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문제 정의
- 다음으로, 滋陰降火湯이 기도 점액의 과다 분비를 억제한다면, 점액의 주된 생화학적 구성요소인 뮤신의 생성 및 그 유전자 발현 등 세포 및 분자 수준에서는 어떠한 작용을 발현하는지를 알아보고자 다음과 같은 후속 실험을 진행하였다. 인체 기도 뮤신의 거동과 관련된 연구모델로 자주 사용되는 인간 기도 상피세포인 NCI-H292 세포를 이용하여39) 아데노신 삼인산 (ATP), 상피세포 성장인자 (EGF), phorbol ester (PMA), 종양괴 사인자 (TNF)로 각각 기도 뮤신의 생성 (production)을 자극한 상태에서 24시간의 JGT 처리 기간 동안 기도 뮤신인 MUC5AC 뮤신의 생성 정도를 측정하고, 동일한 조건으로 뮤신 유전자 발현을 자극한 상태에서 24 시간의 JGT 처리 기간 동안 MUC5AC mRNA의 발현 정도를 관찰하였다.
- 또한, 기도 점액의 과다 분비를 조절하는 효능을 발현하는 JGT가 실험동물에 대한 독성을 유발하지 않아야 하는데, 이는 유효하면서도 안전성이 담보되어야 하는 약물로서의 기본적인 요건이라고 할 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에서 JGT의 경구 투여에 대한 생체 안전성을 검증하기 위하여 흰쥐의 체중 증가도에 미치는 영향과 함께 간기능과 신기능에 미치는 영향을 각각 측정하였다. 체중 증가도에 미치는 영향을 알아보기 위해 2주간의 JGT 경구투여 기간을 포함한 전체 3주간의 실험기간 동안 각 흰쥐의 체중 변화를 측정하였는데, 대조군은 140 ± 10 g (100 ± 7% control)로, JGT를 투여한 군은 136 ± 4 g (97 ± 3% control)로 측정되어 체중 변화에는 유의한 차이를 보이지 않았다 (Fig.
- 투여된 JGT의 생체 안전성을 검증하기 위한 하나의 지표로서 JGT 투여기간을 포함하여 전. 실험기간 중 각 흰쥐모델의 체중 증가 정도, 즉 실험 시작 시점의 각 흰쥐 모델의 체중과 실험 종료 시점의 체중의 차이를 측정하여 대조군과 JGT를 투여한 군 간에 비교함으로써, JGT 투여가 각 흰쥐모델의 영양 및 대사 상태에 미치는 영향을 검증하고자 하였다.
- 이에 저자는 기도 점액의 과다 분비 및 이와 연관된 기도 뮤신의 생성 및 유전자 발현에 어떠한 작용을 발현할 수 있는지를 알아보기 위하여, 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에서 상피 배상 세포 (goblet cell) 내의 점액 함유량에 대한 滋陰降火湯의 영향을 관찰하였으며, 세포 수준에서의 滋陰降火湯의 약리작용 및 그 기전을 탐색하기 위하여 인간의 기도 상피 세포인 NCI-H292 세포에서 기도 뮤신인 MUC5AC 뮤신의 생성에 대한 약물의 영향과 기도 뮤신 유전자인 MUC5AC mRNA의 발현을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는, 陰虛火旺으로 인한 여러 咳嗽, 痰盛 등의 치료 목적으로 사용되고 있는 滋陰降火湯이 기도 점액의 과다 분비 및 그 기저 생리현상으로서의 기도 뮤신 생성 및 유전자 발현에는 어떤 약리작용을 발현하는지 관찰함으로써, 여러 급성·만성 호흡기 염증성 질환에서 관찰되는 기도 점액과다 분비 현상의 조절약물로서의 응용 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- SO2 노출방법은 Pon 등19)이 보고한 방법을 개량·변형하여 사용하였다. 15% (V/V) Sodium metabisulfite (MBS) 수용액을 초음파 가습기에 주입하고 가습기를 작동시켰고, 작동 후 3분 이내에 MBS의 증기가 충만했으며 작동 종료 시까지 실험장치 내부의 SO2 농도는 130~150ppm으로 유지시켰다. 흰쥐를 대조군 (무처치군), SO2 3주 처리군, SO2 1주 처리 후 최종 2주간 SO2 처리 및 JGT 동시 투여군으로 무작위 배정하였는데, 각 군당 흰쥐 수는 5마리 이상으로 하였다.
