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문제 정의
- TNF-α와 IFN-γ를 처리한 HaCaT cells에서 발현되는 RANTES, IP-10, MDC 등의 케모카인은 Th 1,2 사이토카인에 의해 유발되어 수지상세포와 림프구 등 초기 면역반응 세포의 감염 부위로의 이동 및 활성에 중요한 역할을 하며 염증세포의 조직 침윤을 유도하고 선천면역과 함께 획득면역 발달에 관여하는 단백 효소이다43). 본 실험에서는 염증이 유발된 HaCaT cells에서 IP-10, RANTES, MDC 단백질을 증가시킨 후 JS_E가 이들 유전자 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 ELISA를 시행하였다. 그 결과 JS_E는 대조군에 비해 200 ㎍/㎖의 농도에서 IP-10의 발현을 유의성 있게 (p<0.
- acnes 증식을 억제하는 결과를 가져온다49). 이에 본 연구에서는 피지의 가장 많은 구성 성분으로서 P. acnes과 모공 각질세포의 손상에 의한 염증 유발에 직접적인 영향을 미치는 trygliceride의 생성량을 지표로 조협 추출물이 SEB-1 cells의 lipid pattern에 미치는 영향을 조사하였다. TG-S 키트를 이용해 SEB-1 cells의 triglyceride의 양을 분석한 결과, 정상 대조군에 비해 JS_E를 처리한 군에서는 SEB-1의 증식이 억제되는 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도에서 모두 triglyceride이 유의성 있게 감소하였다 (p<0.
- 이에 저자는 TNF-α와 IFN-γ recombinant로 염증반응이 유도된 HaCaT cells와 SEB-1 cells를 이용한 실험을 통해 조협 추출물의 항염증 및 피지 분비 억제 효과를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 TNF-α와 IFN-γ recombinant로 염증반응이 유도된 인간각질형성세포 (HaCaT cells)에 조협 추출물을 처리하여 ELISA를 통해 IP-10, RANTES, MDC 단백질 생성량을 측정하고, 조협 추출물을 처리한 인간피지선세포 (SEB-1 cells)에서 생성되는 triglyceride의 양을 측정한 결과 조협의 항염증 및 피지 분비억제 효과를 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 조협 추출물이 HaCat cells에서 IP-10, RANTES, MDC 발현에 미치는 효과와 SEB-1 cells에서 triglyceride 생성에 미치는 영향을 입증하고자 실험을 진행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- HaCaT cells에 TNF-α와 IFN-γ recombinant (이하 TNF-α + IFN-γ)를 10 ng/㎖ 처리하여 inducible protein 10 (IP-10), regulated on activation (RANTES), macrophage-derived chemokine (MDC) 단백질 생성을 유도한 후 JS_E가 이들 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인하고자 각각의 단백질 양을 측정하기 위해 ELISA를 시행하였다.
- JS_E가 HaCaT cells에 세포독성을 나타내는지 확인하고자 MTT 분석을 시행하였다. MTT 분석은 세포내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의해 생성되는 formazan 측정을 통해 세포의 증식이나 독성을 조사하는 방법32)으로 실험내용은 다음과 같다.
- JS_E가 SEB-1 cells의 lipid pattern에 미치는 영향을 분석하기 위하여 TG-S kit를 이용하여 triglyceride의 변화를 조사하였다. 먼저, SEB-1 cells를 6 well plate에 1 × 106 개를 분주하고 JS_E를 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 5 일 동안 배양한 후 triglyceride를 정량하였다.
- JS_E에 의한 SEB-1 cells의 증식에 대한 효과를 알아보기 위해 MTT 분석을 시행하였다. 먼저, SEB-1 cells를 24 well plate에 5 × 104 cells/㎖의 농도로 seeding하여 60∼70% 세포배양용기에 채워질 때까지 48시간 동안 배양하였다.
- 각각 HaCaT cells를 96-well plates에 1 × 106 cells/㎖ 농도로 100 ㎕씩 분주한 뒤 24 시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 JS_E를 각 농도별 (12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖)로 제조한 후 세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다.
- 먼저, SEB-1 cells를 24 well plate에 5 × 104 cells/㎖의 농도로 seeding하여 60∼70% 세포배양용기에 채워질 때까지 48시간 동안 배양하였다. 그 다음, 성장배지를 제거하고 FBS를 포함하지 않은 유지 배지에 희석한 JS_E를 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖의 농도로 가하여 1, 3, 5 일간 동시 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 1 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 넣어 4 시간 동안 반응시킨 후에, 생성된 formazan양을 ELISA를 이용해 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 판정하였다.
