Objectives : Ijung-tang (IJT) is a traditional herbal formula and has been used to treat digestive diseases such as abdominal pain, vomiting, and diarrhea. IJT consists of four herbal medicines, Ginseng radix, Atractylodis rhizoma alba, Zingiberis rhizoma, and Glycyrrhizae radix et rhizoma, containi...
Objectives : Ijung-tang (IJT) is a traditional herbal formula and has been used to treat digestive diseases such as abdominal pain, vomiting, and diarrhea. IJT consists of four herbal medicines, Ginseng radix, Atractylodis rhizoma alba, Zingiberis rhizoma, and Glycyrrhizae radix et rhizoma, containing various bioactive compounds. Quality assesment of IJT preparations was performed by analytical method for determining marker compounds.Methods : Determination of seven marker compounds in IJT preparations was quantitatively conducted by high-performance liquid chromatography equipped with a diode-array detector. The marker compounds were separated on a reversed-phase C18 column and the analytical method was successfully validated. Chemometric analysis was performed to compare IJT water extracts and commercial IJT granules.Results : Limit of detection and limit of quantification values were in the ranges of 0.093-2.649 μg/mL and 0.283-8.027 μg/mL, respectively. Precisions were 0.30-3.87% within a day and 0.23-2.35% over three consecutive days. Recoveries of the marker compounds ranged from 87.35-107.05%, with relative standard deviation (RSD) values < 6.15%. Repeatabilities were < 1.20% and < 1.71% of RSD value for retention time and absolute peak area, respectively. The results from quantitative analysis showed that the quantities of seven marker compounds of IJT samples varied, as were found in principal component analysis and hierarchical clustering analysis.Conclusions : The analytical method developed in the present study was precise and reliable to simultaneously determine marker compounds of IJT. Therefore, it can be used for the quality assessment of IJT preparations.
Objectives : Ijung-tang (IJT) is a traditional herbal formula and has been used to treat digestive diseases such as abdominal pain, vomiting, and diarrhea. IJT consists of four herbal medicines, Ginseng radix, Atractylodis rhizoma alba, Zingiberis rhizoma, and Glycyrrhizae radix et rhizoma, containing various bioactive compounds. Quality assesment of IJT preparations was performed by analytical method for determining marker compounds.Methods : Determination of seven marker compounds in IJT preparations was quantitatively conducted by high-performance liquid chromatography equipped with a diode-array detector. The marker compounds were separated on a reversed-phase C18 column and the analytical method was successfully validated. Chemometric analysis was performed to compare IJT water extracts and commercial IJT granules.Results : Limit of detection and limit of quantification values were in the ranges of 0.093-2.649 μg/mL and 0.283-8.027 μg/mL, respectively. Precisions were 0.30-3.87% within a day and 0.23-2.35% over three consecutive days. Recoveries of the marker compounds ranged from 87.35-107.05%, with relative standard deviation (RSD) values < 6.15%. Repeatabilities were < 1.20% and < 1.71% of RSD value for retention time and absolute peak area, respectively. The results from quantitative analysis showed that the quantities of seven marker compounds of IJT samples varied, as were found in principal component analysis and hierarchical clustering analysis.Conclusions : The analytical method developed in the present study was precise and reliable to simultaneously determine marker compounds of IJT. Therefore, it can be used for the quality assessment of IJT preparations.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 현재 유통되고 있는 理中湯 과립제의 품질을 비교해보고자 理中湯의 구성약재인 人蔘, 白朮, 乾薑, 甘草의 지표성분인 ginsenoside Rg1, atractylenolide Ⅲ, 6-gingerol, glycyrrhizic acid, ononin, isoliquiritin, liquiritin 등 총 7종의 성분을 선정하여 HPLC를 이용한 동시 분석법을 확립하고 각 성분의 함량 분석을 시행하였다. 그리고 주성분분석(PCA)과 계층적 군집분석(HCA) 등의 통계 방법을 활용하여 理中湯 전탕액과 理中湯 과립제의 비교분석을 시행하였다.
본 연구는 한약제제에 대한 품질평가를 위해 현재 시중에 유통되는 理中湯 과립제와 理中湯 전탕 추출물을 대상으로 HPLC를 이용한 7개의 표준물질에 대한 동시분석을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
7개의 표준물질에 대한 stock solutions을 6개의 농도로 희석하여 검량선을 만들었다. 7개의 표준물질의 검량선에 대한 직선성은 상관계수(r2)으로 표현되며, 0.
