선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러므로 새로운 패류 위생관리 방안의 강구 및 기존 정화공정의 개선과 관련 규정의 마련에는 바이러스-패류 상호작용과 정화 요구시간과 같은 기초정보가 필요하다. 이 연구에서는 최근 패류위생 분야의 주요 위해 요소인 노로바이러스에 오염된 굴을 청정해역으로 이동시켜 양성하는 자연정화(translocation)를 통한굴 중 노로바이러스 저감화 가능성을 확인하고자 하였다.
- 이 연구의 주 목적은 RT-PCR 정량 기법을 기반으로 실험적으로 구성된 굴 자연정화 과정의 효율성을 평가하여 양식해역 이동(translocation)을 통한 굴 자연정화 유도가 노로바이러스 저감화 기법으로 활용 가능성이 있는지 확인하는데 있다. 이를 위하여 대조구 바이러스를 이용한 노로바이러스 회수율 검증을 실시하고 복잡한 패류 매트릭스에 의한 PCR 반응 억제여부를 확인할 수 있도록 하여 적절하고 일관성 있는 굴 중 노로바이러스 농도가 산출되도록 하였다.
제안 방법
- 106-102 copies/reaction 농도로 단계 희석한 후 realtime RT- PCR을 실시하고 Thermal cycler dice realtime software (Ta- kara, Japan)를 이용하여 표준곡선을 산출하였다. 이 표준곡선을 근거로 반복구 3개의 노로바이러스 농도(copies/g)를 각각 계산하고 이를 평균하여 시료 당 노로바이러스 농도로 하였다.
- 양성 및 운반 중 폐사한 개체를 제외한 노로바이러스 축적 굴을 24개의 새로운 패류 양성망(원추형, ø 40 cm×h 40 cm)에 30개체씩 나누어 담고 각 양성망을 4단으로 연결하였다. 4단 연결된 양성망 2세트(양성망 8개/굴 약 240개체)를 한개의 시험구로 설정하고 기존 수하식 양식시설(굴수하식 수산업협동조합 제공)에 총 3개의 시험구(T1-T3)를 20 m 간격으로 설치하여 자연정화를 유도하였다(Fig. 1). 자연정화 기간 중 2 일 간격으로 시험구 별로 굴을 20개체씩 수심을 고려하지 않고무작위 채취하여 노로바이러스 농도변화를 확인하였으며, 패류의 정화작용에 영향을 미칠 수 있는 해수의 수온 변화를 Tid-biT v2 water temp data logger (Onset Computer Co.
- Real time RT-PCR 반응을 위하여 OneStep RT-PCR kit (QIAgen, USA) 및 RNase inhibi tor (Ambion, USA) 시약을 사용하였다. 폴리오바이러스의 RNA를 internal control RNA (US FDA 제공)로 첨가하여 반응이 적절히 이루어지는지 확인하였다.
- 굴에서 노로바이러스 분리는 Jothikumar et al. (2005)의 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 탈각한 굴 20개 이상으로부터 분리된 소화맹랑(digestive gland)을 조직파쇄기로 균질화한 후 3 g을 취하여 동량의 300 μg/mL Proteinase K solution (Pro mega, USA)을 첨가하고 완전히 혼합 하였다.
- 이를 위하여 대조구 바이러스를 이용한 노로바이러스 회수율 검증을 실시하고 복잡한 패류 매트릭스에 의한 PCR 반응 억제여부를 확인할 수 있도록 하여 적절하고 일관성 있는 굴 중 노로바이러스 농도가 산출되도록 하였다. 그리고 굴 중 노로바이러스 배출과 수심과의 상관성은 적지 선정과 시설물 설계를 위한 예비 시험에서 수심 2 m, 7 m 및 12 m로 구분하여 조사하였는데, 노로바이러스 배출과 수심과의 유의할 만한 상관성은 발견되지 않았다(data not shown).