- 조협 (20 g)을 분쇄기로 두 쪽으로 분쇄하여 환류추출기에 넣고 45 ℃에서 70% 에탄올 1 ℓ를 넣고 60 분 추출한 후 다시 70% 에탄올 1 ℓ를 넣고 같은 조건으로 60 분 동안 재탕하였다. 그 후 감압증류기를 이용하여 유기용매를 제거하는 농축과정을 거치고, 동결건조기를 통하여 건조된 조협 70% EtOH 추출물 3.4 g (이하 JS_E)을 얻었다(수득율 17%) (Scheme. 1).
- 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖의 농도로 가하여 1, 3, 5 일간 동시 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 1 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 넣어 4 시간 동안 반응시킨 후에, 생성된 formazan양을 ELISA를 이용해 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 판정하였다.
- 대식세포염증성 단백질인 MDC 생산량은 정상군(normal)에서 185.44 pg/㎖이었으며 TNF-α + IFN-γ (TI)를 처리한 대조군 (TI)은 774.65 pg/㎖, CsA (cyclosporin A)를 처리하고 TI로 자극한 양성 대조군은 250.59 pg/㎖였다.
- 대식세포염증성 단백질인 RANTES 생산량은 정상군(normal)에서 53.46 pg/㎖이었으며 TNF-α + IFN-γ (TI)를 처리한 대조군 (TI)은 82.30 pg/㎖, CsA (cyclosporin A)를 처리하고 TI로 자극한 양성 대조군은 55.39 pg/㎖였다.
- 먼저, SEB-1 cells를 6 well plate에 1 × 106 개를 분주하고 JS_E를 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 5 일 동안 배양한 후 triglyceride를 정량하였다.
- 본 실험에서는 한일분쇄기 (FM-700SS, Yeongdeungpo, Korea), 환류추출기 (Heating Mantle, MS-DM 609/20 L, PK Lab, Korea), 열탕추출기 (DWT-1800T, 대웅, Kangnam, Korea), 감압증류기 (N-1200A, EYELA. CO. LTD, Japan), 동결건조기 (PF-10/ALPHA 1-2LD, Germany), CO2 배양기 (Forma scientific Co., USA), 원심분리기 (한일과학, Yeongdeungpo, Korea), plate shaker (Lab-Line, TRIPUNITHURA, USA), Spectrophotometer (Shimazu, Kyoto, Japan), Bio-freezer (Sanyo, MORIGUCHI, Japan), ELISA microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA) 등을 사용하였다.
- 1). 세포독성 실험은 각 well에 세포를 90% 이상 배양하여 추출물을 처리한 지 24 시간 경과 후, 대조군을 100%로 기준하였을 때 시료의 상대 정량 수치를 비교한 것이다. 반면 SEB-1 cells의 MTT 분석은 세포의 증식능을 측정하기 위한 것으로 세포를 세포배양용기에 60∼70% 가량 채운 후 1, 3, 5 일간 배양하여 세포증식이 얼마나 일어났는지 대조군과 상대 비교하는 실험이다.
- 그런 다음 暗 조건에서 30 분간 건조한 후 DMSO 100 ㎕를 분주하여 1 시간 동안 혼합한 후 ELISA microplate reader로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존률은 시료 무첨가구의 흡광도 대비 시료첨가구의 흡광도의 백분율에 의해 산출하였다.\(세포생존률 = {시료첨가구의흡광도 \over 시료무첨가구의흡광도} \times 100\)
- L-a-glycerophosphoric acid는 L-a-Glycerol phosphate oxydase에 의해 산화되어 과산화수소를 발생시키며, 생성된 과산화수소는 Peroxidase에 의해 N-Ethyl-N-sulfopro pyl-Toluidine과 4-Aminoantipyrine을 산화 縮合해 적색 색소를 생성한다. 이 색소를 550 nm에서 比色하여 triglyceride를 측정하는데, 효소시약과 효소시약 용해액의 혼합액을 효소용액으로 하여 검체 (혈청 0.02 ㎖)와 혼합 후 37℃에서 10 분 간 방치한 뒤 triglyceride의 양을 측정하고 사전에 설정된 농도 또는 활성치 환산기능에 의해 검체의 triglyceride 농도를 구했다.
대상 데이터
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-kiphenyl-tetrazilium bromide (MTT), Tris-HCl, KCl, MgCl2, Dubecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배양액, dimethyl sulfoxide (DMSO), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), Streptomycin는 sigma사 (St. Louis, MO. USA) 제품을 사용하였다.
