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문제 정의
- 본 연구에서 보리수나무의 부위별 에탄올 추출물의 생리적 기능에 대한 특징을 탐색한 결과, 열매 에탄올 추출물은 주요 유리 아미노산으로 proline과 GABA를 함유하고, 잎 에탄올 추출물은 asparagine과 gallic acid의 함량이 높고 뛰어난 간암 억제 활성을 나타내며, 줄기 에탄올 추출물은 GABA와 catechin의 함량이 높고 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이는 보리수나무를 향후 기능성 식품, 화장품 등의 바이오 소재 자원으로 개발하기 위한 기초자료로 중요한 의미가 있다고 생각한다.
- 세포의 세포막 손상에 따라 세포질 내에 존재하는 효소인 LDH가 유출된다. 이에 대한 억제 효과를 측정함으로써 세포 생존율에 대한 시료의 영향을 평가할 수 있다. LDH leakage 억제 효과를 알아보기 위하여 Lima 등(18)의 방법을 이용하여 LDH assay kit(BioVision, Milpitas, CA USA)을 이용하여 측정하였다.
- 보리수나무는 현재 합천군 일대에서 무농약 유기농으로 재배되고 있으나 체계적인 연구가 전무한 상태이며, 열매와 잎은 식용으로 허가되어 있으나 식품소재로써 활용이 전혀 되지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 보리수나무의 잎, 줄기 및 열매의 부위별 기능성 및 유용성분에 대한 기초 활성을 비교하여 고부가가치 바이오 소재로서의 활용도를 제고하고자 하였다.
제안 방법
- HepG2 및 Chang 세포 생존율에 대한 시료의 영향을 측정하기 위해 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT; Amresco, Solon, OH, USA) assay를 실시하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용 때문에 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 formazan의 흡광도는 대사가 왕성하고 살아있는 세포의 농도를 반영한다.
- 본 연구에 사용된 보리수나무 잎, 줄기, 열매는 보사모영농조합법인(Gyeongnam, Korea)으로부터 제공받아 사용하였다. 건조 상태의 보리수나무 잎, 줄기, 냉동 열매를 분쇄기로 분쇄하여 70% 에탄올(Duksan, Ansan, Korea)로 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 Advantec(No.
- 배양종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan crystal을 용해해 550 nm 파장에서 ELISA reader(SPECTRA max 340PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 보리수나무 잎, 줄기, 열매 에탄올 추출물의 유리 아미노산 함량을 측정하기 위하여 시료 건조 후 PITC(phenylisothiocyanate)로 유도체화하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과 열매에서는 proline(233.
- 보리수나무 잎, 줄기, 열매에 함유된 flavonol 및 phenol 성분 분석에 대한 정확한 보고는 없으나 뜰보리수(28)에 함유된 것으로 알려진 성분을 참고하여 myricetin, kaempferol, gallic acid, (+)-catechin 및 chlorogenic acid의 함량을 각각의 표준용액을 바탕으로 분석하였다. 보리수나무의 각 에탄올 추출물을 LC-MS/MS로 정량 분석한 결과는 Table 4와 같다.
- 이때 사용한 칼럼은 Waters Nova-Pak C18 4 μm(3.9×300mm), 검출기는 UV detector(HP Agilent 1100 HPLC, GMI, Ramsey, MN, USA)를 사용하여 254 nm에서 측정하였고, 이동상은 용매 A와 용매 B(60% CH3CN)를 gradient 법으로 용매 이동속도 1.0 mL/min, 시료 주입량 10 μL, 칼럼 온도 46°C의 조건으로 측정하였다.
- 현재까지 이와 같은 보리수나무과 식물 이외에도 많은 천연식물에서 다양한 암세포주를 이용하여 항암 활성이 보고되고 있으며 식품 소재로 활용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이번 연구에서는 매년 수확량이 많은 보리수나무 부위별로 간암 세포 증식억제 활성을 비교 차원에서 측정하였으며 활성의 차이를 확인하였다. 특히 보리수나무 잎은 본 실험에 사용된 농도 구간에서 암세포에만 특이적으로 높은 활성을 나타내어 항암 및 면역 증진 등의 항노화 식품소재로 활용 가능성의 여지가 있다고 생각한다.
- 표준 곡선은 증류수로 gallic acid 0.1%(w/v)를 제조한 후 최종농도가 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL 용액이 되도록 조제하고 이를 일정량 취하여 위와 같은 방법으로 750 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 인간 유래 정상 간 세포주 Chang cell과 간암 세포주 HepG2 cell은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL, Rockville, MD, USA)과 1% antibiotics(penicillin/streptomycin)를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지(Gibco BRL)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37°C incubator에서 2~3회 계대 배양한 후 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 보리수나무 잎, 줄기, 열매는 보사모영농조합법인(Gyeongnam, Korea)으로부터 제공받아 사용하였다. 건조 상태의 보리수나무 잎, 줄기, 냉동 열매를 분쇄기로 분쇄하여 70% 에탄올(Duksan, Ansan, Korea)로 3회 반복 추출하였다.
