[논문]정공등현호색(丁公藤玄胡索) 약침(藥鍼)이 류마티스 관절염 생쥐 모델에 미치는 영향

김현지; 전주현; 김영일

doi:10.13045/acupunct.2016014

정공등현호색(丁公藤玄胡索) 약침(藥鍼)이 류마티스 관절염 생쥐 모델에 미치는 영향
A Study on the Effect of Erycibae Caulis and Corydalis Tuber Pharmacopuncture on a Mouse Model with Collagen Induced Rheumatoid Arthritis 원문보기

The acupuncture = 대한침구의학회지, v.33 no.2, 2016년, pp.21 - 34

김현지 (대전대학교 한의과대학 침구의학교실) , 전주현 (대전대학교 한의과대학 침구의학교실) , 김영일 (대전대학교 한의과대학 침구의학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The aim of the present study is to examine the effect and mechanism of Erycibae Caulis and Corydalis Tuber Pharmacopuncture (ECP) on a mouse model with collagen induced rheumatoid arthritis (CIA). Methods : We evaluated the Aspartate aminotransferase (AST), Alanine aminotransferase (ALT), Creatinine, and the Blood urea nitrogen (BUN) of serum to examine the safety of this study. In vivo, we compared the results of the non-treated group, the normal saline pharmacopuncture treated control group, the indomethacin treated group and the ECP group. We evaluated rheumatoid arthritis manifestation and the Rheumatoid Arthritis Index (AI). Also, immune cells in blood affected by ECP were evaluated by calculating the level of white blood cells (WBC), neutrophil, lympocytes and monocytes. Next, the level of Immunoglobulin M (IgM), Immunoglobulin G (IgG), Interleukin (IL)-$1{\beta}$, IL-6, IL-17, Tumor Necrosis Factor (TNF)-${\alpha}$ and Granulocyte-macrophage Stimulating Factor (GM-CSF)in serum were measured. We examined the imaging of cartilage degeneration using micro CT-arthrography of the hind paw. Additionally, we examined the effects of reducing bone volume (BV) ratio and bone surface/bone volume (BS/BV) ratio with 3D Micro-CT. Finally, we did a histopathologic examination analysis. Results : The absence of liver and kidney toxicity was evident. In vivo, edema of the joints of the ECP group decreased greatly in macroscopic observation. AI measurement of the ECP group also decreased significantly compared to the control group. The level of WBC, neutrophil, lympocytes, and monocytes in the blood decreased but there was no statistical significance of this data. IgM of the ECP group decreased significantly compared to the control group. IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$, and GM-CSF production of the ECP group decreased significantly compared to the control group. As a result of examining joint condition with 3D micro CT, deformation and destruction of the joint was shown to have decreased. Bone density of ECP group increased at a statistically significant level compared to the control group. Degree of joint inflammation of ECP group decreased significantly compared to the control group. After H&E and M-T staining, infiltration of immune cells, subsidence of the cartilage, damage to the synovial cells and joint erosion decreased. Conclusion : This study showed that ECP hindered the process of rheumatoid arthritis and protected joints and cartilage.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구는 丁公藤玄胡索藥鍼의 류마티스 관절염 치료에 대한 효능을 규명하고자 In vivo에서 collagen-induced arthritis(CIA) mouse에서 인체의 足三里 (Joksamli, ST36)에 상응하는 혈위에 丁公藤玄胡索藥鍼 투여 후 육안적 관찰 및 Rheumatoid Arthritis Index (AI) 측정, 혈액 내의 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 등 면역세포와 혈청 내의 면역글로블린 및 Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-17, Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, Granulocyte-macrophageStimulatingFactor (GMCSF) 등의 cytokine과 chemokine의 생성량을 측정하였다. 3D micro-computed tomography (micro CT)를 통한 관절 상태, 골밀도, 관절 염증 정도 측정과 병리조직학적 변화를 측정하였으며 안전성 검사 또한 확인하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구는 丁公藤玄胡索藥鍼의 류마티스 관절염 치료에 대한 효능을 규명하고자 In vivo에서 collagen-induced arthritis(CIA) mouse에서 인체의 足三里 (Joksamli, ST36)에 상응하는 혈위에 丁公藤玄胡索藥鍼 투여 후 육안적 관찰 및 Rheumatoid Arthritis Index (AI) 측정, 혈액 내의 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 등 면역세포와 혈청 내의 면역글로블린 및 Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-17, Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, Granulocyte-macrophageStimulatingFactor (GMCSF) 등의 cytokine과 chemokine의 생성량을 측정하였다.

