따라 조성비 차이가 큰 것으로 나타났다. 불포화지방산(unsaturated fatty acid)의 경우는 각각 48.46%, 29.91% 그리고 65.22%로 혼합영양배양을 할 경우 불포화지방산이 가장 높았으며, 자가영양배양 그리고 타가 영양배양 순으로 나타났다(P<0.05). 18:3n-3의 경우 자가영양배양 그리고 혼합영양배양에서 각각 14.
• 05). 20:5n-3(EPA)의 경우 자가영양배양, 타가 영양 배양 그리고 혼합영양배양에서 각각 4.79%, 2.22% 그리고 3.88% 로 자가영양배양에서 가장 높았으며, 혼합영양배양 그리고 타가 영양배양 순으로 나타났으며(P<0.05), 22:6n-3(DHA)의 경우는 각각 1.74%, 1.56% 그리고 2.47%로 혼합영양배양을 할 경우 가장 높았으며(P<0.05), 자가영양배양 그리고 타가 영양배양 순으로 나타났다(P<0.05). 그리고 ∑n-3 HUFA (highly unsaturated fatty acid)의 경우 자가영양배양, 타가영양배양 그리고 혼합영양배양에서 각각 10.
• 05). 그리고 ∑n-3 HUFA (highly unsaturated fatty acid)의 경우 자가영양배양, 타가영양배양 그리고 혼합영양배양에서 각각 10.01%, 5.80% 그리고 10.04%로 자가 영양배양과 혼합영양배양을 할 경우가 높았으며(P<0.05), 타가영양배양에서는 다른 두 실험구에 비해서 낮게 나타났으며(P<0.05), ∑n-6 HUFA의 경우는 각각 8.88%, 8.10% 그리고 10.13%로 혼합영양배양에서 가장 높았으며(P<0.05), 자가영양배양 그리고 타가영양배양 순으로 나타났다(P<0.05).
• 이상의 결과를 종합해 보면 유글레나의 지방산조성은 배양방법에 따라서 현저히 달라지는 특징을 나타낸다. 현재 미세조류의 분류 biomarker로서 지방산이 주요한 도구로 사용되고 있으며(Volkman et al.
• , 1988; Girotti 2001), 유글레나를 냉암소에서 starvation 시키면서 지속적으로 관찰한 결과 분류학적으로 중요한 엽록체나 파라밀론의 형태적인 변이가 일어나는 점에서(Kim and Boo, 1998; Watanabe and Suzuki, 2002) 향후 여기에 대한 세밀한 연구가 요구된다. 배양방법에 따른 지방산의 변동은 포화지방산의 경우 자가영양배양방법보다 타가 영양배양 방법에서 높은 함량을 나타내는 반면에 ∑n-3 HUFA의 경우에는 타가영양배양보다 자가영양배양과 혼합영양배양에서 높게 나타났다(P<0.05). 또한 식물류에서 특이적으로 높은 18:2n-6 은 자가영양배양과 혼합영양배양에서 높게 나타났다.
• 05). 또한 식물류에서 특이적으로 높은 18:2n-6 은 자가영양배양과 혼합영양배양에서 높게 나타났다. 이러한 원인은 광의 의한 영향이 큰 것으로 사료된다.
• 이러한 원인은 광의 의한 영향이 큰 것으로 사료된다. 유글레나는 엽록소를 가지고 있어 광합성을 하는 식물성 특성과 입이나 수축포를 가지고 자유롭게 움직이는 동물성 특성 모두를 가지고 있어 광의 유무와 유기탄소원의 공급에 따른 성장 특성이 다르게 나타났는데 자가영양배양에서는 광합성을 통한 식물성 특성의 성장을 보였지만, 타가영양배양에서는 공급된 유기탄소원을 흡수하여 성장을 하는 동물성 특성을 보였다. 혼합영양배양 방법에서는 식물성과 동물성 특성을 모두 보이며 성장한 것으로 사료된다.
• , 1998). 이번 실험을 통해서 배양방법에 따른 유글레나의 성장과 오메가-3 고도불포화지방산과 같은 기능성 물질과 지방산의 함량은 달라지는 것으로 나타났다. 유글레나의 성장 측면에서는 유기탄소원을 사용하여 배양하는 것이 안정적인 바이오매스를 확보할 수 있는 것으로 나타났으며, 어류 자치 어의 먹이생물로서 지질영양학적인 측면에서는 광을 이용한 배양방법이 우수한 것으로 나타나 양측을 고려해 보면 혼합영양배양을 하는 것이 가장 좋은 것으로 나타났다.
• 이번 실험을 통해서 배양방법에 따른 유글레나의 성장과 오메가-3 고도불포화지방산과 같은 기능성 물질과 지방산의 함량은 달라지는 것으로 나타났다. 유글레나의 성장 측면에서는 유기탄소원을 사용하여 배양하는 것이 안정적인 바이오매스를 확보할 수 있는 것으로 나타났으며, 어류 자치 어의 먹이생물로서 지질영양학적인 측면에서는 광을 이용한 배양방법이 우수한 것으로 나타나 양측을 고려해 보면 혼합영양배양을 하는 것이 가장 좋은 것으로 나타났다.

후속연구

• 이러한 경향은 El-Sheekh and Fathy (2009)의 연구결과에서 Chlorella vulgaris를 자가영양배양과 타가영양배양의 조건에서 배양하였을 때 자가영양배양방법의 chlorophyll 함량이 타가영양배양방법에 비하여 2 배 증가한다는 결과와 거의 일치하고 있다. 따라서 본 실험에서의 극성지질의 현저한 차이는 chlorophyll 색소, 인지질, 당지질의 증가에 기인할 가능성이 높으므로 향후 이에 대한 자세한 연구가 요망된다.
• 녹색 유글레나류는 엽록체와 안점(stigma)이 있고, 광합성을 하며, 무색 유글레나는 오랜 진화적 역사를 통해 엽록체를 잃은 것으로 추정된다고 하였으나(Walne 1980), 이번 실험을 통해서 종에 따른 차이보다 광 조사의 유무에 따라 극성지질이 현저히 변동하므로 극성지질의 많은 부분을 차지하고 있는 엽록체의 생성의 차이로 종 분류하는 것은 문제점이 있는 것으로 사료된다. 이처럼 배양 방법과 환경조건에 따라 지질 생합성 형태가 달라지므로(Coleman et al., 1988; Girotti 2001), 유글레나를 냉암소에서 starvation 시키면서 지속적으로 관찰한 결과 분류학적으로 중요한 엽록체나 파라밀론의 형태적인 변이가 일어나는 점에서(Kim and Boo, 1998; Watanabe and Suzuki, 2002) 향후 여기에 대한 세밀한 연구가 요구된다. 배양방법에 따른 지방산의 변동은 포화지방산의 경우 자가영양배양방법보다 타가 영양배양 방법에서 높은 함량을 나타내는 반면에 ∑n-3 HUFA의 경우에는 타가영양배양보다 자가영양배양과 혼합영양배양에서 높게 나타났다(P<0.

본문요약 정보가 도움이 되었나요? 예 아니오 제출

이 논문을 인용한 문헌

더보기