- 5~100 mg/mL로 제조하였으며, myricetin, kaempferol, gallic acid, (+)-catechin 및 chlorogenic acid의 혼합용액은 1 mg/mL의 농도를 사용하였다. 시료는 고감도 분석을 위하여 EtOAc, BuOH, 그리고 H2O층으로 분획하여 H2O층은 제거한 후 나머지 두 분획을 합쳐서 2 mg/mL MeOH로 제조하여 분석하였다.
- 각 시료의 유리라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도인 EC50 값으로 나타내었다. 이때 상대 활성의 비교를 위하여 대조군으로 butylated hydroxy toluene(BHT), butylated hydroxy anisole(BHA), 비타민 C를 사용하였다.
- 건조 상태의 보리수나무 잎, 줄기, 냉동 열매를 분쇄기로 분쇄하여 70% 에탄올(Duksan, Ansan, Korea)로 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 Advantec(No. 5A, Tokyo, Japan) 여과지로 여과한 후 감압농축기를 이용하여 농축한 다음 동결 건조하여 분석용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었고 통계적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 그룹 간의 차이를 통계처리한 후 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 라디칼에 대한 소거 활성은 Blois(17)의 방법에 따라 측정하였다. 시료를 각각의 용매에 녹여 농도별로 희석한 희석액 0.
- 페놀성 화합물의 LC-MS/MS 분석은 Agilent Technologies(Palo Alto, CA, USA) model 1200 series HPLC와 Agilent 6410 Triple Quad, tandem mass spectrometry를 이용하였다. ESI 방법으로 이온화하였고, negative selected ion monitoring(SIM) mode를 사용하였다. 이온화 조건으로는 capillary temperature와 voltage가 각각 350°C, 4 kV였으며, nebulizer pressure는 40 psig, nitrogen flow rate는 12 L/min으로 설정하였다.
- 이에 대한 억제 효과를 측정함으로써 세포 생존율에 대한 시료의 영향을 평가할 수 있다. LDH leakage 억제 효과를 알아보기 위하여 Lima 등(18)의 방법을 이용하여 LDH assay kit(BioVision, Milpitas, CA USA)을 이용하여 측정하였다. 배양된 HepG2 cell을 96 well에 2×104cells/well로 분주한 후 CO2 incubator에서 16~24시간 예비 배양한 다음, 농도별로 희석한 시료를 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 보리수나무 잎, 줄기, 열매의 총폴리페놀 함량은 AOAC법(15)에 따라 측정하였다. 70% 에탄올 추출물을 농도별로 희석한 용액 1 mL를 취하여 2%(w/v) Na2CO3 용액 1 mL를 가하여 3분간 방치한 후, 50% Folin-Ciocalteu 시약(Junsei Chemical Co.
- 보리수나무 잎, 줄기, 열매의 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등(16)의 방법에 따라 측정하였다. 시료를 10배 희석한 희석액 0.
- 페놀성 화합물의 LC-MS/MS 분석은 Agilent Technologies(Palo Alto, CA, USA) model 1200 series HPLC와 Agilent 6410 Triple Quad, tandem mass spectrometry를 이용하였다. ESI 방법으로 이온화하였고, negative selected ion monitoring(SIM) mode를 사용하였다.
성능/효과
- 69mg/100 g) 에탄올 추출물보다 유리 아미노산 함량이 높았으며, 열매의 proline, 잎의 asparagine 및 줄기의 GABA가 대표적인 유리 아미노산인 것을 확인하였다. LC-MS/MS를 이용한 주요 페놀 성분 분석에서는 잎 에탄올 추출물에서 gallic acid, 줄기 에탄올 추출물에서 catechin의 함량이 가장 높았으며, HepG2 cell과 Chang cell의 암세포 증식억제 효과를 측정한 결과 잎 에탄올 추출물이 HepG2에 특이적으로 높은 억제 활성이 나타났다. 향후 보리수나무를 국내 우수 자원으로 활용하기 위해서는 추가로 다양한 암세포에 대한 활성 차이, 부위별 활성 물질의 구명 및 작용 기전 등에 대한 계속된 연구가 수행되어야 할 것이다.