- 1시간 후 PBS-T 200 μℓ로 3회 세척하고 MUC5AC에 대한 monoclonal antibody인 mouse anti-MUC5AC clone 45M1을 2% BSA에 1 : 200의 비율로 희석한 후에 각 well당 100 μℓ씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다.
- 1시간 후 PBS-T로 3회 세척하고, 2차 항체인 Horse radish peroxidase (HRP)-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate를 2% BSA에 1: 3,000의 비율로 희석한 후 각 well당 100 μℓ씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다.
- 24시간의 JGT 처리 기간 동안, JGT이 인간 기도 상피세포인 NCI-H292 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신의 생성 및 유전자 (mRNA)의 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 NCI-H29 세포를 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO2를 함유하는 37 ℃의 조건 하에서 HEPES (25 mM), penicillin-G (100 U/mℓ), streptomycin (100 μg/mℓ), FBS (10%, V/V) 등이 첨가된 RPMI 1640 배양액 (이하 배양액)에서 배양하였으며, 1주에 2회의 빈도로 subculture하였다.
- 3주간의 SO2 노출기간이 종료된 후 각 군에 소속된해당 흰쥐 모델을 이산화탄소로 질식사시킨 후, 기관을 절개 ·분리하여 냉각된 10% formalin in PBS (pH 7.2)에 넣어 24시간동안 고정하였다.
- PBS-T로 다시 3회 세척 후, 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine peroxide (TMB) 용액100 μℓ를 각 well에 첨가하고, 5분 후1N H2SO4 50μℓ를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm에서 각 well의 흡광도를 측정함으로써 대조군과 JGT 처리군 간의 MUC5 AC 함량을 측정하여 비교하였다23-4).
- 먼저, 혈청 중의 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase)는 L-asparatate와 α-ketoglutarate를 oxaloacetate 와 L-glutamate로 전환시키며 이때 생성된 oxaloacetate는 Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH)의 존재 하에 Malate Dehydrogenase (MDH)의 작용으로 L-malate로 전환된다. GOT의 활성값은 340 nm에서 NADH의 감소 속도를 측정함으로써 계산하였다. 혈청 중 GPT (Glutamate Pyruvate Transaminase)는 L-alanine 과 α-ketoglutarate를 pyruvate와 L-glutamate로 변환시키며, 이때 생성된 pyruvate는 NADH의 존재 하에 Lactate Dehydrogenase (LDH)의 작용으로 lactate로 전환된다.
- 혈청 중 GPT (Glutamate Pyruvate Transaminase)는 L-alanine 과 α-ketoglutarate를 pyruvate와 L-glutamate로 변환시키며, 이때 생성된 pyruvate는 NADH의 존재 하에 Lactate Dehydrogenase (LDH)의 작용으로 lactate로 전환된다. GPT의 활성값은 340 nm에서 NADH의 감소 속도를 측정하여 계산하였다.
- 0% agarose gel에서 전기 영동하였다. Gel 상에서 이동된 각각의 DNA band는 자외선 투사기 (ultraviolet transilluminator)를 이용하여 관찰하고, 사진 촬영하였다.
- JGT가 흰쥐 기도 배상 세포내 점액 함유량에 미치는 영향을 측정하기 위하여 기관내강 상피 세포층에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 3주간의 SO2 노출기간이 종료된 후 각 군에 소속된해당 흰쥐 모델을 이산화탄소로 질식사시킨 후, 기관을 절개 ·분리하여 냉각된 10% formalin in PBS (pH 7.
- MUC5AC 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응 에서 얻은 cDNA 산물 2 μℓ를 PCR premix kit의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다.
- RNA의 RT-PCR 및 PCR로 증폭된 cDNA 산물들을 전기영동으로 분리함으로써 MUC5AC 유전자 발현의 변동 여부를 관찰하였다. 즉, 증폭된 PCR 산물 10 μℓ를 10 × gel loading buffer (0.