가설 설정

C : CIA-induced Rheumatoid Arthritis group treated orally with indomethacin (200 ㎎/㎏/every two days).

제안 방법

1차 유발 후 2주 후에 1차 시기와 동일하게 CFA 대신에 incomplete Freund’s adjuvant (IFA)와 혼합하고 오른쪽 발바닥에 주사하여 CIA-mouse를 유발하였다.
2차 주사 이후에 Rheumatoid Arthritis index score 확인을 위하여 DBA/1 생쥐에서 각 4개의 발 (paw)을 관찰해 발마다 0 ∼ 4점 (총점 0 ∼ 16점)의 임상점수, 발목의 두께 변화, 발생률 등을 측정하였다.
5주간 실험 종료 후 동물을 희생해서 각 그룹별로 후 족부를 분리하였다. 분리한 후족부의 시편에서 사후 경직이 일어나기 전(5분 내)에 최대한 발가락을 편 후, 10 % 포름알데히드 용액에 고정하였다.
ECP 투여 종료 후 혈액 내 면역세포에 미친 영향을 보기 위해 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구를 측정하였으며 모두 대조군에 비해 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다.
ELISA kit를 이용하여 IL-17, GM-CSF를 다음과 같이 측정하였다. Microwell에 coating buffer 100㎕를 분주시킨 후 4℃에서 overnight하고 washing 완충 용액으로 3회 세척하였다.
ELISA kit를 이용하여 Immunoglobulin M (IgM)과 Immunoglobulin G (IgG) 생성량을 다음과 같이 측정하였다. 항체를 coating 완충 용액에 희석하고 microwell에 coating한 후 4 ℃에서 overnight했다.
IL-1β, IL-6, TNF-α 농도를 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용해서 다음과 같이 측정하였다.
분리한 후족부의 시편에서 사후 경직이 일어나기 전(5분 내)에 최대한 발가락을 편 후, 10 % 포름알데히드 용액에 고정하였다. Micro-CT 촬영과 Structural Parameter를 ㈜라온바이오 (Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하였다. 후족부 전체를 Micro-CT로 촬영한 후 3D 작업을 실시하였고, Structural Parameter 측정 시 가운뎃발가락을 기준으로 해서 BV (bone volume) 및 BS (bone surface)에 대한 ratio를 산출해 관절의 염증 정도를 나타내었다.
丁公藤玄胡索藥鍼(ECP) 투여가 류마티스 관절염에서 갖는 치료 효과를 규명하기 위해 Collagen-induced arthritis mouse의 足三里에 ECP 투여 후 다음과 같은 결론을 얻었다.
또한 ECP 실시로 인해 혈청 내 IgM, IgG의 생성량에 미치는 영향을 확인하였다. 측정 결과 IgM과 IgG 모두 대조군에 비하여 감소를 나타내었으며, 특히 IgM은 유의성 있게 감소하였다(Fig.
류마티스 관절염이 발현되었을 때 증가되어 관찰되는 cytokine 및 chemokine을 관찰하였다. 그 결과, IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-CSF 생성량은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(Fig.
본 연구에서 in vivo의 양성대조군으로 indomethacin 200 ㎕ (200 ㎎/㎏) 경구투여군을 설정하였다. Indomethacin은 NSAIDs의 한 종류로 류마티스 관절염에서의 통증과 염증을 줄이는 작용으로 널리 쓰이는 약물이다.
본 연구에서는 In vivo에서 CIA-mouse의 발을 관찰하여 AI를 측정하였고, 혈액 내 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 등 면역세포의 함량, 혈청 내 cytokine과 chemokine 및 면역 글로불린을 측정하였다. 실험 종료 후 관절에 미치는 영향을 확인하고자 동물 후족부의 3D micro CT 촬영 및 Structural Parameter를 측정하였고, 병리조직학적 검사를 시행하였다.