- 보리수나무 잎, 줄기, 열매 에탄올 추출물의 유리 아미노산 함량을 측정하기 위하여 시료 건조 후 PITC(phenylisothiocyanate)로 유도체화하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과 열매에서는 proline(233.48 mg/100 g)의 함량이 가장 높았고 그다음으로 GABA, tryptophan, glutamine, alanine의 순이었으며, 잎에서는 asparagine(1,907.57 mg/100 g), GABA, alanine, proline, valine의 순이었고 줄기에서는 GABA(300.17 mg/100 g), proline, asparagine, alanine의 순으로 나타났다. 또한 보리수나무 잎 에탄올 추출물의 총유리 아미노산 함량은 6,179.
- 17 mg/100 g), proline, asparagine, alanine의 순으로 나타났다. 또한 보리수나무 잎 에탄올 추출물의 총유리 아미노산 함량은 6,179.12 mg/100 g으로 열매(378.88 mg/100 g) 및 줄기(1,211.69 mg/100 g) 에탄올 추출물보다 높았다(Table 3).
- 또한 세포 손상 시 배지 내로 유출되는 LDH의 활성을 측정한 결과 Fig.2와 같이 모든 추출물에서 농도에 의존적으로 LDH 유출이 증가하였으며, 1,000 µg/mL의 열매, 잎 및 줄기에서 TritonX-100 처리군 대비 각각 32.2, 48.9 및 49.2%가 유출되어 MTT assay에 의한 세포 생존율에 대한 경향과 일치하는 결과를 얻었다.
- 64 mg/g으로 나타났다. 또한, 보리수나무 각 부위의 라디칼 소거능을 측정한 결과 폴리페놀 함량이 가장 많은 줄기 에탄올 추출물에서 가장 낮은 EC50 값을 나타내어 50%의 라디칼을 소거하는데 필요한 시료 농도가 가장 낮음을 확인하였다(Table 2). 부위별 라디칼 소거능(EC50 값)은 열매(539.
- 보리수나무 각 부위의 총폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, Table 1과 같이 총폴리페놀 함량에는 큰차이가 없었으나 줄기 에탄올 추출물에서 가장 높게 나타났으며(829.62 mg/g), 플라보노이드는 잎, 줄기, 열매 에탄올 추출물의 순으로 각각 28.84, 15.05, 2.64 mg/g으로 나타났다. 또한, 보리수나무 각 부위의 라디칼 소거능을 측정한 결과 폴리페놀 함량이 가장 많은 줄기 에탄올 추출물에서 가장 낮은 EC50 값을 나타내어 50%의 라디칼을 소거하는데 필요한 시료 농도가 가장 낮음을 확인하였다(Table 2).
- 본 연구에서 보리수나무의 부위별 에탄올 추출물의 생리적 기능에 대한 특징을 탐색한 결과, 열매 에탄올 추출물은 주요 유리 아미노산으로 proline과 GABA를 함유하고, 잎 에탄올 추출물은 asparagine과 gallic acid의 함량이 높고 뛰어난 간암 억제 활성을 나타내며, 줄기 에탄올 추출물은 GABA와 catechin의 함량이 높고 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이는 보리수나무를 향후 기능성 식품, 화장품 등의 바이오 소재 자원으로 개발하기 위한 기초자료로 중요한 의미가 있다고 생각한다.
- 열매 에탄올 추출물의 경우 0.1~250µg/mL의 구간에서는 암세포 증식억제가 비교적 낮게 나타났으나, 추출물의 농도가 500, 1,000 µg/mL에서는 각각 42.4 및 76.7%의 억제 효과를 나타내었다.
- 04 µg/mL)이 가장 우수하였다. 유리 아미노산 분석에서는 잎(6,179.12 mg/100 g) 에탄올 추출물이 열매(378.88 mg/100 g)와 줄기(1,211.69mg/100 g) 에탄올 추출물보다 유리 아미노산 함량이 높았으며, 열매의 proline, 잎의 asparagine 및 줄기의 GABA가 대표적인 유리 아미노산인 것을 확인하였다. LC-MS/MS를 이용한 주요 페놀 성분 분석에서는 잎 에탄올 추출물에서 gallic acid, 줄기 에탄올 추출물에서 catechin의 함량이 가장 높았으며, HepG2 cell과 Chang cell의 암세포 증식억제 효과를 측정한 결과 잎 에탄올 추출물이 HepG2에 특이적으로 높은 억제 활성이 나타났다.
- 3). 이러한 결과로 보리수나무 에탄올 추출물의 세포 증식억제 효과가 정상 세포보다 간암 세포에 높은 활성을 나타내며, 특히 잎과 줄기에 더욱 유효한 항암 활성 물질이 존재할 것으로 추정된다. 이와 같은 정상 간세포와 간암 세포주의 증식억제에 대한 유효성 비교는 만병초 잎(31) 등의 다양한 식물 추출물을 이용하여 보고되어 있다.