- 체중 350 g의 흰쥐에게 투여할 용량을, 체중 70 kg 성인이 복용하는 JGT의 용량을 기준으로 환산하여, 투여용량은 JGT 추출물 2mℓ로 하였다. SO2 1주 처리 후 최종 2주간 SO2 처리 및 JGT동시 투여군에 배당된 흰쥐 모델을 대상으로, 경구투여용 주사바늘을 이용하여 JGT 추출물 2mℓ를 투여하였다. 즉, 총 3주간의 SO2 노출 기간 중 마지막 2주간 (총 10일), 매일 반복적으로 JGT를 투여하였는데, JGT의 투여는 오전 10시에서 11시 사이에, SO2노출은 오후 1시에서 4시까지 각각 실시하였다.
- SO2 노출방법은 Pon 등19)이 보고한 방법을 개량·변형하여 사용하였다.
- 5 mℓ 용량의 microtube에 옮겨 원심 분리함으로써 세포들만 수거하였다. total RNA를 분리하기 위해서 INTRON biotechnology사의 Easy-Blue RNA extraction kit (total RNA isolation reagent) (0.5 mℓ/4 x 105 cells)를 이용해 세포를 lysis시키고, 상온에서 5분간 방치하였다. 5분 후 즉시 microtube에 chloroform을 첨가하여 15초간 vortexing하고 상온에 2~3분간 방치한 후 4 ℃, 13,000 rpm (Hanil centrifuge, MICRO 17 R)에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상층액 400 μℓ를 새 microtube에 옮겼다.
- 滋陰降火湯이 기도 점액의 과다 분비 및 이와 연관 된 기도 뮤신의 생성 및 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, SO2 흡입투여로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에서 상피 배상 세포 내의 점액 함유량에 대한 滋陰降火湯의 영향을 관찰하고, 인간의 기도 상피세포인 NCI-H292 세포에서 기도 뮤신인 MUC5AC 뮤신의 생성에 대한 약물의 영향과 기도 뮤신 유전자인 MUC5AC mRNA의 발현을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 2). 간독성의 지표로는 transaminase인 GOT (AST), GPT (ALT)의 혈청 중 활성을, 신장독성의 지표로는 Blood Urea Nitrogen (BUN)의 혈청 중 농도를 각각 선정하여 2주간의 JGT 경구투여 후 GOT, GPT의 혈청 중 활성과BUN의 혈청 중 농도를 측정하였다. 그 결과, 대조군에서 GOT, GPT 흡광도는 0.
- 고정한 조직은 파라핀으로 포매(embedding)한 후, Microtome을 이용하여 5 μm 두께로 잘라 조직절편을 제작하였다.
- 5) 염색을 실시한 후, 광학 현미경으로 관찰하고 200배 배율에서 사진 촬영하였다. 대조군, SO2 처리군, JGT처리군의 기도 배상 세포 내 점액 함유량을 비교함으로써 JGT이 배상 세포 내 점액 함유 상태에 미치는 영향을 측정하였다21-2).
- 노출기간은 1일 3시간, 1주일에 5일, 3 주간이었다. 대조군은 실험장치가 설치된 동일한 실내에서, 전 실험기간 동안 1일 3시간의 SO2 노출 및 JGT 처리 과정만 제외하고 노출군과 동일한 조건으로 사육하였다20).
- 먼저, 실험동물을 대상으로 한 in vivo 실험을 통해서 滋陰降火湯 (JGT)의 약리작용을 조사할 목적으로, SO2 흡입으로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델을 이용하여 연구를 수행하였는데, 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에 JGT를 2주간 경구 투여한 후 상피 배상 세포 (goblet cell) 내의 점액 함유량에 대한 약물의 영향을 조직병리학적인 방법으로 확인하였다. 그 결과, 대조군이나 SO2 3주 흡입군과 비교를 했을 때, SO2 1주 흡입 후 2주간 SO2 흡입 및 JGT 동시 투여군에서는, SO2 흡입으로 인해 증가되었던 기도 배상 세포내의 점액 함유량이 감소되는 경향을 확인할 수 있었다 (Fig.