본 연구에서는 丁公藤, 玄胡索으로 구성된 藥鍼을 CIA-mouse의 足三里 (Joksamli, ST36)에 실시하였다. 丁公藤은 메꽃과의 덩굴성줄기로 기존 연구에서 조골세포 증식과 파골세포 활성을 유발하는 tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) 활성 억제와 진통의 효과를 보고하여 류마티스 관절염에서의 활용 가능성을 제시하였다^12,13).
분쇄기를 이용하여 EC 2첩 (120 g)을 분쇄해서 분말로 만든 후, 삼각 flask에 넣고 증류수 500 ㎖를 가해 3시간동안 환류 추출하였다. 여과지로 3회에 걸쳐 추출액을 여과한 후 rotary evaporator로 감압 농축하였다.
본 연구에서는 In vivo에서 CIA-mouse의 발을 관찰하여 AI를 측정하였고, 혈액 내 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 등 면역세포의 함량, 혈청 내 cytokine과 chemokine 및 면역 글로불린을 측정하였다. 실험 종료 후 관절에 미치는 영향을 확인하고자 동물 후족부의 3D micro CT 촬영 및 Structural Parameter를 측정하였고, 병리조직학적 검사를 시행하였다.
실험 종료 후 후족부를 촬영한 3D micro CT를 통해 ECP 투여가 관절에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 대조군에서는 관절의 변형과 파괴가 크게 일어났으나(Fig.
실험 종료 후에 DBA/1 생쥐로부터 심장 천자법을 이용하여 채혈하고 전혈과 20분간 6,500rpm에서 원심분리한 혈청을 통해 서울의과학연구소(Seoul, Korea)에 백혈구와 호중구, 림프구, 단핵구의 함량을 분석 의뢰하였다.
정상군은 실험 기간 동안 무처치하였으며 양성 대조군에는 indomethacin (이하, Indo)을 200 ㎕ (200 ㎎/㎏)씩 경구투여하였고, 대조군인 증류수 실시군과 ECP군은 각각 50㎕를 인체의 足三里에 상응하는 혈위에 시행하였다. 실험은 5주간 이틀에 한 번씩 진행하였으며, 진행하는 동안 자유식이를 하였다.
1차 유발 후 2주 후에 1차 시기와 동일하게 CFA 대신에 incomplete Freund’s adjuvant (IFA)와 혼합하고 오른쪽 발바닥에 주사하여 CIA-mouse를 유발하였다. 실험은 6마리씩 정상군, 대조군, 양성대조군, 실험군 등 총 4개의 군으로 나누었다. 정상군은 실험 기간 동안 무처치하였으며 양성 대조군에는 indomethacin (이하, Indo)을 200 ㎕ (200 ㎎/㎏)씩 경구투여하였고, 대조군인 증류수 실시군과 ECP군은 각각 50㎕를 인체의 足三里에 상응하는 혈위에 시행하였다.
실험을 종료한 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장 천자법으로 채혈한 다음 20분간 6,500rpm에서 원심분리해서 혈청을 분리하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α 농도를 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용해서 다음과 같이 측정하였다.
실험을 종료한 후 micro-CT로 후족부를 촬영하여 3D로 변환하였다. 대조군에서는 관절의 변형과 파괴가 크게 일어났으며(Fig.
에틸에테르 (C2H5OC2H5)로 마취하고 후족부를 잘라내고 각 실험군별로 적출한 조직을 48시간 동안 10 % 중성 포르말린에 고정하여 고정이 완료된 조직들을 12시간 흐르는 수돗물에서 수세한 후 조직 내의 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위하여 60 ~ 100 % 알코올까지 농도 상승순으로 탈수하였고, xylene에 투명 과정을 거친 후 파라핀 블럭을 제작하였다.
분쇄기를 이용하여 EC 2첩 (120 g)을 분쇄해서 분말로 만든 후, 삼각 flask에 넣고 증류수 500 ㎖를 가해 3시간동안 환류 추출하였다. 여과지로 3회에 걸쳐 추출액을 여과한 후 rotary evaporator로 감압 농축하였다. 농축액에 90 % ethyl alcohol 30 ㎖를 가하였으며, 실온에서 교반한 후 놓아두어 침전물이 생성되게 한 후 여과하였다.