- 운반된 패류를 현장에서 30개의 패류 양성망(원추형, ø 40 cm×h 40 cm)에 약 30개체식 나누어 담고 수심 약 2-4 m 중에 계류시켜 1개월 간 양성하면서 노로바이러스 축적을 유도하였다. 노로바이러스 축적 여부 및 그 농도 확인을 위하여 매주 20개체씩 무작위로 채취하여 분석을 실시하였다.
- 이 후 95℃에서 10초, 53℃에서 25초, 62℃에서 70 초로 45 cycles를 반복하였다. 양성 대조군으로 노로바이러스 RNA (Takara, Japan)를 사용하고, 음성 대조군으로 멸균증류수를 사용 하였다. Real time RT-PCR 반응은 시료마다 3회 반복하였다.
- 자연정화 하수처리장 최종 방류지점에서 양성되어 노로바이러스가 축적된 굴을 재 수확하여 청정해역인 한국패류위생계획 수출용패류생산지정해역 2호(경남 통영시 자란만·사량도 해역)로 당일 운반하였다. 양성 및 운반 중 폐사한 개체를 제외한 노로바이러스 축적 굴을 24개의 새로운 패류 양성망(원추형, ø 40 cm×h 40 cm)에 30개체씩 나누어 담고 각 양성망을 4단으로 연결하였다. 4단 연결된 양성망 2세트(양성망 8개/굴 약 240개체)를 한개의 시험구로 설정하고 기존 수하식 양식시설(굴수하식 수산업협동조합 제공)에 총 3개의 시험구(T1-T3)를 20 m 간격으로 설치하여 자연정화를 유도하였다(Fig.
- 선별된 패류를 채취 당일에 노로바이러스 생물축적을 위하여 부산시 환경공단 남부사업소 처리하수 최종 방류지점(부산시 남구 대연동 소재)으로 운반하였다. 운반된 패류를 현장에서 30개의 패류 양성망(원추형, ø 40 cm×h 40 cm)에 약 30개체식 나누어 담고 수심 약 2-4 m 중에 계류시켜 1개월 간 양성하면서 노로바이러스 축적을 유도하였다. 노로바이러스 축적 여부 및 그 농도 확인을 위하여 매주 20개체씩 무작위로 채취하여 분석을 실시하였다.
- Japan)를 이용하여 표준곡선을 산출하였다. 이 표준곡선을 근거로 반복구 3개의 노로바이러스 농도(copies/g)를 각각 계산하고 이를 평균하여 시료 당 노로바이러스 농도로 하였다. 자연정화 하수처리장 최종 방류지점에서 양성되어 노로바이러스가 축적된 굴을 재 수확하여 청정해역인 한국패류위생계획 수출용패류생산지정해역 2호(경남 통영시 자란만·사량도 해역)로 당일 운반하였다.
- 기법으로 활용 가능성이 있는지 확인하는데 있다. 이를 위하여 대조구 바이러스를 이용한 노로바이러스 회수율 검증을 실시하고 복잡한 패류 매트릭스에 의한 PCR 반응 억제여부를 확인할 수 있도록 하여 적절하고 일관성 있는 굴 중 노로바이러스 농도가 산출되도록 하였다. 그리고 굴 중 노로바이러스 배출과 수심과의 상관성은 적지 선정과 시설물 설계를 위한 예비 시험에서 수심 2 m, 7 m 및 12 m로 구분하여 조사하였는데, 노로바이러스 배출과 수심과의 유의할 만한 상관성은 발견되지 않았다(data not shown).
- 1). 자연정화 기간 중 2 일 간격으로 시험구 별로 굴을 20개체씩 수심을 고려하지 않고무작위 채취하여 노로바이러스 농도변화를 확인하였으며, 패류의 정화작용에 영향을 미칠 수 있는 해수의 수온 변화를 Tid-biT v2 water temp data logger (Onset Computer Co., U.S.A)를 이용하여 1시간 간격으로 모니터링 하였다.
- 폴리오바이러스의 RNA를 internal control RNA (US FDA 제공)로 첨가하여 반응이 적절히 이루어지는지 확인하였다.