- 뮤신 생성량 검증을 위해서, 24 well culture plate를 기준으로 각 well당 2.0 × 104 cells/well의 밀도로, 뮤신 유전자 발현 정도의 검증을 위해서 6 well culture plate를 기준으로 well 당 5.0 × 104 cells/well의 밀도로 각각 세포를 도포하고 배양하였다.
- 세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO2를 함유하는 37 ℃의 조건 하에서 HEPES (25 mM), penicillin-G (100 U/mℓ), streptomycin (100 μg/mℓ), FBS (10%, V/V) 등이 첨가된 RPMI 1640 배양액 (이하 배양액)에서 배양하였으며, 1주에 2회의 빈도로 subculture하였다.
- 수거된 RNA 침전물을 5분 동안 대기 중에서 건조시킨 후, 20 μℓ의 RNase-free water로 부유시키고, UV-spectrophotometer를 사용하여 260 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 RNA의 농도를 측정한 후 실험에 사용하였다 (1.0A260=single strand RNA 40 μg/mℓ)25).
- 수거된 total RNA를 이용하여 역전사 반응 (Reverse Transcription: RT)으로 cDNA를 만들고, 이를 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭시켰다. 즉, 얻어진 total RNA 1 μg을 75 ℃에서 5분간 가열함으로써 denaturation시키고, 이를 얼음에 담아 급냉시킨 후 RT premix kit의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다.
- 아크릴수지 판을 이용하여 직육면체 상자 (200 cm × 60 cm × 30 cm, 두께 2 cm)를 제작하여 상자의 가로면에 실험동물이 출입할 수 있도록 출입문을 만들고, 좌우 양 세로면의 중심부에 구멍을 만든 후 폴리에틸렌 소재의 duct를 부착시켰다.
- 이렇게 준비된 세포에 JGT 추출물을 각각 2~10 μℓ씩을 함유하는 배양액 200 μℓ를 24 well plate에 각 well마다 가하고, 30분이 지난 후에 ATP 200 μM, PMA 10 ng/mℓ, EGF 25 ng/mℓ, 그리고 TNF-α 0.2 nM을 각 well마다 투여한 후 37 ℃에서 24시간동안 배양하였다.
- 다음으로, 滋陰降火湯이 기도 점액의 과다 분비를 억제한다면, 점액의 주된 생화학적 구성요소인 뮤신의 생성 및 그 유전자 발현 등 세포 및 분자 수준에서는 어떠한 작용을 발현하는지를 알아보고자 다음과 같은 후속 실험을 진행하였다. 인체 기도 뮤신의 거동과 관련된 연구모델로 자주 사용되는 인간 기도 상피세포인 NCI-H292 세포를 이용하여39) 아데노신 삼인산 (ATP), 상피세포 성장인자 (EGF), phorbol ester (PMA), 종양괴 사인자 (TNF)로 각각 기도 뮤신의 생성 (production)을 자극한 상태에서 24시간의 JGT 처리 기간 동안 기도 뮤신인 MUC5AC 뮤신의 생성 정도를 측정하고, 동일한 조건으로 뮤신 유전자 발현을 자극한 상태에서 24 시간의 JGT 처리 기간 동안 MUC5AC mRNA의 발현 정도를 관찰하였다. PMA는 calcium-dependent protein kinase (PKC, 칼슘의존성 단백질 인산화 효소)를 활성화하는 물질로, mouse 피부에서의 강력한 발암유발 작 용, 강력한 산화질소 생성 촉진 활성, 유도형 산화질소 생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현 증강 작용40-1)을 나타내는 것으로 널리 알려져 있으며, 인간 기도 상피세포에서 뮤신 생성을 증가23,42)시키는 것으로도 보고된 물질이다.
- 즉, 얻어진 total RNA 1 μg을 75 ℃에서 5분간 가열함으로써 denaturation시키고, 이를 얼음에 담아 급냉시킨 후 RT premix kit의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다.
- SO2 1주 처리 후 최종 2주간 SO2 처리 및 JGT동시 투여군에 배당된 흰쥐 모델을 대상으로, 경구투여용 주사바늘을 이용하여 JGT 추출물 2mℓ를 투여하였다. 즉, 총 3주간의 SO2 노출 기간 중 마지막 2주간 (총 10일), 매일 반복적으로 JGT를 투여하였는데, JGT의 투여는 오전 10시에서 11시 사이에, SO2노출은 오후 1시에서 4시까지 각각 실시하였다.