8의 농축액이 되도록 조절하고, 12시간 동안 4 ℃에서 놓아둔 후 syringe filtering하여 침전물을 제거하였다. 여과한 농축액에 PBS를 첨가해 5 %로 희석하여 丁公藤玄胡索藥鍼 (Combination of Erycibae Caulis and CorydalisTuber Pharmacopuncture, 이하 ECP로 표기)으로 사용하였다.
실험은 6마리씩 정상군, 대조군, 양성대조군, 실험군 등 총 4개의 군으로 나누었다. 정상군은 실험 기간 동안 무처치하였으며 양성 대조군에는 indomethacin (이하, Indo)을 200 ㎕ (200 ㎎/㎏)씩 경구투여하였고, 대조군인 증류수 실시군과 ECP군은 각각 50㎕를 인체의 足三里에 상응하는 혈위에 시행하였다. 실험은 5주간 이틀에 한 번씩 진행하였으며, 진행하는 동안 자유식이를 하였다.
제작된 블럭은 박편절단기 (microtome)를 이용하여 3 ∼ 4 ㎛ 두께로 절편을 만들고 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 후 hematoxyline과 eosin (H&E)염색 및 masson trichrome stain염색을 각각 실시해 광학현미경상으로 관찰 및 사진을 촬영하였다.
에틸에테르 (C2H5OC2H5)로 마취하고 후족부를 잘라내고 각 실험군별로 적출한 조직을 48시간 동안 10 % 중성 포르말린에 고정하여 고정이 완료된 조직들을 12시간 흐르는 수돗물에서 수세한 후 조직 내의 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위하여 60 ~ 100 % 알코올까지 농도 상승순으로 탈수하였고, xylene에 투명 과정을 거친 후 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블럭은 박편절단기 (microtome)를 이용하여 3 ∼ 4 ㎛ 두께로 절편을 만들고 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 후 hematoxyline과 eosin (H&E)염색 및 masson trichrome stain염색을 각각 실시해 광학현미경상으로 관찰 및 사진을 촬영하였다.
2차 주사 이후에 Rheumatoid Arthritis index score 확인을 위하여 DBA/1 생쥐에서 각 4개의 발 (paw)을 관찰해 발마다 0 ∼ 4점 (총점 0 ∼ 16점)의 임상점수, 발목의 두께 변화, 발생률 등을 측정하였다. 측정은 9주차부터 13주차까지 매주마다 기록하였고 기준은 다음과 같다 (Table 2).
혈청 내의 Aspartate aminotransferase (AST), Alanine aminotransferase (ALT), Creatinine, Blood urea nitrogen (BUN) 활성도를 측정하기 위해서 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 대전대학교 한방BIO FabLab (Daejeon, Korea)에 분석 의뢰하였다.
혈청 내의 Aspartate aminotransferase (AST), Alanine aminotransferase (ALT), Creatinine, Blood urea nitrogen (BUN) 활성도를 측정하기 위해서 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 대전대학교 한방BIO FabLab (Daejeon, Korea)에 분석 의뢰하였다.
Micro-CT 촬영과 Structural Parameter를 ㈜라온바이오 (Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하였다. 후족부 전체를 Micro-CT로 촬영한 후 3D 작업을 실시하였고, Structural Parameter 측정 시 가운뎃발가락을 기준으로 해서 BV (bone volume) 및 BS (bone surface)에 대한 ratio를 산출해 관절의 염증 정도를 나타내었다.