- 표준곡선 산출을 위한 realtime RT-PCR에는 pET30a vector 에 해당 유전자의 sequence (GI형 96 bp, GII형 98 bp)를 삽입하여 제작된 plasmid DNA (Takara, Korea)를 이용하였다. Shin et al.
대상 데이터
- RNA 추출에는 Viral RNA mini kit (QIAgen, USA)을 사용하였다. 상징액 300 μL에 AVL buffer 1, 120 μL를 첨가하여 혼합 한 후 실온에서 10분간 반응시켰다.
- 채취해역 해수로 패각 외부를 세척하고 폐사하였거나 파손된 굴을 제외하였다. 선별된 패류를 채취 당일에 노로바이러스 생물축적을 위하여 부산시 환경공단 남부사업소 처리하수 최종 방류지점(부산시 남구 대연동 소재)으로 운반하였다. 운반된 패류를 현장에서 30개의 패류 양성망(원추형, ø 40 cm×h 40 cm)에 약 30개체식 나누어 담고 수심 약 2-4 m 중에 계류시켜 1개월 간 양성하면서 노로바이러스 축적을 유도하였다.
- 자연정화 대상 패류는 생식을 위주로 소비되는 양식 굴 (Crassostrea gigas)을 선정하였으며, 남해안(경남 통영시 자란만·사량도 일원)에서 2014년 4월에 채취하였다. 채취해역 해수로 패각 외부를 세척하고 폐사하였거나 파손된 굴을 제외하였다.
- 이 표준곡선을 근거로 반복구 3개의 노로바이러스 농도(copies/g)를 각각 계산하고 이를 평균하여 시료 당 노로바이러스 농도로 하였다. 자연정화 하수처리장 최종 방류지점에서 양성되어 노로바이러스가 축적된 굴을 재 수확하여 청정해역인 한국패류위생계획 수출용패류생산지정해역 2호(경남 통영시 자란만·사량도 해역)로 당일 운반하였다. 양성 및 운반 중 폐사한 개체를 제외한 노로바이러스 축적 굴을 24개의 새로운 패류 양성망(원추형, ø 40 cm×h 40 cm)에 30개체씩 나누어 담고 각 양성망을 4단으로 연결하였다.
데이터처리
- 굴 중 노로바이러스 농도 감소에 대한 자연정화 효율을 평가하기 위한 통계 처리는 SAS프로그램을 이용한 분산분석표를 작성하였으며, Duncan의 다중범위검정(Duncan's multi- plerange test)으로 P<0.05에서 결과 간의 유의성을 검정하였다 (Steel and Torries, 1980). 또한 노로바이러스 감소경향은 회귀방정식으로 구현하였다.
- 05에서 결과 간의 유의성을 검정하였다 (Steel and Torries, 1980). 또한 노로바이러스 감소경향은 회귀방정식으로 구현하였다.
성능/효과
- RT-PCR의 신뢰성이 확인을 위해 첨가한 internal control RNA의 사용농도와 RT-PCR에서 얻어진 cycle threshold (CT)값을 표준곡선에 대입하여 산출된 바이러스 농도를 비교한 결과, 117건의 모든 RT-PCR 반응(39개 시료×3회 반복)에서 얻어진 바이러스 회수율이 모두 90% 이상으로 나타나 바이러스추출과 RT-PCR 반응이 적절히 수행되었음을 알 수 있었다. 양식 굴을 채취하여 오염된 해역에 양성한지 3주 후 굴 중 노로바이러스 농도는 평균 3.
- 그리고 유전형은 모두 GII 로 밝혀졌다. 노로바이러스가 축적된 동 양식굴을 청정해역으로 이동시켜 노로바이러스 배출을 유도한 2차일에 3개의 시험구 중 2개의 시험구(T1 및 T3)에서 노로바이러스 농도가 0.11 및 0.14 log units 정도로 소폭 증가하였다가 이후 감소하는 경향을 보였고, 시험구 T2는 2일차에 거의 노로바이러스 농도가거의 일정하였으며(0.06 log units 감소), 이후 빠른 감소 경향을 나타내었다(Table 2, Fig. 2). 이후 자연정화 12일차에 모든시험구에서 노로바이러스 농도가 검출 한계(10 copies/g) 이하로 낮아져 축적된 노로바이러스가 거의 모두 배출된 것으로 판단되었다.