理中湯의 지표성분인 atractylenolide Ⅲ, ginsenoside Rg1, 6-gingerol, glycyrrhizic acid, isoliquiritin, liquiritin 및 ononin에 대한 동시분석을 실시하기 위해 이동상의 기울기 조건과 종류, UV 검출파장을 최적화하여 분석을 진행하였다. 이동상의 종류는 0.
그리고 주성분분석(PCA)과 계층적 군집분석(HCA) 등의 통계 방법을 활용하여 理中湯 전탕액과 理中湯 과립제의 비교분석을 시행하였다.
측정한다. 농도가 측정된 시료에서 첨가한 지표성분의 농도를 구한 후, 다음의 공식을 통하여 계산하였다.
본 연구에서는 理中湯 시판 제제의 품질을 평가하기 위해서 대한민국약전외한약(생약)규격집에서 제시한 지표 성분을 포함하여 理中湯 구성약재의 지표성분인 甘草의 glycyrrhizic acid, ononin, isoliquiritin, liquiritin, 乾薑의 6-gingerol, 人蔘의 ginsenoside Rg1, 白朮의 atractylenolideⅢ 등에 대해 HPLC를 이용한 정량분석을 실시하였고, 각 제제별 지표 성분의 함량 상관성을 평가하기 위해 한약의 품질관리에 널리 사용되고 있는 주성분분석과 계층적군집분석 방법을 이용하였다12). 함량 분석 결과, 理中湯 전탕 추출물과 시중에 유통되고 있는 理中湯 과립제에서 7개의 표준물질에 대한 함량 차이가 크게 나타났다.
진행하였다. 이동상의 종류는 0.5%(v/v) acetic acid가 함유된 water와 0.1%(v/v) TFA가 함유된 water를 비교한 결과, 각 peak 간 분리 능이 높은 0.1%(v/v) TFA가 함유된 water를 이동상으로 결정하였다. 기울기 조건은 0.
RSD, %)를 통해 평가하였다. 일내 정밀성(intraday precision)은 일내에 동일 시료를 3회 이상 반복 측정하여 얻어진 상대표준편차 값으로 표시하였고, 일간 정밀성(inter-day precision)은 동일 시료를 각각 다른 날짜(3일 이상)에 측정한 상대표준편차 값으로 표시하였다.
2) 정밀성(precision) 측정
정밀성(precision)은 지표성분에 대한 3가지 농도(저농도, 중농도, 고농도)를 기준으로 표준용액을 만들고 HPLC로 분석하여, 측정된 농도에 대한 상대표준편차(relative standard deviation, RSD, %)를 통해 평가하였다. 일내 정밀성(intraday precision)은 일내에 동일 시료를 3회 이상 반복 측정하여 얻어진 상대표준편차 값으로 표시하였고, 일간 정밀성(inter-day precision)은 동일 시료를 각각 다른 날짜(3일 이상)에 측정한 상대표준편차 값으로 표시하였다.
1%(v/v) TFA가 함유된 water, acetonitrile을 이용하여 다양한 시험을 거쳐 결정하였다. 지표성분들의 최대흡광파장을 확인하여 ginsenoside Rg1은 205 nm, atractylenolide Ⅲ는 230 nm, glycyrrhizic acid 와 ononine 250 nm, 6-gingerol과 liquiritine 280 nm, isoliquiritine 360 nm 파장에서 각각 피크면적을 측정하였다. 7개의 지표성분들이 주어진 분석조건에서 완전하게 분리되었으며, 검액의 정량분석을 위해 사용되었다.
직선성(linearity) 및 범위(range)는 7종 지표성분의 농도 범위에 대하여 6가지 농도에 대한 피크면적을 토대로 검량 선을 작성하였다. 작성된 검량선은 상관계수(correlation coefficient, r2)를 구하여 직선성을 판단하였다.
피크면적과 머무름 시간에 대한 반복성(repeatability)은 표준용액을 6회 반복 주입하여 면적과 머무름 시간의 반복성을 상대표준 편차(relative standard deviation, RSD, %)를 계산하여 확인하였다.
회수율(recovery)을 통한 정확성(accuracy) 측정은 각각 서로 다른 2가지 농도의 지표성분(저농도, 고농도)을 시료에 첨가하고 분석 조건에 따라 시료를 분석하여 농도를 측정한다. 농도가 측정된 시료에서 첨가한 지표성분의 농도를 구한 후, 다음의 공식을 통하여 계산하였다.