대상 데이터

5주령의 DBA/1 생쥐를 2주간 안정기를 거쳐 7주령이 된 생쥐에 꼬리의 기저부에서부터 1.5∼3 cm 아래쪽의 피내를 통하여 제2형 콜라겐 100 ㎍인 혼합액 0.1㎖을 천천히 주입함으로써 1차 유발을 하였다.
Isopropanol (Sigma Co., U.S.A.), gelred (Sigma Co., U.S.A.), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS:Welgene,Korea), ether (SigmaCo., U.S.A.), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), streptomycin (Hyclone Co., U.S.A.), 2,2'- azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid) (ABTS : Sigma Co., U.S.A.), formaldehyde (Sigma Co., U.S.A.), trypan blue (Sigma Co., U.S.A.), Immunization Grade Bovine Type II Collagen, Solution (Chondrex Co., U.S.A) 등을 사용하였다.
Rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench(Vision scientific Co.,Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimadizu Co., Japan), centrifuge (SigmaCo., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany) 등을 사용하였다.
본 실험에 사용한 丁公藤玄胡索(ErycibaeCaulisand Corydalis Tuber, 이하 EC로 표기)의 구성 약재들은 ㈜옴니허브에서 구입해 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선 후 사용하였고, 그 내용 및 분량 (1첩)은 다음과 같다(Table 1).
실험동물인 수컷 5주령의 DBA/1 생쥐 (16 ∼ 22 g)를 ㈜중앙실험동물에서 공급받았으며 실험 당일까지 충분한 고형사료 (㈜퓨리나)와 물을 공급하고 온도 22 ± 2 ℃, 습도 55±15%, 12시간-12시간주기(light-darkcycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다.

데이터처리

Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.001, †: p＜0.01).
Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.001, †: p＜0.01, ‡: p＜0.05).
Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t－test (Significance of results, *: p＜0.01, †: p＜0.05).
실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's t－ test와 ANOVA를 사용하여 통계 처리하였고 p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.