- 있었다. 양식 굴을 채취하여 오염된 해역에 양성한지 3주 후 굴 중 노로바이러스 농도는 평균 3.2×103 copies/g이었으며 그 범위는 2.0×103-4.3×103 copies/g이었다. 그리고 유전형은 모두 GII 로 밝혀졌다.
- 2). 이후 자연정화 12일차에 모든시험구에서 노로바이러스 농도가 검출 한계(10 copies/g) 이하로 낮아져 축적된 노로바이러스가 거의 모두 배출된 것으로 판단되었다. 자연정화 기간 중 2일 간격으로 분석된 시험구 별 노로바이러스 농도 감소는 T1에서 0.
- 자연정화 2일차에 3개의 시험구 중 2개의 시험구에서 노로바이러스 농도가 소폭 증가하였으며 이후 안정된 감소 경향을 보였고, 나머지 1개 시험구에서는 2일차까지 거의 노로바이러스농도가 거의 일정하게 유지되다가 4일차 이후 빨리 감소하였다. 그리고 12일차에 모든 시험구에서 노로바이러스 농도가 검출 한계 이하로 낮아졌다.
- 이후 자연정화 12일차에 모든시험구에서 노로바이러스 농도가 검출 한계(10 copies/g) 이하로 낮아져 축적된 노로바이러스가 거의 모두 배출된 것으로 판단되었다. 자연정화 기간 중 2일 간격으로 분석된 시험구 별 노로바이러스 농도 감소는 T1에서 0.13-1.56 log units, T2에서 0.13-1.05 log units 그리고 T3에서 0.12-2.64 log units의 범위로 나타났으며, 감소 추세선의 R2값은 0.74-0.93이었다(Table 2, Fig. 2). 노로바이러스 농도 감소가 가장 급격히 일어난 구간은 T1 및 T2 시험구에서 정화 8-10일차(각각 1.
후속연구
- 이상의 연구결과를 종합하면 노로바이러스에 오염된 해역에서 양식되어 생식에 부적합 굴이라도 청정해역에 옮겨 12일 이상 양성되는 경우 생식에 따른 노로바이러스 감염증 발생 가능성을 상당히 낮출 수 있을 것이라고 판단되며 동 결과는 굴에서 노로바이러스 저감화 대책 마련과 정화효율 개선 연구에 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 수온이 패류 중 바이러스의 배출에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있어 향후수온 등 환경인자와 굴 성장 주기 등 생리적 요소를 포함한 다양한 잠재 영향 인자를 종합적으로 해석한 추가 연구가 필요할것이며, 나아가 패류수확, 해역이동과 분망 작업 등에 소요되는 제반 비용에 대한 경제성 평가도 있어야 할 것으로 사료된다.
- (2010)은 굴의 생육한계를 벗어나지 않는 범위 내에서 수온이 높을수록 굴의 여과섭식 활동과 장내 분해세균의 활성이 증가하여 노로바이러스 배출이 촉진된 것으로 추측하였다. 이상의 연구결과를 종합하면 노로바이러스에 오염된 해역에서 양식되어 생식에 부적합 굴이라도 청정해역에 옮겨 12일 이상 양성되는 경우 생식에 따른 노로바이러스 감염증 발생 가능성을 상당히 낮출 수 있을 것이라고 판단되며 동 결과는 굴에서 노로바이러스 저감화 대책 마련과 정화효율 개선 연구에 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 수온이 패류 중 바이러스의 배출에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있어 향후수온 등 환경인자와 굴 성장 주기 등 생리적 요소를 포함한 다양한 잠재 영향 인자를 종합적으로 해석한 추가 연구가 필요할것이며, 나아가 패류수확, 해역이동과 분망 작업 등에 소요되는 제반 비용에 대한 경제성 평가도 있어야 할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.