- MUC5AC 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응 에서 얻은 cDNA 산물 2 μℓ를 PCR premix kit의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다. 증폭 반응을 위하여, PCR을 40회 실시 (PCR thermal cycler, Takara MP-300, Japan)하였으며, denaturation은 94 ℃에서 30초, annealing은 60 ℃에서 30초, extension은 72 ℃에서 30초간 각각 시행하였다.
- 체중 350 g의 흰쥐에게 투여할 용량을, 체중 70 kg 성인이 복용하는 JGT의 용량을 기준으로 환산하여, 투여용량은 JGT 추출물 2mℓ로 하였다. SO2 1주 처리 후 최종 2주간 SO2 처리 및 JGT동시 투여군에 배당된 흰쥐 모델을 대상으로, 경구투여용 주사바늘을 이용하여 JGT 추출물 2mℓ를 투여하였다.
- 고정한 조직은 파라핀으로 포매(embedding)한 후, Microtome을 이용하여 5 μm 두께로 잘라 조직절편을 제작하였다. 탈파라핀 과정을 거치고 Hematoxylin-eosin 염색과 Periodic Acid Schiff (PAS)-Alcian Blue (pH 2.5) 염색을 실시한 후, 광학 현미경으로 관찰하고 200배 배율에서 사진 촬영하였다. 대조군, SO2 처리군, JGT처리군의 기도 배상 세포 내 점액 함유량을 비교함으로써 JGT이 배상 세포 내 점액 함유 상태에 미치는 영향을 측정하였다21-2).
- 투여된 JGT에 의한 간독성 발생 여부를 검증하기 위하여, 간세포 파괴시 혈청으로 유출되는 효소인 GOT (AST), GPT (ALT)의 혈청 중 활성을 생화학 자동 분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 먼저, 혈청 중의 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase)는 L-asparatate와 α-ketoglutarate를 oxaloacetate 와 L-glutamate로 전환시키며 이때 생성된 oxaloacetate는 Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH)의 존재 하에 Malate Dehydrogenase (MDH)의 작용으로 L-malate로 전환된다.
- 투여된 JGT에 의한 신장독성 발생 여부를 검증하기 위하여, JGT 투여 후 혈청 중의 Blood Urea Nitrogen (BUN) 값을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH 와 반응하여 glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 BUN의 농도를 계측하였다.
- 투여된 JGT에 의한 신장독성 발생 여부를 검증하기 위하여, JGT 투여 후 혈청 중의 Blood Urea Nitrogen (BUN) 값을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH 와 반응하여 glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 BUN의 농도를 계측하였다.
- 15% (V/V) Sodium metabisulfite (MBS) 수용액을 초음파 가습기에 주입하고 가습기를 작동시켰고, 작동 후 3분 이내에 MBS의 증기가 충만했으며 작동 종료 시까지 실험장치 내부의 SO2 농도는 130~150ppm으로 유지시켰다. 흰쥐를 대조군 (무처치군), SO2 3주 처리군, SO2 1주 처리 후 최종 2주간 SO2 처리 및 JGT 동시 투여군으로 무작위 배정하였는데, 각 군당 흰쥐 수는 5마리 이상으로 하였다. 노출기간은 1일 3시간, 1주일에 5일, 3 주간이었다.
대상 데이터
- 1) 동물 - 5주령의 체중 200 g 내외인 Sprague-Dawley (SD)계 雄性 흰쥐 (대한바이오링크(주), Kyung-gi, Korea)를 구입하고, 2~3일간 실험실 환경에서 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 본 동물실험은 부산대학교 동물실험윤리위원회 (PNU-IACUC)에 의해 동물실험의 윤리성과 과학성에 대한 검토를 받아 적합한 것으로 승인 (승인번호: PNU-2016-1162)을 획득하여 수행되었다.