성능/효과

1) 육안적 관찰 결과 부종이 대조군에 비해 감소하였으며, AI 또한 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
2) 혈액 내 면역세포인 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 모두 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다.
2. 관절 상태를 확인한 결과 대조군에 비해 관절 마디의 부식 및 파괴가 적었으며, 골밀도는 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였고, 관절 염증 정도는 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
3) 혈청 내 면역 글로불린인 IgM은 유의성 있게 감소하였고, IgG는 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다.
3. H&E와 M-T 염색 후 25×로 관찰한 결과 면역세포의 침투와 활막세포의 손상, 연골의 침하 및 관절의 부식이 감소하였다.
4) IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-CSF 생성량은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IL-17 생성량은 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다.
AST를 측정한 결과 정상군은 135.0±11.2IU/L, ECP 군은 135.0 ± 14.7 IU/L로 나타났으며, ALT를 측정하여 정상군은 28.0 ± 1.5 IU/L, ECP군은 25.5 ± 6.8 IU/L로 정상군에 비해 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
CIA-mouse를 사용한 In vivo 실험에서 대조군에서는 발, 발목 관절에 육안적으로 부종이 점차 진행되었으나, 양성 대조군과 ECP군은 대조군에 비하여 부종과 관절의 변형이 대조군에 비하여 진행이 많이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 류마티스 관절염 유발 후 9주차부터 13주차까지 측정한 AI 지수에서 양성 대조군과 ECP군 모두 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig.
CIA-mouse에서 실험이 진행되는 5주 동안 육안적으로 관찰한 결과, 대조군에서는 발(paw)과 발목 및 마디 등의 부종이 점차 심해지는 반면, 양성 대조군과 ECP군은 부종과 관절의 변형이 대조군에 비하여 진행이 많이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). AI 지수는 대조군이 9주차에서 8.
Creatinine 농도를 측정한 결과, 정상군은 1.6 ± 0.3㎎/㎗, ECP군은 1.4±0.4㎎/㎗로 나타났으며, BUN 농도를 측정하여 정상군은 35.0 ± 5.0 ㎎/㎗, ECP군은 37.0 ± 4.9 ㎎/㎗로 나타나 정상군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
ECP의 5주간 투여 후 간과 신 독성 검사를 실시해 혈청 내의 AST, ALT, creatinine, BUN 농도를 측정한 결과 정상군과 큰 차이를 나타내지 않아 안전성을 확인하였다.
5-D). 골밀도를 측정한 결과, 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 나타내었고, 관절의 염증 정도를 측정한 결과, 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 6).
실험 종료 후 후족부를 촬영한 3D micro CT를 통해 ECP 투여가 관절에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 대조군에서는 관절의 변형과 파괴가 크게 일어났으나(Fig.5-B), ECP군에서는 대조군에 비하여 관절의 변형은 일어났지만 관절 마디의 부식 및 파괴가 적었음을 확인할 수 있었다(Fig. 5-D). 골밀도를 측정한 결과, 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 나타내었고, 관절의 염증 정도를 측정한 결과, 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다(Fig.
그 결과, IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-CSF 생성량은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4).
실험을 종료한 후 micro-CT로 후족부를 촬영하여 3D로 변환하였다. 대조군에서는 관절의 변형과 파괴가 크게 일어났으며(Fig. 5-B), ECP군에서는 관절의 변형은 일어났으나 대조군에 비하여 관절 마디의 부식 및 파괴가 적게 나타났다(Fig. 5-D).
또한 Bone surface와 bone volume에 대한 ratio를 산출해 관절의 염증 정도를 측정하였으며, 대조군은 28.40 ± 1.15 (1/U)로 나타난 반면, 양성 대조군은 20.40 ± 0.68 (1/U), ECP군은21.20 ± 0.83 (1/U)로 나타나 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다(Fig. 6).
1). 류마티스 관절염 유발 후 9주차부터 13주차까지 측정한 AI 지수에서 양성 대조군과 ECP군 모두 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 2). 이와 같이 류마티스 관절염 증상에 ECP 투여가 호전 반응을 보인 것을 확인하였다.
반면 혈청 내 IL-1β, IL-17, TNF-α의 생성량은 ECP군에서 더욱 우수한 효능이 나타났다.