대상 데이터
HPLC 분석을 위해 지표성분인 glycyrrhizic acid, isoliquiritin, ononin(이상 Chem Faces; Wuhan, Hubei, China), liquiritin, atractylenolide Ⅲ(이상 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.; Chengdu, Sichuan, China), 6-gingerol, ginsenoside Rg1(이상 Wako Pure Chemical Industries Ltd.; Chuo-Ku, Osaka, Japan) 등을 구입하여 사용하였고, 각 지표 성분들의 순도는 모두 98% 이상이었다. 각 지표성분의 화학구조는 Figure 1에 나타내었다.
규격품을 구입하였다. 理中湯 과립제는 시중에 유통되고 있는 5개 회사의 혼합단미엑스산제를 사용하였다.
理中湯의 구성 한약재인 人蔘(Ginseng Radix;), 白朮 (Atractylodis Rhizoma Alba), 乾薑(Zingiberis Rhizoma), 甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma) 등은 광명당제약(울산, 대한민국)에서 규격품을 구입하였다. 理中湯 과립제는 시중에 유통되고 있는 5개 회사의 혼합단미엑스산제를 사용하였다.
분석에 사용된 HPLC 시스템은 auto-sampler, degasser, quaternary solvent pump, 및 diode-array detector (DAD) 로구성된 Agilent 1200(Agilent Technologies, CA, USA)이다. 컬럼으로는 CAPCELL PAK C18 column(250×4.
분석에 사용한 HPLC 등급의 acetonitrile과 water는 J.T. Baker Inc(Center Valley, PA, USA)에서 구입하였고, trifluoroacetic acid(TFA)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan)을 사용하였으며, 온도는 35℃를 유지하였다. 시료의 주입량은 10 μL이었고, UV 검출기의 파장은 205, 230, 250, 280, 360 nm로 설정하였다.
데이터처리
작성된 검량선은 상관계수(correlation coefficient, r2)를 구하여 직선성을 판단하였다.
주성분분석(principlal component analysis, PCA)과 계층적 군집분석(hierarchical clustering analysis, HCA) 등은 통계프로그램인 'R (ver. 3.1.1)'을 이용하여 시행되었다.
성능/효과
1.본 연구에서 설정한 분석법은 정밀성(precision), 회수율 (recovery), 반복성(repeatability)을 충족시켰고, 신뢰성 있게 理中湯 전탕 추출물과 理中湯 과립제에 대한 7개의 표준물질의 정량에 적용될 수 있었다.
2.理中湯 전탕 추출물과 理中湯 과립제에서 7개의 표준물질에 대한 함량이 차이가 크게 나타났다.
3.PCA와 HCA를 사용하여 理中湯 전탕 추출물과 理中湯 과립제의 관계를 분석하였으며, 이들 간에 연관성이 높지 않은 것으로 나타났다.
검량선을 만들었다. 7개의 표준물질의 검량선에 대한 직선성은 상관계수(r2)으로 표현되며, 0.9996에서 0.9998의 범위에 있는 것으로 확인되었다.
43배까지 전탕 추출물에서 높게 측정이 되었다. Glycyrrhizic acid도 과립제중에서는 유일하게 IJT03에서 전탕 추출물보다 1.18배 높게 측정되었고, 나머지 과립제에서는 최소 1.24배~최대 4.12배까지 전 탕 추출물에서 높게 나타났다. 6-Gingerol과 atractylenolide Ⅲ은 理中湯 과립제 중 IJT03과 IJT06을 제외하고 LOQ이 하의값이 나왔으며, 특히 IJT05의 6-gingerole 검출되지 않았다.
41배까지 전탕 추출물에서 높게 측정되었다. Isoliquiritine 理中湯 과립제 중 IJT03에서유일하게 전탕 추출물보다 2.28배 높게 측정되었고, IJT 04에 서는 정량한계(LOQ)이하의 값이 측정되었으며, IJT04를 제외한 나머지 과립제에서는 최소 1.01배~3.43배까지 전탕 추출물에서 높게 측정이 되었다. Glycyrrhizic acid도 과립제중에서는 유일하게 IJT03에서 전탕 추출물보다 1.
많은 차이를 보였다. Liquiritine 최소 1.10배~최대 11.02배, ononine 최소 2.30~최대 13.70배, ginsenoside Rg1은 최소 1.26배~최대 18.41배까지 전탕 추출물에서 높게 측정되었다. Isoliquiritine 理中湯 과립제 중 IJT03에서유일하게 전탕 추출물보다 2.