- 2) 배양세포 - NCI-H292 세포는 American Type Culture Collection사 (Manassas, VA, U.S.A.)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 24시간의 배양이 종료된 후, 세포 용해용 완충액 (20mM Tris, 0.5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, protease inhibitor cocktail)을 가하여 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신을 추출한 후 실험에 사용하였다. 수거된 세포 용해 추출액 (cell lysate)은 PBS로 1/10배 희석하고 희석된 각 sample을 ELISA 전용의 96-well plate에 각각 100 μℓ씩 분포시킨 후 42 ℃에서 완전히 건조될 때까지 incubation하였다.
- 3) 약재 - 滋陰降火湯 (이하 JGT)의 구성 약물은 ≪方藥合編≫18)에 준하여, 동국대학교 부속 한방병원 약제실에서 공급받아, 정선하여 사용하였다. ;한 첩당 처방의 내용과 용량은 다음과 같다 (Table 1).
- 5) 시약 - Easy-Blue RNA extraction kit는 INTRON biotechnology사 (Kyung-gi, Korea)에서, Accuprep RT premix kit와 Accuprep PCR premix kit는 Bioneer사 (Daejeon, Korea)에서, Protease inhibitor cocktail은 Roche사 (Indianapolis, IN, U.S.A.)에서, Mouse anti-MUC5AC clone 45M1 및 HRP-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate은 NeoMarkers사 (Freemont, CA, U.S.A.)에서, ethidium bromide, trypsin-EDTA, epidermal growth factor (EGF), formaldehyde, alcian blue, periodic acid-schiff (PAS), tumor necrosis factor-α (TNF-α), Tween 20, bovine serum albumin (BSA), HEPES, dimethyl sulfoxide (DMSO), diethylpyrocarbonate (DEPC), 3,3',5,5'- tetra- methyl- benzidine peroxide solution (TMB), Trizma base, NP-40, EDTA, EGTA, Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) 등은 Sigma사 (St. Louis, Mo., U.S.A.)에서, penicillin-G, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), RPMI 1640은 GIBCO-BRL사 (Grand Island, New York, U.S.A.)에서 구입하였으며, 기타 제반 시약들은 일급시약 등급 이상의 제품을 구입하여 사용하였고, 물은 탈이온 2차 증류수를 사용하였다.
- 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)에 사용된 primer는 전문 제조회사인 Genotec(주) (Daejeon, Korea)에 주문하여 합성하였다. NCI-H292 세포에서의 human MUC5AC 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5'-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3', antisense primer의 염기서열은 5'-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3'이며, 이 primer에 의해 합성된 PCR 산물의 크기는 약 461 bp 였다.
데이터처리
- 모든 측정 결과는 Mean ± S.E.M.으로 환산한 후, JGT 처리군의 측정치는 대조군 측정치의 백분율로 나타냈다.
- 통계 처리는 unpaired Student's t-test로 하였으며, p<0.05인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. 滋陰降火湯은, SO2으로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에게 경구 투여한 결과, 기도 배상 세포 내의 점액 함유량을 감소시켰다.
- 2. 滋陰降火湯은 흰쥐 모델에게 경구 투여했을 때 체중 증가도와 간 및 신장 기능에 영향을 주지 않음으로써 생체 독성을 발현하지 않았다.
- 2주간의 JGT 경구 투여 기간을 포함한 전체 3주간의 실험 기간 동안 각 흰쥐의 체중 변화를 측정한 결과, 대조군은 140 ± 10 g (100 ± 7% control)로, JGT를 투여한 군은 136 ± 4 g (97 ± 3% control)로 측정되어 유의한 차이를 보이지 않았다 (Fig. 2).
- 2주간의 JGT 경구투여 후 GOT, GPT의 혈청 중 활성을 측정한 결과, 대조군에서 GOT, GPT 흡광도는 각각 0.460 ± 0.044 (100 ± 10% control), 0.320 ± 0.01 (100 ± 3% control)로, JGT를 투여한 군의 GOT, GPT 흡광도는 각각 0.373 ± 0.033 (81 ± 7% control), 0.350 ± 0.015 (109 ± 5% control)로 측정되어 유의한 차이는 없었다 (Fig. 3).