그러나 장기 복용하는 경우 위장관계에서 궤양 유발, 장출혈 등 부작용을 초래할 수 있고, 낮은 수용성으로 인해 경구투여 시의 생물학적 가용능이 낮아 보다 안전하고 효율적인 치료법 개발이 필요한 것으로 사료된다⁴⁶⁾. 본 연구결과, 양성대조군이 ECP군에 비해 AI 지수와 혈액 내 면역 세포, 혈청 내 면역글로불린, cytokine 및chemokine 중 IL-6와 GM-CSF 생성량, 골밀도와 관절 염증에서 비교 우수한 효능을 보였다. 반면 혈청 내 IL-1β, IL-17, TNF-α의 생성량은 ECP군에서 더욱 우수한 효능이 나타났다.
생쥐의 후족부에 H&E와 M-T 염색을 해서 25×로 측정한 결과, 대조군에서는 면역세포의 침투 및 활막세포의 손상, 연골의 침하, 관절의 부식이 심하게 일어난 반면(Fig. 7-B), ECP군은 대조군에 비해 면역세포의 침투나 활막세포의 손상, 연골의 침하, 그리고 관절의 부식이 상대적으로 적게 나타났다(Fig. 7-D).
실험 종료 후 혈액 내 백혈구를 측정한 결과, 대조군은 5.3 ± 0.4 × 103 cells/㎕로 나타난 반면, 양성 대조군은 3.3 ± 0.8 × 103 cells/㎕, ECP군은 3.6 ± 1.2 × 103 cells/㎕로 나타났다.
실험 종료 후 혈청 내 GM-CSF chemokine을 측정한 결과, 대조군은 288.9 ± 87.5 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 124.5 ± 21.9 pg/㎖, ECP군은 168.8 ± 21.8 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다.
실험 종료 후 혈청 내 IL-6 cytokine을 측정한 결과, 대조군은 755.0±214.3pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 375.3 ± 144.1 pg/㎖, ECP군은 423.4 ± 114.7 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다.
실험 종료 후 혈청 내 IgM을 측정한 결과, 대조군은 49.7 ± 7.6 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 32.7 ± 6.3 pg/㎖, ECP군은 35.8 ± 4.2 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
실험 종료 후 혈청 내 TNF-αcytokine을 측정한 결과, 대조군은 2,774.4±123.5 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 2,004.8 ± 165.7 pg/㎖, ECP 투여군은 1,887.6±199.6 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다.
실험 종료 후 혈청 내의 IL-1βcytokine을 측정한 결과, 대조군은 675.9 ± 58.4 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 472.9 ± 34.9 pg/㎖, ECP군은 462.3 ± 33.8 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 감소하였다.
실험 종료 후 혈청 내의 IL-17 cytokine을 측정한 결과 대조군은 13.4 ± 1.3 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 10.3 ± 0.3 pg/㎖, ECP 투여군은 10.1 ± 0.4 pg/㎖로 나타나 대조군에 비해서 감소하였으나 유의성 있는 차이는 없었다.
실험 종료 후 혈청 내의 IgG를 측정한 결과, 대조군은 134.9 ± 10.5 pg/㎖로 나타난 반면, 양성 대조군은 99.1 ± 7.8 pg/㎖, ECP군은 120.6 ± 8.4 pg/㎖로 나타나 대조군에 비하여 감소하였다.
실험을 종료한 후 3D micro CT로 후족부를 분석하고 bone volume에 대한 ratio를 산출해 골밀도를 측정한 결과, 대조군은 0.17 ± 0.05 (U^3)로 나타난 반면, 양성 대조군은 0.33±0.04 (U^3), ECP군은 0.31±0.03 (U^3)으로 나타나 대조군에 비해서 유의성 있게 증가하였다.
7-D). 이러한 결과로 볼때 ECP 투여가 관절의 부식, 파괴, 염증을 억제하고 활막세포의 손상을 방지하며 골밀도를 증가시키는 효능이 있다고 추정할 수 있다.
이상의 연구결과를 종합하여 보면, ECP의 足三里 투여가 collagen-induced arthritis mouse에서 항염증 작용을 하여 관절염의 증상을 억제하고 관절을 보강하여 진행을 억제하는 치료효과를 확인하였다. 이는 추후 ECP의 활용가능성을 보여주며, 향후 보다 적극적인 임상 응용을 위한 초석이 될 수 있을 것으로 기대하는 바이다.
2). 이와 같이 류마티스 관절염 증상에 ECP 투여가 호전 반응을 보인 것을 확인하였다.
조직 변화에 미치는 영향을 확인하기 위한 병리조직학적 검사에서 대조군은 면역세포의 침투와 활막세포의 손상, 연골의 침하 및 관절의 부식이 심하게 일어난 반면(Fig. 7- B), ECP 투여군은 그 정도가 상대적으로 적게 나타났다(Fig. 7-D). 이러한 결과로 볼때 ECP 투여가 관절의 부식, 파괴, 염증을 억제하고 활막세포의 손상을 방지하며 골밀도를 증가시키는 효능이 있다고 추정할 수 있다.
또한 ECP 실시로 인해 혈청 내 IgM, IgG의 생성량에 미치는 영향을 확인하였다. 측정 결과 IgM과 IgG 모두 대조군에 비하여 감소를 나타내었으며, 특히 IgM은 유의성 있게 감소하였다(Fig. 3).
혈액 내 단핵구를 측정한 결과, 대조군에서는 0.7 ± 0.1 %로 나타난 반면, 양성 대조군은 0.3 ± 0.1 %, ECP군은 0.4 ± 0.1 %로 나타나 모두 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성 있는 차이는 없었다.
혈액 내의 림프구를 측정한 결과, 대조군은 4.4 ± 0.4 %로 나타난 반면, 양성 대조군은 3.8 ± 0.5 %, ECP군은 3.9 ± 0.6 %로 나타났다.
혈액 내 호중구를 측정한 결과, 대조군은 7.8 ± 3.3 %로 나타난 반면, 양성 대조군은 5.6 ± 2.1 %, ECP군은 7.0 ± 1.8 %로 나타났다.