각 표준물질에 대한 일내정밀성과 일간정밀성은 상대표준 편차(RSD, %)값으로 표현되었고, 일내정밀성은 3개의 농도에 대해 4.0% 이하로 측정이 되었으며, 일간정밀성은 3개의 농도에 대해 모두 3.0% 이하로 측정 되었다.
Negative PC1 score의 세 가지 理中湯 시료는 PC2 score에 의해 다시 positive PC2 score (IJT01, IJT03)와 negative PC2 score(IJT06)로 나뉘었다. 그리고 negative PC1 score의 분포에 7가지 지표성분이 영향을 미쳤고, 그 중 ginsenoside Rg1, 6-gingerol, liquiritin이 IJT06의 negative PC2 score에, 나머지 성분들이 IJT01과 IJT03의 positive PC2 score에 영향을 미친 것으로 나타났다.
함량 분석 결과, 理中湯 전탕 추출물과 시중에 유통되고 있는 理中湯 과립제에서 7개의 표준물질에 대한 함량 차이가 크게 나타났다. 대부분의 성분들이 理中湯 전탕 추출물에서 시판 과립제보다 많은 양이 검출되었고, 특히 6-gingerol과 atractylenolide Ⅲ은 대부분의 과립제에서 LOQ 이하로 낮은 함량을 보이거나 검출되지 않은 것으로 보아 전탕 추출물과의 함량 차이가 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한 주성분 분석 결과, 理中湯 시판제제는 모두 근접한 분포를 보인 반면, 理中湯 전탕 추출물은 이들과 상대적으로 떨어져 있는 분포를 보임으로써, 전탕액과 시판 과립제제 간 성분 함량의 연관성이 높지 않은 것으로 나타났다12).
또한, 理中湯 전탕 추출물은 理中湯 과립제와 성분 함량에서 많은 차이를 보였다. Liquiritine 최소 1.
본 연구에서도 7개의 표준물질에 대한 정량분석 결과, 理 中湯 전탕 추출물과 시판되고 있는 理中湯 과립제 사이에 큰 함량 차이가 존재하며, PCA와 HCA를 통해서도 理中湯 전 탕 추출물과 시판 과립제 사이의 연관성이 높지 않다는 결과를 통해 사용된 약재의 기원, 추출 방법의 차이 또는 부형제의 유무 등의 원인에 의해 한약제제의 품질균일성에 변화가 발생할 수 있는 것으로 판단할 수 있다.
주성분분석(principal component analysis) 결과, principal component 1(PC1) score에 의해 IJT01, IJT03, IJT06은 negative PC1 score를 나타낸 반면, IJT02, IJT04, IJT05는 positive PC1 score를 보였다. Negative PC1 score의 세 가지 理中湯 시료는 PC2 score에 의해 다시 positive PC2 score (IJT01, IJT03)와 negative PC2 score(IJT06)로 나뉘었다.
표준물질에 대한 반복성의 평가는 머무름 시간과 절대 피크 면적에 대한 상대표준편차(RSD, %)값으로 평가하며, 모두 2.0% 이하로 측정되었다.
본 연구에서는 理中湯 시판 제제의 품질을 평가하기 위해서 대한민국약전외한약(생약)규격집에서 제시한 지표 성분을 포함하여 理中湯 구성약재의 지표성분인 甘草의 glycyrrhizic acid, ononin, isoliquiritin, liquiritin, 乾薑의 6-gingerol, 人蔘의 ginsenoside Rg1, 白朮의 atractylenolideⅢ 등에 대해 HPLC를 이용한 정량분석을 실시하였고, 각 제제별 지표 성분의 함량 상관성을 평가하기 위해 한약의 품질관리에 널리 사용되고 있는 주성분분석과 계층적군집분석 방법을 이용하였다12). 함량 분석 결과, 理中湯 전탕 추출물과 시중에 유통되고 있는 理中湯 과립제에서 7개의 표준물질에 대한 함량 차이가 크게 나타났다. 대부분의 성분들이 理中湯 전탕 추출물에서 시판 과립제보다 많은 양이 검출되었고, 특히 6-gingerol과 atractylenolide Ⅲ은 대부분의 과립제에서 LOQ 이하로 낮은 함량을 보이거나 검출되지 않은 것으로 보아 전탕 추출물과의 함량 차이가 큰 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
그러므로 理中湯 제제의 품질균일성 향상을 위해 정확한 기원 약재의 사용 전/후 엄격한 검정, 표준화된 제조 공정 등 여러 요소들을 반영한 GMP 제도의 개선이 필요하며, 이와 함께 제형을 변화함에 있어서 성분손실을 줄일 수 있는 기술, 방법들에 대한 연구개발도 해나가야 할 것으로 보인다. 이를 통해 유통단계에서 품질 유지 및 향상으로 한약제제의 품질 균일성을 확보할 수 있을 것으로 사료된다18).