- 3) 유의한 차이가 없었고, 대조군의 BUN은 8.300 ± 0.500 mg/dℓ (100 ± 6% control)로, JGT를 투여한 군의 BUN은 7.573 ± 1.512 mg/dℓ (91 ± 16% control)로 측정 되어 (Fig.
- 3. 滋陰降火湯은, 배양된 NCI-H292 세포를 대상으로 호흡기 염증성 질환이환 상태를 반영한 점액 과다 생성 조건에서 뮤신 생성에 유의한 억제 효과를 발현하였다.
- 4. 滋陰降火湯은, 배양된 NCI-H292 세포를 대상으로 호흡기 염증성 질환이환 상태를 반영한 점액 과다 생성 조건 중에서, EGF나 PMA로 자극된 경우에는 유전자 발현을 감소시켰으나, ATP 또는 TNF-α로 자극된 경우에는 유전자 발현을 뚜렷하게 감소시키지 못했다.
- JGT는 최종 추출물 2, 5, 10 μℓ/200 μℓ배양액의 투여 농도에서 24시간의 처리 기간 동안 EGF로 유도된 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 농동 의존적으로 감소시키는 경향을 나타냈다 (Fig. 10).
- JGT는 최종 추출물 2, 5, 10 μℓ/200 μℓ배양액의 투여 농도에서 24시간의 처리 기간 동안 PMA로 유도된 MUC5AC mRNA의 발현 수준도 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 보여주었다 (Fig. 11).
- 그 결과, 대조군에서 GOT, GPT 흡광도는 0.460 ± 0.044 (100 ± 10% control), 0.320 ± 0.01 (100 ± 3% control)로, JGT를 투여한 군의 GOT, GPT 흡광도는 0.373 ± 0.033 (81 ± 7% control), 0.350 ± 0.015 (109 ± 5% control)로 측정되었으며 (Fig.
- 흡입으로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델을 이용하여 연구를 수행하였는데, 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에 JGT를 2주간 경구 투여한 후 상피 배상 세포 (goblet cell) 내의 점액 함유량에 대한 약물의 영향을 조직병리학적인 방법으로 확인하였다. 그 결과, 대조군이나 SO2 3주 흡입군과 비교를 했을 때, SO2 1주 흡입 후 2주간 SO2 흡입 및 JGT 동시 투여군에서는, SO2 흡입으로 인해 증가되었던 기도 배상 세포내의 점액 함유량이 감소되는 경향을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 즉, 기도 상피 세포층에 Hematoxylin-eosin 염색과 Periodic Acid Schiff (PAS)-Alcian Blue 염색을 실시한 후 광학 현미경 하에서 관찰하였을 때, SO2 3주 흡입군에서는 배상 세포 내에 검은 보라색으로 염색된 뮤신의 양이 증가된 반면에(Fig.
- 기도상피세포층에 Hematoxylineosin 염색과 Periodic Acid Schiff (PAS)-Alcian Blue 염색을 실시한 후 광학 현미경 하에서 관찰한 결과, SO2에 3주간 노출된 흰쥐의 배상 세포 내에 검은 보라색으로 염색된 뮤신의 양은 증가된 반면에, SO2 1주 노출 후 2주간 JGT 동시 투여군에서는 배상 세포 내에 검은 보라색으로 염색된 뮤신의 양이 감소하였다 (Fig. 1. A, B, C).
- 신장독성의 지표로는 Blood Urea Nitrogen (BUN)의 혈청 중 농도를 선정하였으며, 2주간의 JGT 경구 투여 후 BUN의 혈청 중 농도를 측정한 결과, 대조군의 BUN은 8.300 ± 0.500 mg/dℓ (100 ± 6% control)로, JGT 를 투여한 군의 BUN은 7.573 ± 1.512 mg/dℓ (91 ± 16% control)로 측정되어 유의한 차이를 관찰할 수 없었다 (Fig. 4).
- 실험결과에서 JGT는, ATP, EGF, PMA, TNF-α로 각각 자극된 NCI-H292 세포에서의 MUC5AC 기도 뮤신 생성을 유의하게 감소시켰다 (Fig. 5-8).
- 4) 역시 유의한 차이는 관찰할 수 없었다. 이러한 in vivo 독성 시험의 결과를 종합해보면, 滋陰降火湯이 동물의 전반적인 영양 및 대사 상태에 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있다.