- 이러한 보리수나무 잎, 줄기 및 열매의 암세포 증식억제 효과가 암세포를 특이적으로 공격하는지를 검토하기 위하여 정상 간세포에 처리하여 세포 증식에 대한 영향을 측정한 후 간암 세포에 대한 독성과 비교 검토한 결과, 잎과 열매 에탄올 추출물의 경우 대조군과 비교하여 유의적인 정상 간세포 생장억제 효과가 나타나지 않았으며, 줄기 에탄올 추출물은 100 µg/mL까지의 농도에서는 유의적인 독성이 나타나지 않았고 1,000 µg/mL에서 58.6%의 세포 손상을 나타냈으나 암세포(93.9%)와 비교하여 손상이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 이처럼 잎과 줄기 에탄올 추출물은 유사한 암세포 증식억제 효과를 보였으며, 열매 에탄올 추출물과 1,000 µg/mL에서 억제능을 비교하면 각각 93.2, 83.9 및 76.7%로 잎, 줄기, 열매의 순으로 억제 효과가 나타났다.
- 보리수나무의 각 에탄올 추출물을 LC-MS/MS로 정량 분석한 결과는 Table 4와 같다. 잎 에탄올 추출물에는 kaempferol이 81.85mg/100 g, gallic acid가 98.95 mg/100 g이 함유되어 있었으며, 줄기 에탄올 추출물의 경우 catechin이 1,575.99 mg/100 g, kaempferol이 43.99 mg/100 g, gallic acid가 9.00mg/100 g의 순으로 확인되었다. 한편 열매 에탄올 추출물에서는 후보 물질 중 myricetin 및 kaempferol만이 미량 검출되었으며 모든 추출물에서 chlorogenic acid는 검출되지 않았다.
- 잎 에탄올 추출물의 경우는 250, 500, 1,000 µg/mL에서 83.5, 92.1 및 93.2%의 억제 효과를, 줄기 에탄올 추출물은 75.6, 75.8 및 83.9%로 농도 의존적으로 유의한 암세포 증식억제 효과가 관찰되었다.
- 00mg/100 g의 순으로 확인되었다. 한편 열매 에탄올 추출물에서는 후보 물질 중 myricetin 및 kaempferol만이 미량 검출되었으며 모든 추출물에서 chlorogenic acid는 검출되지 않았다. Fordham 등(6)은 보리수나무 열매의 lycopene 함량이 15~54 mg/100 g이며, 이는 lycopene의 주요 공급원으로 잘 알려진 토마토(3 mg/100 g)에 비해 월등히 높은 함량을 나타낸다고 보고하였다.
- 항산화 특성을 측정한 결과, 총폴리페놀 함량이 높게 나타난 줄기(829.6 mg/g) 에탄올 추출물에서 DPPH 라디칼 소거능(EC50=54.04 µg/mL)이 가장 우수하였다.
후속연구
- 이번 연구에서는 매년 수확량이 많은 보리수나무 부위별로 간암 세포 증식억제 활성을 비교 차원에서 측정하였으며 활성의 차이를 확인하였다. 특히 보리수나무 잎은 본 실험에 사용된 농도 구간에서 암세포에만 특이적으로 높은 활성을 나타내어 항암 및 면역 증진 등의 항노화 식품소재로 활용 가능성의 여지가 있다고 생각한다.
- 페놀성 화합물은 식물계에 함유된 2차 대사산물로서 다양한 기능을 나타내는 활성 성분으로 잘 알려져 있는데, 항균 활성, 항산화 효과, 항염증 작용, 콜레스테롤 저하 작용, 지방간 억제 작용 및 여러 종양 세포의 성장 및 분화를 저해시키는 효과 등이 다수 보고되어 있다(29,30). 하지만 보리수나무 부위별 유용성분에 대해 최초로 보고하는 본 연구 결과를 바탕으로 보리수나무의 기능성을 밝히고 식품소재로 활용하기 위해서는 부위별 활성 성분 및 지표성분을 좀 더 체계적으로 규명할 필요가 있다.
- LC-MS/MS를 이용한 주요 페놀 성분 분석에서는 잎 에탄올 추출물에서 gallic acid, 줄기 에탄올 추출물에서 catechin의 함량이 가장 높았으며, HepG2 cell과 Chang cell의 암세포 증식억제 효과를 측정한 결과 잎 에탄올 추출물이 HepG2에 특이적으로 높은 억제 활성이 나타났다. 향후 보리수나무를 국내 우수 자원으로 활용하기 위해서는 추가로 다양한 암세포에 대한 활성 차이, 부위별 활성 물질의 구명 및 작용 기전 등에 대한 계속된 연구가 수행되어야 할 것이다.
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