참고문헌 (18)
Ko MG, Jang MK. Hyundae-Sanghanron. Seoul: Haneuimunhwasa. 2000 ; 647-9.
The Bangje-hak textbook committee. Bangjehak. Seoul : Young-Lim Press. 1999 : 232-5.
Seo HY, Han JK, Kim YH. Therapeutic efects of Yijungtang on atopic dermatitis-like skin lesions of NC/Nga mouse induced by mite antigen. J Pediatr Korean Med. 2011 ; 25 : 1-27.
Zhao N, Zhang W, Guo Y, Jia H, Zha Q, Liu Z, Xu S, Lu A. Effects on neuroendocrinoimmune network of Lizhong pill in the reserpine induced rats with spleen deficiency in traditional Chinese medicine. J Ethnopharmacol. 2011 ; 133 : 454-9.
Lee JA, Ha HK, Jung DY, Lee HY, Lee JK, Huang DS, Shin HG. Comparative study of 25 herbal formulas on anti-inflammatory effect. J Korean Obstetrics Gynecol. 2010 ; 23 : 101-11.
Ha JY, Lee J. Experiment on the antitumor and immunomodulatory effects of Gagamijungtang in BALB/c mice. J Physiol & Pathol Korean Med. 1998 ; 12(2) : 73-81.
Park WS. Effects of red Ginseng-ejung-tang and white Ginseng-ejung-tang water extract on hydrogen peroxide production in RAW 264.7 cells. J Physiol & Pathol Korean Med. 2011; 25(1) : 78-83.
Kim TG, Park SM, Kang H, Shim BS, Kim SH, Choi SH, et al. Effect of Baekhasuoyijung-tang on mouse T cell cytokines. J Physiol & Pathol Korean Med. 2008 ; 22(4) : 754-61.
Lee SM, Choi IH. Therapeutic effects of Lizhongtang plus Baidusan extract in rats with allergic rhinitis. J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dematol. 2004 ; 17(2) : 72-80.
Cho SW, Kim EJ, Kim KH, Cho HS, Lee SD, Nam DW, Lee JD, Kim KS. A study on quality evaluation of Ojeok-san extract powders distributed in Korea. The Acupuncture. 2010 ; 27(2) : 105-13.
Qin, K. Wang B, Cai H, Li W, Yao Z, Zhang X, Lu T, Cai B. Simultaneous determination of five marker compounds in Xuanfu daizhe Tang by highperformance liquid chromatography coupled with diode array detection for quality control. Pharmacogn Mag. 2012 ; 8 : 250–5.
Lu J, Wang JS, Kong LY. Anti-inflammatory effects of Huang-lian-jie-du decoction, its two fractions and four typical compounds. J Ethnopharmacol. 2011 ; 134 : 911–8.
Kumooka Y. Hierarchical cluster analysis as a tool for preliminary discrimination of ATR-FT-IR spectra of OPP acrylic and rubber-based adhesives. Forensic Sci Int. 2009 ; 89 : 104–10.
Han K, Kwon DY, Lee SG, Park SK, Kim CS, Kim YK. The present state of korean herbal preparation production and possible improvement plan. Herb Fomular Sci. 2006 ; 14(1) : 30-41.
Baek JH, Kim SM, Ahn JW, Cho CH, Oh MH, Cho JH, Lee MK, Kim HJ. Validation and determination of glycyrrhizic acid as a marker substance in Bu-zhong-yi-qi-tang by HPLC/DAD. YAKHAK HOEJI. 2008 ; 52(1) : 7-11.
Drasar P, Moravcova J. Recent advances in analysis of Chinese medical plants and traditional medicines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004 ; 812(1-2) : 3-21.
Kim EJ, Park HJ, Kim HJ, Kim JH, Ann JY, Lee JH, Kim YK. A monitoring study of marker contents in the Hwangnyeonhaedok-tang Ex preparations on the market. Herb Fomular Sci. 2008 ; 16(1) : 95-107.
Shin HK. Study on the direction of policies to manage and develop herbs and their products. J Korean Med. 2000 ; 20(2) : 14-24.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.