- TNF-α와 IFN-γ recombinant는 R&D system사 (Minneapolis, MN, USA) 제품을, trypsin-EDTA와 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Invitrogen GibcoTM(Carsbad, CA, USA) 제품을, triglyceride량 측정은 아산제약사 TG-S kit (AM157, Korea)를 사용하였고, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 조협 (Gleditsiae Fructus)은 국내 한약공급업체인 옴니허브 (www.omniherb.com, Korea)에서 구입, 정선하여 사용하였다. 조협 (20 g)을 분쇄기로 두 쪽으로 분쇄하여 환류추출기에 넣고 45 ℃에서 70% 에탄올 1 ℓ를 넣고 60 분 추출한 후 다시 70% 에탄올 1 ℓ를 넣고 같은 조건으로 60 분 동안 재탕하였다.
- 인간각질형성세포주 (A spontaneously immortalized human keratinocyte cell line, HaCaT cells)는 한국 세포주은행 (Seoul National University, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며 10% FBS와 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 37 ℃의 온도와 5% CO2 조건이 유지되는 CO2 배양기를 통해 배양하였다.
- 인간피지선세포주 (Immortalized human sebocyte, SEB-1 cells)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하여 사용하였으며 FBS 2.5%, adenosine 1.8 × 104 M, hydrocortisone 0.4 ㎍/㎖, insulin 10 ng/㎖, epidermal growth factor 3 ng/㎖, choleratoxin 1.2 × 1010 M을 포함하는 standard medium인 DMEM (5.5 mM glucose) : F-12 배양액을 3 : 1 비율로 섞은 배지에서 37 ℃의 온도와 5% CO2 조건이 유지되는 CO2 배양기를 통해 배양하였다.
데이터처리
- 각 실험군 결과 값은 SPSS 통계프로그램을 사용하여 통계처리 하였으며, independent T-test로 p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
성능/효과
- 1. 조협 추출물은 HaCaT cells에서 TNF-α와 IFN-γ에 의해 유도되는 IP-10, RANTES, MDC 발현을 억제하였다.
- 2. 조협 추출물은 SEB-1 cells에서 triglyceride의 생성을 억제하였다.
- JS_E를 처리한 후 TI로 자극한 실험군에서 JS_E 50 ㎍/㎖는 12978.18 pg/㎖, 100 ㎍/㎖는 11375.64 pg/㎖, 200 ㎍/㎖는 7905.90 pg/㎖로 측정되어 JS_E의 농도가 증가함에 따라 IP-10 생산량이 감소하는 경향을 보였으나, 통계학적 유의성은 JS_E 200 ㎍/㎖ (p<0.05)에서만 관찰되었다 (Fig. 2).
- JS_E를 처리한 후 TI로 자극한 실험군에서 JS_E 50 ㎍/㎖는 78.68 pg/㎖, 100 ㎍/㎖는 68.31 pg/㎖, 200㎍/㎖는 53.44 pg/㎖로 측정되어 JS_E 농도가 증가함에 따라 RANTES의 생산량이 감소하는 경향을 보였으며, 통계학적 유의성은 JS_E 100, 200 ㎍/㎖ (p<0.05)에서만 관찰되었다 (Fig. 3).
- JS_E를 처리한 후 TI로 자극한 실험군에서 JS_E 50 ㎍/㎖는 805.09 pg/㎖, 100 ㎍/㎖는 620.81 pg/㎖, 200 ㎍/㎖는 388.26 pg/㎖로 측정되었고 JS_E 농도가 증가함에 따라 MDC의 생산량이 감소하는 경향을 보였으며 통계학적 유의성은 JS_E 100, 200 ㎍/㎖(p<0.05, p<0.01)에서만 관찰되었다 (Fig. 4).
- JS_E에 대한 피부 항염 효과 측정을 위해 HaCaT cells의 세포독성을 확인한 결과, JS_E 400 ㎍/㎖의 농도에서 HaCaT cells의 생존률은 72.68%, 800 ㎍/㎖은 25.87%로 400, 800 ㎍/㎖에서 세포독성을 보였다(p<0.05, p<0.01) (Fig. 1).
- 반면 SEB-1 cells의 MTT 분석은 세포의 증식능을 측정하기 위한 것으로 세포를 세포배양용기에 60∼70% 가량 채운 후 1, 3, 5 일간 배양하여 세포증식이 얼마나 일어났는지 대조군과 상대 비교하는 실험이다. SEB-1 cells에 JS_E를 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 1, 3, 5일 동안 동시 배양한 결과, JS_E의 농도가 증가함에 따라 SEB-1 cells의 증식률이 점차 감소하는 경향을 보이며 12.5 ㎍/㎖ 이상에서 정상 대조군의 60% 이하로 세포 증식이 억제되었다 (Fig. 5).