- 이상의 약효를 종합해보면, 滋陰降火湯은 滋陰補血淸熱, 潤肺止咳, 理氣燥濕하는 약물들이 배합되어, 咳嗽痰多, 呼吸困難, 胸滿 등의 증상을 유발하는 급만성 기관지염, 상기도염, 폐결핵, 기타 기관지천식 등의 호흡기 질환에 활용할 수 있음을 알 수 있다13,18).
- 이상의 연구결과들을 종합해보면, 滋陰降火湯은 기도 뮤신의 생성을 감소시키고 유전자의 발현에 일정한 영향을 줌으로써, 결과적으로 기도 점액의 과다 생성 및 과다 분비를 조절할 가능성을 보여주고 있다. 이는, 滋陰降火湯 및 그 구성 本草들이 기도 객담 과다 분비 상태를 동반하는 여러 호흡기 질환에 활용될 수 있는 가능성을 제시하는 과학적인 기초자료라 생각되며, 향후 천식, 폐렴, 만성 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증 등 다양한 호흡기 질환의 병태생리학적 특성을 적절히 반영할 수 있는 연구모델을 이용하여 滋陰降火湯의 약효에 관한 추가적인 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것으로 생각된다.
- 1). 즉, 기도 상피 세포층에 Hematoxylin-eosin 염색과 Periodic Acid Schiff (PAS)-Alcian Blue 염색을 실시한 후 광학 현미경 하에서 관찰하였을 때, SO2 3주 흡입군에서는 배상 세포 내에 검은 보라색으로 염색된 뮤신의 양이 증가된 반면에(Fig. 1 B), SO2 1주 흡입 후 2주간 SO2 흡입 및 JGT 동시 투여군에서는 염색된 뮤신의 양이 감소되는 경향을 보였다 (Fig. 1 C). 이러한 결과는, 滋陰降火湯이 다양한 기도 염증성 질환에서 관찰되는 기도 점액 과다 분비 현상의 조절약물로서 응용될 가능성을 일부나마 제시하는 기초과학적 증거라고 생각한다.
- 체중 증가도에 미치는 영향을 알아보기 위해 2주간의 JGT 경구투여 기간을 포함한 전체 3주간의 실험기간 동안 각 흰쥐의 체중 변화를 측정하였는데, 대조군은 140 ± 10 g (100 ± 7% control)로, JGT를 투여한 군은 136 ± 4 g (97 ± 3% control)로 측정되어 체중 변화에는 유의한 차이를 보이지 않았다 (Fig. 2).
후속연구
- 이상의 연구결과들을 종합해보면, 滋陰降火湯은 기도 뮤신의 생성을 감소시키고 유전자의 발현에 일정한 영향을 줌으로써, 결과적으로 기도 점액의 과다 생성 및 과다 분비를 조절할 가능성을 보여주고 있다. 이는, 滋陰降火湯 및 그 구성 本草들이 기도 객담 과다 분비 상태를 동반하는 여러 호흡기 질환에 활용될 수 있는 가능성을 제시하는 과학적인 기초자료라 생각되며, 향후 천식, 폐렴, 만성 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증 등 다양한 호흡기 질환의 병태생리학적 특성을 적절히 반영할 수 있는 연구모델을 이용하여 滋陰降火湯의 약효에 관한 추가적인 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것으로 생각된다.
- 이러한 결과는, JGT를 구성하는 黃柏, 知母, 陳皮 등 ‘降火’ 작용, 즉 강한 항염증 및 항산화 활성을 발현하는 本草들에 의해 나타나는 항염증-항산화 작용을 통하여 MUC5AC 기도 뮤신의 유전자 수준이나 최종 당단백질 합성과정에서의 억제적 효과도 실험모델을 통하여 나타났겠지만, 동시에 白芍藥, 當歸, 熟地黃, 生地黃, 麥門冬 등의 本草에 의한 滋陰, 補血 작용이 실험모델에 반영된 결과라고 추측되나, 본 연구에서 사용된 실험 모델로는 자세한 작용기전을 입증하기는 어려울 것으로 판단된다.
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