후속연구

반면 혈청 내 IL-1β, IL-17, TNF-α의 생성량은 ECP군에서 더욱 우수한 효능이 나타났다. 그러므로 류마티스 관절염 치료의 효율을 증가시키고 부작용의 위험을 감소시키기 위해 기존에 사용하는 Indomethacin과 본 藥鍼을 병행 투여하는 가능성을 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
이상의 연구결과를 종합하여 보면, ECP의 足三里 투여가 collagen-induced arthritis mouse에서 항염증 작용을 하여 관절염의 증상을 억제하고 관절을 보강하여 진행을 억제하는 치료효과를 확인하였다. 이는 추후 ECP의 활용가능성을 보여주며, 향후 보다 적극적인 임상 응용을 위한 초석이 될 수 있을 것으로 기대하는 바이다.
현재의 이러한 한계점은 앞으로도 더욱 심도 있는 류마티스 관절염의 기전 연구와 치료법 개발이 꾸준히 필요하다는 점을 시사하며, 한의학적으로도 치료의 새로운 지평을 열 수 있다는 가능성을 제시한다¹⁾. 그러나 고전 문헌에서 류마티스 관절염과 유사한 범주의 질환에 대해서는 임상과 실험적 연구를 토대로 한 기초 자료가 많지 않아⁴¹⁾ 이를 보완하여 한의학적 치료 근거를 마련하기 위한 토대가 필요한 실정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	류마티스 관절염의 유병률은 어느정도인가?	류마티스 관절염 역시 이에 포함되며, 서서히 발병하여 점진적으로 진행하는 가장 흔한 전신적 만성 질환 중 하나이다2). 전 세계적으로 약 1 %에 달하는 유병률을 가지며3,4) 대표적인 증상으로는 주로 대칭성의 근위지절, 중수지절, 중족지절 관절염과 통증, 아침 기상 후의 강직감(morningstiffness), 관절의 움직임 제한과 변형, 파괴 등이 있다. 또한 전신 증상으로 관절 외의 류마티스 결절, 안구건조증, 림프절 병증, 심폐기능 및 신경기능이상 등이 발현하기도 한다5).
	류마티스 관절염의 대표적인 증상으로는 어떤 것들이 있는가?	류마티스 관절염 역시 이에 포함되며, 서서히 발병하여 점진적으로 진행하는 가장 흔한 전신적 만성 질환 중 하나이다2). 전 세계적으로 약 1 %에 달하는 유병률을 가지며3,4) 대표적인 증상으로는 주로 대칭성의 근위지절, 중수지절, 중족지절 관절염과 통증, 아침 기상 후의 강직감(morningstiffness), 관절의 움직임 제한과 변형, 파괴 등이 있다. 또한 전신 증상으로 관절 외의 류마티스 결절, 안구건조증, 림프절 병증, 심폐기능 및 신경기능이상 등이 발현하기도 한다5).
	서양의학에서는 류마티스 관절염의 치료를 어떻게 하고 있는가?	서양의학에서는 아스피린, 비스테로이드성 소염진통제(Non-steroidalanti-inflammatorydrugs, NSAIDs), 부신피질호르몬, 항류마티스제제(Disease Modifying AntiRheumatic Drugs; DMARDs), 항Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)제제, 면역억제제, 세포독성 억제제 등을 류마티스 관절염의 치료에 사용하고 있으며, 최근에는 초기부터 적극적인 DMARDs 처방을 권장하여7) 직접적인 치료를 지향하고 있지만, 여전히 치료 효과에 반응하지 않는 환자의 수가 상당하며 부작용이 발생하는 경우가 많아 안전성이 확보된 치료법 연구가 지속적으로 필요한 실정이다5).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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