- SEB-1 cells의 세포증식률은 정상군 (normal)을 100%로 기준하였을 때, JS_E를 처리한 실험군에서 JS_E 6.25 ㎍/㎖는 날짜별로 1, 3, 5 일 각각 64.28%, 105.98%, 105.30%였으며, 12.5 ㎍/㎖는 23.14%, 30.60%, 59.03%, 25 ㎍/㎖는 14.37%, 22.76%, 7.85%, 50 ㎍/㎖는 14.19%, 18.56%, 8.11%, 100 ㎍/㎖는 17.56%, 22.74%, 22.9%, 200 ㎍/㎖는 23.95%, 19.62%, 50.80%로 JS_E의 농도가 증가함에 따라 감소하고 처리한 시간에 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. JS_E 6.
- TG-S 키트를 이용해 SEB-1 cells의 triglyceride의 양을 분석한 결과, 정상 대조군에 비해 JS_E를 처리한 군에서는 SEB-1의 증식이 억제되는 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도에서 모두 triglyceride이 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001) (Fig. 6).
- triglyceride의 생성량은 정상 대조군의 triglyceride를 100%로 기준할 때, JS_E를 처리한 실험군에서 JS_E 100 ㎍/㎖는 39.98%, 200 ㎍/㎖는 28.96%, 400 ㎍/㎖는 21.86%로 측정되어 JS_E의 농도가 증가함에 따라 정상 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 (p<0.001)감소하였다 (Fig. 6).
- 그 결과 JS_E는 대조군에 비해 200 ㎍/㎖의 농도에서 IP-10의 발현을 유의성 있게 (p<0.05) 감소시켰고 (Fig. 2), 100, 200 ㎍/㎖에서 RANTES의 발현을 유의성 있게 (p<0.05) 억제시켰으며 (Fig. 3), 100, 200 ㎍/㎖에서 MDC의 발현에 유의성 있는 (p<0.05, p<0.01) 감소를 보였다 (Fig. 4).
- 대식세포염증성 단백질인 IP-10 생산량은 정상군(normal)에 비하여 TNF-α + IFN-γ (TI)를 처리한 대조군 (TI)에서 12129.10 pg/㎖로 증가되었으며, CsA(cyclosporin A)를 처리하고 TI로 자극한 양성 대조군은 8791.56 pg/㎖으로 감소하였다.
- 모든 실험에 앞서 MTT 분석을 통해 세포의 생존률 및 증식능을 측정하였으며 조협 추출물 (JS_E)을 처리한 HaCaT cells는 400 ㎍/㎖ 이상에서 80% 미만으로 감소하여 세포독성을 가지는 것으로 나타났다 (Fig. 1). 세포독성 실험은 각 well에 세포를 90% 이상 배양하여 추출물을 처리한 지 24 시간 경과 후, 대조군을 100%로 기준하였을 때 시료의 상대 정량 수치를 비교한 것이다.
- 4). 이를 통해 JS_E가 IP-10, RANTES, MDC의 생성을 저해함으로서 염증 반응을 억제하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
- 이상에서 조협 추출물이 항염증 및 피지 분비 억제 효능을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과를 통해 JS_E가 항염증 및 피지 분비 억제 효능을 가짐을 확인하였으며 이를 바탕으로 향후 여드름을 포함한 피부 각질 세포의 손상 및 염증, 피지의 과잉 분비로 야기되는 다양한 피부 질환에 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 추후 본 연구에서 다루지 못한 조협 추출물의 유효, 지표 성분에 관한 연구와 함께 치료 제재 개발, 안전성 관련 연구 및 임상 연구가 추가적으로 이루어지길 기대하는 바이다.
- 이상의 결과를 통해 JS_E가 항염증 및 피지 분비 억제 효능을 가짐을 확인하였으며 이를 바탕으로 향후 여드름을 포함한 피부 각질 세포의 손상 및 염증, 피지의 과잉 분비로 야기되는 다양한 피부 질환에 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 추후 본 연구에서 다루지 못한 조협 추출물의 유효, 지표 성분에 관한 연구와 함께 치료 제재 개발, 안전성 관련 연구 및 임상 연구가 추가적으로 이루어지길 기대하는 바이다.
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